人核型簇蛋白及其载体与应用的制作方法

专利名称：人核型簇蛋白及其载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人簇蛋白在治疗癌症中的应用，尤其涉及一种人核型簇蛋白，以及载有该蛋白或相应基因的载体在癌症治疗和对癌细胞生物学行为研究中的应用。
背景技术：
簇蛋白，Clusterin是一种多功能的蛋白质，在不同的病理、生理过程中 起到重要的作用。由于选择性剪接的结果，Clusterin有两种主要的亚型分泌型 Clusterin (secreted clusterin, sCLU)禾口核型 Clusterin (nuclearclusterin,nCLU)。sCLU 有细胞保护作用，而nCLU却在细胞核中堆积，可导致细胞死亡。sCLU是Clusterin的主要形式，由TRPM-2单拷贝基因表达，定位于8p21_pl2染 色体上，序列全长1651个碱基，共编码449个氨基酸组成的异二聚体硫酸化糖蛋白，两个亚 单位α和β链分子量均为40KDa;nCLU是将Clusterin进行选择性剪接后而得的产物， 无第II外显子(exon)，而由第I外显子和第III外显子相连接而成。与sCLU蛋白相比， nCLU缺少内质网靶引导肽，不分离为α链和β链，而且蛋白序列上也没有经过广泛的糖基 化(glycosylation)。Clusterin几乎在人体所有组织中都有分布，在恶性肿瘤中也同样不 例外。研究表明Clusterin在前列腺癌、肾癌、膀胱癌等泌尿系统肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋 巴瘤和肺癌等均表现出表达上调，而在食管鳞癌组织中则为表达下调。Clusterin可作为 许多恶性肿瘤的预后因子来预测肿瘤患者的预后，在肾细胞癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌中， Clusterin高表达患者的总体生存率低；而在非小细胞肺癌和胰腺癌中，Clusterin表达 阳性的患者却有更长的生存期(Cancer EpidemiolBiomarkers Prev.，200716，1845-51)。 另有研究发现，在一些肿瘤中随着其恶性程度的增高，存在nCLU表达缺失，sCLU表达 反而上升的现象，这表明Clusterin在恶性肿瘤的发生和发展中可能起着重要的作用。 Clusterin与恶性肿瘤关系密切，Clusterin可能在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用 (Oncogene.，2004，23，2298-304)。细胞增殖与细胞周期密切相关。在前列腺癌细胞中，Clusterin高表达可使Gtl/ G1期细胞比例增加，并使细胞周期进展缓慢，DNA合成下降，且细胞增殖缓慢(Oncogene.， 2002，21，4328-34) ；nCLU 可以通过 cyclinBl/细胞周期依赖型激酶 1 (cyclin B1/CDK1) 途径使细胞阻滞在G2/M期，并使细胞凋亡率增加(Cancer Res.，2004，64，6174-82)；而 sCLU的过度表达并不影响细胞的增殖(Cancer Res.，2007，67，10325-33)。也有学者认为， Clusterin可以抑制前列腺正常细胞的增殖(中华实验外科杂志，2001，18，415-417)。迁移和侵袭是肿瘤细胞的恶性表现之一。过度表达sCLU和nCLU均使正常前 列腺上皮细胞活动力降低，而在肿瘤细胞中，只有nCLU过度表达可使活动力下降，进一 步研究发现nCLU是通过结合α肌动蛋白来影响其活动力，nCLU是α肌动蛋白的一种 “分子伴侣”(Cancer Res.，2007，67，10325-33)。研究证明，MT6-MMP (Membrane-type 6 matrixmetalloproteinase)是金属蛋白酶中膜型家族的一员，对于肿瘤细胞的侵袭起到重 要的作用。内源性的sCLU蛋白可以作为MT6-MMP的负性调节因子，对降解细胞基质中有重要的功能(J Biol. Chem.，2003，278，36350-7)。目前，尚没有任何研究证明外源nCLU具有抑制肿瘤细胞增殖，并可使细胞的运动 迁移、侵袭能力明显减弱，从而能对治疗肺癌起到重要作用。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种人核型簇蛋白，在癌症治疗中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种人核型簇蛋白的载体，该载体能将人核型簇蛋 白输送到细胞中。本发明的又一个目的在于提供一种含有人核型簇蛋白表达载体的细胞，用于研究 人簇蛋白对癌细胞生物学行为的作用机制。本发明的再一个目的在于提供一种人核型簇蛋白表达载体，以及含有该载体的细 胞在癌症治疗中的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供的人Clusterin基因为人核型Clusterin基因，人核型Clusterin基 因包括SEQ ID No :1及其简并序列，还包括与SEQ ID No :1及其简并序列具有40%以上同 源性的序列。这些同源序列优先选择与SEQID No :1及其简并序列具有50%以上同源性的 序列，更优先选择的具有60%、70%或80%以上同源性的序列，最优先选择的具有90%以 上同源性的序列。本发明中，优选选择SEQ ID No 1所示的序列，该序列相应的蛋白序列如SEQ ID No 2所示(即人Clusterin序列34-449氨基酸残基)。本发明中，蛋白nCLU包括SEQ ID No 2及其突变蛋白，还包括具有与SEQ ID No 2及其突变蛋白40%以上同源性的序列。这些同源序列优先选择与SEQ ID No :2具有50% 以上同源性的序列，更优先选择的具有60%、70%或80%以上同源性的序列，最优先选择 的具有90%以上同源性的序列。本发明突变蛋白优先采用对nCLU序列进行“保守性”取代。nCLU蛋白的保守性氨 基酸取代可包括一组内的同义氨基酸取代，同组氨基酸内的氨基酸具有足够相似的生理生 化特性，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(Science，1974，185，862-4)。在上 述序列中也可进行氨基酸的插入或/和缺失而不改变其功能，特别是如果这种插入或缺失 只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起 关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失或/和插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围。优先选择的，本发明同义氨基酸对nCLU进行保守性取代的方式。
氨基酸_同义氨基酸_
SerSer, Thr, Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu, His
LeuIle，Phe, Tyr，Met，Val, Leu
ProGly，Ala, Thr，ProThrPro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
AlaGly, Thr，Pro, Ala
ValMet，Tyr, Phe，lie, Leu, Val
GlyAla, Thr，Pro, Ser, Gly
lieMet, Tyr，Phe, Val，Leu，lie
PheTrp，Met, Tyr，lie, Val, Leu，Phe
TyrTrp，Met, Tyr，lie, Val，Leu, Phe
CysSer，Thr，Cys
HisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln，Lys，Gln，Thr，Arg，His,
Gln
Asn
AsnGin, Asp，Ser, Asn
LysGlu，Gln，His，Arg，Lys
AspGlu, Asn，Asp
Asp, Lys，Asn, Gin, His, Arg，
Glu
Glu
Met Phe，lie, Val, Leu，Met _Trp_Trp_更优先选择的，本发明同义氨基酸对nCLU进行保守性取代的方式。
氨基酸_同义氨基酸_
SerSer
ArgArg，Lys，His
LeuIle，Phe，Met, Leu
ProAla, Pro
ThrThrAla Pro，Ala
ValMet, lie, Val
GlyGly
lieMet, Leu，Phe，Val，lie
PheTrp, Met, Tyr, lie, Leu，Phe
TyrTyr，Phe
CysSer, Cys
HisGln，Arg，HisGlnGlu，Gln，His
AsnAsp, Asn
LysArg，LysAspGlu, Asn, Asp
GluGln，Glu
Met Phe，lie, Val，Leu, Met _Irp_Trp_
最优先选择的，本发明同义氨基酸对nCLU进行保守性取代的方式。
氨基酸_同义氨基酸_
SerSer
ArgArg
Leulie，Met, Leu
ProPro
ThrThr
AlaAla
ValVal
GlyGly
lieMet, Leu，Phe，Val, liePheMet, Tyr，lie, Leu, Phe
TyrTyr, Phe
CysSer, Cys HisGln，Arg, His GlnGlu，Gln，His AsnAsp，Asn LysArg，Lys AspGlu，Asn，Asp GluGln，Glu MetPhe, lie, Val，Leu, Met _Trp_Trp_在对本发明nCLU进行取代而获得突变蛋白过程中，进一步优先选择对SEQ ID No 2序列中的核定位序列不予取代的方式进行。这些序列如=Leu-Glu-Glu-Ala-Lys-Lys-L ys-Lys(艮口人 clusterin 序歹Ij 74—81 氛基酸残基)、Arg-Arg-Glu-Leu-Asp-Glu-Ser-Leu-Gln-Val-Ala-Glu-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys (即人 clusterin 序列 324-340 氨基酸残基)和 Arg-Lys-Lys-His-Arg (即人 clusterin 序列 442-446 氨基酸残基)。本发明所述的人簇蛋白包括nCLU蛋白，优先选择人核型簇蛋白34-449，即SEQ ID No 2所示的序列。
为具备蛋白质、多肽或核酸等大分子输送知识的本领域的普通技术人员所公知， 各种载体，如但不仅限于，脂质体、聚合物和表达载体等，都可以作为人簇蛋白及其核酸的 输送载体而送入细胞内。本发明中，人簇蛋白纳米粒也属于本发明的范围。—种本发明提供的人核型簇蛋白真核表达载体包括多克隆位点、人Clusterin 基因、标记基因、终止信号PolyA基因、启动子(promoter)，还包括内部核糖体插入位点 (internal ribosome entry site, IRES)基因、复制起点(Ori)基因和增强子(enhancer)。具体的，本发明提供的人簇蛋白真核表达载体含有ColEl复制起点、取自于SV40 的PolyA信号、合成内含子、氨苄青霉素抗性基因、潮霉素磷酸化酶基因、人巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV)启动子、衍生自脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, ECMV)的 IRES 和人 Clusterin 基因。另一种本发明提供的人簇蛋白真核表达载体，由pIREShyg3载体和人Clusterin 基因组成，即在pIREShyg3载体上插入人Clusterin基因。该基因与载体的连接采用BamH I和Not I双酶切方式进行。本发明中，各种nCLU蛋白可以根据其氨基酸序列得到相应的人核型Clusterin基 因序列及其简并序列。本领域普通技术人员可以通过筛选具有抑制癌细胞增殖的、减弱细 胞运动迁移能力或明显减弱侵袭能力的nCLU蛋白，推知相应的人核型Clusterin基因序列 及其简并序列，从而选择适合特定癌症细胞的载体进行蛋白或基因的输送。 本发明提供的含有人Clusterin基因的真核表达载体，转染非小细胞肺癌A549细 胞后，得到稳定克隆A549-nCLU细胞能表达人nCLU蛋白。这些A549-nCLU细胞与对照组相比生长缓慢，流式细胞仪分析细胞周期，显示转 染了核型Clusterin基因的细胞GcZG1期比例增多，而S期比例减少，使得细胞增殖受到抑 制。表达的nCLU蛋白能与细胞质中的α肌动蛋白相结合，使Α549细胞的迁移力明显 减弱。A549-nCLU穿过人工膜的数量显著减少，侵袭力减弱了 47. 3% (P < 0. 05)，且差异具 有统计学意义，表明核型Clusterin基因的转入能减弱A549细胞的侵袭能力。nCLU在非小细胞肺癌A549细胞中属于表达上调的蛋白。核型Clusterin上调表 达对在该肿瘤细胞具有明显的抑制增殖、减弱细胞运动迁移和侵袭能力的作用。本领域技 术人员可以得知，在nCLU同样表现出表达上调的其它癌症，如前列腺癌、肾癌、膀胱癌等 泌尿系统肿瘤、乳腺癌、胰腺癌和淋巴瘤，本发明真核表达载体也能具有明显抑制肿瘤细胞 增殖，并且也可使细胞的运动迁移、侵袭能力明显减弱的作用。本领域技术人员根据特定癌 组织或细胞选择其它真核表达载体作为输送人核型Clusterin基因的载体以更有利于在 相应组织和细胞中表达亦属于本发明的范围。本发明提供的含有人Clusterin基因的真核表达载体能用于癌症治疗，尤其是 nCLU表达上调的癌症的治疗当中。本发明提供的含有人Clusterin基因的真核表达载体更 适合用于非小细胞肺癌的治疗当中。此外，该载体及其含有该载体的细胞，还能应用于人簇 蛋白对癌细胞生物学行为的作用机制研究当中。本发明技术方案实现的有益效果本发明提供了一种人核型簇蛋白及其载体，所述载体中含有人核型Clusterin基 因或人核型簇蛋白。转染有人核型Clusterin基因表达载体的非小细胞肺癌A549细胞的增殖受到明显抑制，且细胞运动迁移和侵袭能力亦明显减弱，表明人核型簇蛋白及其该表 达载体能用于癌症的治疗。本发明转染有人簇蛋白表达载体的细胞，能用于研究人簇蛋白对癌细胞生物学行 为的作用机制。本发明所述的术语与其一般概念相同。所述的“突变蛋白”指将人核型簇蛋白序列上的一个或多个氨基酸残基进行替换、 增加或/和缺失后得到的同源蛋白。其中天然人核型簇蛋白的一个或多个氨基酸残基被不 同氨基酸残基所替换，或缺失，或者人核型簇蛋白的天然序列中加入了一个或多个氨基酸 残基，但所产生的同源蛋白的活性与天然人核型簇蛋白相比无显著降低，甚至有提高。这些 突变蛋白的活性可用各种筛选技术与以实现，如丙氨酸扫描(Alanine Scan)进行点突变 和组合化学等，这些突变蛋白可用已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其它已 知技术制备。本发明人核型簇蛋白优先选择nCLU，更优选SEQ ID No :2所示的序列。所述的“同源性”是反应两个或多个蛋白/多肽序列或两个或多个核苷酸序列之 间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同源性指所比较的序列长度上两个多核苷酸或 两个蛋白/多肽序列，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样 的。对于那些与所述人核型Clusterin基因或人核型簇蛋白对应不是完全一样的序 列，需要通过“同源性百分比”进行确定。通常把待比较的两个序列进行对比，得出这两个序 列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“空格”以增加对比度。比 较每一个序列的整个长度，或者比较它们的较短的限定长度，可确定同源性百分比，前者特 别适合长度相等或长度差不多的序列，或者更适合长度不相等的序列。对于本领域技术人员而言，两个或多个序列同源性的比较方法已为他们所熟知， 例如BLAST和FASTA程序。本发明中，所述的40 %、50 %、60 %、70 %、80 %和90 %均为同 源性百分比。所述的“非小细胞肺癌”是nCLU上调表达的癌症，也包括nCLU上调表达的其它癌 症，如但不仅限于，前列腺癌、肾癌、膀胱癌等泌尿系统肿瘤、乳腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。所述的“癌症治疗”，包括基因治疗，可治疗或改善癌症及其所引起的紊乱和病 症。基因治疗是将目标DNA、含目标DNA的载体以及含目标DNA的表达载体转导、转化或输 送(gene delivery)到细胞中，从而依据目标DNA表达出相应蛋白(Crit. Rev. Biotech., 1992，12，335-56)或使目标DNA与细胞中DNA/RNA互补结合以阻止蛋白的表达的各种方法。 基因治疗包括将DNA序列导入体细胞或种系细胞以用于体外(exvivo)或体内(in vivo) 治疗。本发明目标DNA是所表达的nCLU蛋白具有抑制癌细胞增殖的、减弱细胞运动迁移 能力或明显减弱侵袭能力的一段核苷酸序列。为了能与表达载体连接而在细胞中表达，该 核苷酸序列中还可以包括被核苷酸酶识别并酶切的序列，这些核酸酶如但不仅限于，BamH I、Not I, Nco I和Nsi I。这些用于酶切的序列通常设于核苷酸序列的两端。用于基因治疗的方法包括物理方式(如电击穿孔、直接基因转导/转化和)、化 学方式(如脂质载体或非病毒载体)和生物学方式(如病毒衍生载体和受体摄取)。可 以使用的非病毒载体，如但不仅限于，含有目标DNA的脂质体、含有目标表达载体的脂质体，以及共价或非共价结合有目标DNA的聚合物，如聚赖氨酸、聚乙二胺和dendrimer等。 这类携带有DNA的脂质体或聚合物可直接静脉注射到患者体内。此外，目标DNA或含有目 标DNA的载体可直接输送到病变器官、组织或肿瘤中，或对目标DNA或含有目标DNA的载体 进行修饰后，如但不仅限于，在脂质体表面连接RGD识别分子，再输送到病变器官、组织或 肿瘤中，以实现目标DNA的靶向输送。体内基因输送涉及在细胞位于患者体内时将目标DNA导入患者细胞。方法包括使 用病毒介导的基因转移，其中使用非感染性病毒将目标DNA输送到患者体内，或注射到患 者体内某部位并由一定百分比的细胞摄取，在该细胞中表达目标DNA相应的蛋白质。此外， 使用物理的或化学的方式，也可以将目标DNA输送到体内。化学方法包括化学物质结合细胞或/和运送DNA穿过细胞膜，如但不仅限于，月旨 质体、促融合脂质囊泡、脂转染试剂或多聚赖氨酸携带的DNA输送。受体吞噬作用涉及使用 特定配体细胞表面受体并将它包裹和转运穿过细胞膜。配体结合目标DNA，而进入细胞。病毒载体也可用于将目标DNA导入体内细胞(Goodman & Gi Iman，sThe Pharmacological Basis ofTheraputics，1996，77-101)。为了指导外来基因的组织特异性 表达，可使用已知具有组织特异性的顺式作用调控原件或启动子。


图1为pGEM-CLU PCR产物电泳图；其中泳道1为分子量标记(Marker) DL2000 (Takara公司)，泳道2为全长的Clusterin基因；图2为全长Clusterin片段及核型Clusterin片段电泳图；其中泳道1为分子 量标记(Marker)DL2000 (Takara公司)，泳道2为全长的Clusterin基因，泳道3为核型 Clusterin 基因；图3为pIRES-full及pIREShyg3酶切电泳图；其中泳道1为分子量标记(Marker) DL2000 (Takara公司)，泳道2为含全长Clusterin基因的真核表达质粒，泳道3为 pIREShyg3 空载体；图4为PCR、pIRES-nCLU酶切及三个真核表达质粒(pIREShyg3、pIRES-full和 pIRES-nCLU)电泳图；其中泳道1为分子量标记(Marker) DL2000 (Takara公司)，泳道2和 泳道3为pIRES-nCLU经PCR后的电泳，泳道4和泳道5为pIRES-nCLU酶切后的电泳图，泳 道6为pIREShyg3质粒电泳图，泳道7为pIRES-full质粒电泳图，泳道8为pIRES-nCLU质 粒电泳图；图 5 为 A549、A549-hyg 和 A549-nCLU 三种细胞 Western blot 结果；图中，数字 49，000、40，000和36，000表示分子量标记；图6为A549、A549-hyg和A549_nCLU三种细胞生长曲线图；图7为A549、A549_hyg和A549_nCLU三种细胞迁移能力图；图8为A549、A549_hyg和A549_nCLU三种细胞侵袭能力图。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书(J.萨 姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是 本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。 此外，根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒(Kit)所附带的操作手册 的指导下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如基因测序、质粒测序和确定分子量寸。本发明实施例中，人非小细胞肺癌A549细胞由复旦大学附属肿瘤医院中心实验 室提供；pIREShyg3真核表达质粒购自Clontech公司；LipofectamineTM2000转染试剂和 潮霉素B为Invitrogen公司产品；鼠抗人Anti-Clusterin单克隆抗体(clone 41D)购自 Upstate Biochemicals 公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒为 Dojindo Molecular Technologies Inc公司产品；Transwell小室(孔径8um)和Matrigel胶购自BD公司。本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛一奥德里奇 (Sigma-Aldrich)公司。本发明实施例所涉及的统计学方法，均应用SPSS 16. O统计软件分析，数据用均 数士标准差表示，多组数据比较采用单因素方差分析。实施例1 nCLU真核表达载体的构建用引物对5'-GACTCCAGAATTGGAGGCATG-3 和 5‘ -ATCTCACTCCTCCCGGTGCT-3 ‘， 从肝癌SMMC7721cDNA文库中用PCR方法扩增出人全长的Clusterin_cDNA，将 Clusterin-cDNA连接到pGEM-T Easy载体(Promega公司，技术手册TM042)中，得到质粒 pGEM-CLU。再以pGEM-CLU 为模板用引物对5 ‘ -GGCGGCCGCGGGGATCCGAT-3 ‘禾口 5 ‘ -GACCTGCAGGCGGCCGCGAAT-3 ‘扩增出全长 Clusterin 基因 Cluster in-full (见 图1)，并将其连接到pIREShyg3真核表达质粒的BamHI和Not I酶切位点中，得到质粒 pIRES-full。再以pIRES-full 质粒为模板，用引物对5' -GTCTCAGACAATGGGATCCAGGA-3‘禾口 5' -GACCTGCAGGCGGCCGCGAAT-3‘经 PCR 扩增出核型 Clusterin 基因 Clusterin-in(见图 2)，将Clusterin-in基因连接到pIREShyg3质粒的BamH I和Not I酶切位点中，得到核型 Clusterin 真核表达载体 pIRES-nCLU。通过PCR、双酶切和DNA测序等对目的质粒进行鉴定。进行限制性内切酶酶切鉴 定，结果见图3和图4。从图可以看出，质粒被BamH I和Not I酶切后分离出两条带，与插 入的PCR片段和空载体酶切片段大小一致。将鉴定正确的质粒送上海英骏公司测序，将测 序结果与Clusterin基因序列比对，结果证实插入的基因序列确实为正确的基因序列，且 阅读框正确。实施例2重组Clusterin蛋白的表达检测质粒转染及细胞筛选用Lipofectamine 2000 Reagent 将空载体 pIREShyg3 及重组质粒 pIRES-nCLU 转 染A549细胞。按120ug/ml浓度加入潮霉素B进行筛选。经3_4周持续筛选后，得到稳定转染了 pIREShyg3空载体和pIRES-nCLU重组质粒的A549细胞系。稳定转染了 pIREShyg3 空载体的A549细胞命名为A549-hyg ；稳定转染了 pIRES-nCLU重组质粒的A549细胞命名 为 A549-nCLU。Western blot 检测 Clusterin 蛋白的表达用冰PBS (pH7. 4)洗细胞3次，加入细胞裂解液，于冰上裂解细胞30分钟，测定蛋 白浓度。取70μ g蛋白做10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至聚偏二氟 乙烯(PVDF)膜上，含5%脱脂奶粉的TBST封闭2小时，1 500的Clone 41D单克隆抗体 4°C孵育过夜，和羊抗鼠IgGl 1000孵育2小时，ECL显色，X胶片曝光，显影定影记录条带 (见图5)。结果显示A549-nCLU细胞在相当于pnCLU蛋白的49_50kDa处表达显著，而作为 对照的A549和A549-hyg，两者的细胞裂解物中均无核型Clusterin蛋白的表达。由于全长 的sCLU在经二硫键裂解后成为α和β链，两条链均为40kDa，而sCLU在肺癌细胞中是高 表达的，可以看出三种细胞均在40kDa处有差不多相同的sCLU表达。实施例3细胞形态与增殖CCK8检测细胞增殖情况按2000个/孔的浓度将处于对数期的细胞接种至96孔板，每组设6个复孔，待细 胞贴壁后，于24、48、72、96、120小时后加入10 μ 1CCK-8溶液，5% CO2 37°C恒温培养箱孵育 3小时；用自动酶标仪在450nm波长处，测定各孔的OD值。最后取各样本的平均值并绘制 生长曲线(见图6)。图6中，转染了 pIREShyg3空载体的A549细胞和未转染的A549细胞，两者外观上 并无明显区别，生长状态良好，分裂旺盛，生长曲线并无明显差异(各时间点p>0. 05)。而 转染了 pIRES-nCLU质粒的A549细胞的形态与前两者相比具有明显不同，培养过程中细胞 容易漂起，许多细胞中出现空泡，培养液中有大量细胞碎片，生长缓慢，生长曲线与前两者 相比有明显不同(各时间点P < 0.05)。这表明，高表达核型Clusterin蛋白可明显抑制 A549细胞的生长。实施例4细胞周期分布的检测流式细胞术检测细胞周期细胞首先在无血清培养基的条件下培养48小时，加入 正常培养液继续培养24小时，消化收集细胞，95%乙醇冰上固定1小时，PBS洗涤细胞2次 并重悬于 300-500 μ 1 的 PBS 中(其中含 20ug/ml RNaseA,0. 2% Triton X_100、0. 2mM EDTA 和20μ g/mlPropidium Iodide)，并将其置于37°C的水浴中温浴15-30分钟，流式细胞仪 (BD公司)检测细胞的DNA含量，并以仪器中的Modfit程序进行人工校正。 转染了核型Clusterin的A549细胞较转染了 pIREShyg3空载体的A549细胞相比， GcZG1期细胞比例增多了约 29%，分别为(63. 31 士4. 30) %和(33. 54士 2. 10) %，而 A549_hyg 和ASAgGcZG1期相比并无明显差异，分别为(33. 67士0. 77) %和(33. 54士2. 10)%。这表明， 核型Clusterin基因转染后细胞生长受到明显抑制，大量细胞阻滞在GtlAi1期，使得细胞生 长缓慢。实施例5 核型Clusterin对A549细胞迁移和侵袭的影响体外迁移能力的测定按lX105/ml的浓度将处于对数期的细胞用无血清1640培养基制成细胞悬液，取IOOul加入Transwell上室(1 X IO4个细胞)，下室加入600ul含10%胎牛血清的1640培养基；5% C023 7°C恒温培养箱培养12小时后，取出Transwell上室，用棉拭子擦除小室上层 的细胞后HE染色。于400倍光镜下，随机选取5个视野计数细胞，取平均值作为细胞体外 趋化性迁移能力的强弱，结果见图7。体外侵袭能力的测定按1 6的比例混合Matrigel和无血清1640培养基制备成人工基底膜；于上室 加入50ul的混合液，37°C孵育4小时以使其凝固；按lX106/ml的浓度将处于对数期的三 种细胞用无血清1640培养基制成细胞悬液，于上室中加入IOOul的细胞悬液(IX IO5个细 胞)，下室加入600ul含10%胎牛血清的1640培养基，常规培养48小时。取出Transwell 上室，用棉拭子擦除小室上层的细胞后HE染色。于400倍光镜下，随机选取5个视野计数 细胞，取平均值作为细胞体外趋化性迁移能力的强弱，结果见图8。图7中，转染了核型Clusterin后的A549_nCLU迁移较A549和A549_hyg有明显 减弱，减少了 68. 5% (P<0. 05)，具有统计学差异(P < 0. 05)，说明上调核型Clusterin的 表达可以显著降低A549细胞自身的运动能力。图8中，与对照组相比，A549-nCLU穿过人工膜的数量显著减少，侵袭力减弱了 47. 3% (P<0. 05)，差异具有统计学意义，说明核型Clusterin基因的转入能减弱A549细 胞的侵袭能力。序列表<110> 李鹤成<120>人核型簇蛋白及其载体与应用<130>BLH. HF. 9001<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>SEQ ID No 1<211>1251<212>DNA<213> 人核型 Clusterin 基因<400>1atgtccaatc agggaagtaa gtacgtcaat aaggaaattc aaaatgctgt caacggggtg 60aaacagataa agactctcat agaaaaaaca aacgaagagc gcaagacact gctcagcaac 120ctagaagaag ccaagaagaa gaaagaggat gccctaaatg agaccaggga atcagagaca 180aagctgaagg agctcccagg agtgtgcaat gagaccatga tggccctctg ggaagagtgt 240aagccctgcc tgaaacagac ctgcatgaag ttctacgcac gcgtctgcag aagtggctca 300ggcctggttg gccgccagct tgaggagttc ctgaaccaga gctcgccctt ctacttctgg 360atgaatggtg accgcatcga ctccctgctg gagaacgacc ggcagcagac gcacatgctg 420gatgtcatgc aggaccactt cagccgcgcg tccagcatca tagacgagct cttccaggac 480aggttcttca cccgggagcc ccaggatacc taccactacc tgcccttcag cctgccccac 540cggaggcctc acttcttctt tcccaagtcc cgcatcgtcc gcagcttgat gcccttctct 600ccgtacgagc ccctgaactt ccacgccatg ttccagccct tccttgagat gatacacgag 660
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190195200
Leu Asn Phe His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met lie His Glu Ala205210215220Gln Gln Ala Met Asp lie His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro225230235Thr Glu Phe lie Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu lie240245250255Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys Cys260265270Arg Glu lie Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln Ala Lys275280285Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg Leu Thr Arg290295300305Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met Leu Asn Thr Ser310315320Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala325330335340Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu Arg Val Thr Thr Val Ala345350355Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser Gly Val Thr Glu Val Val Val360365370Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro lie Thr Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser375380385 390Arg Lys Asn Pro Lys Phe Met Glu Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu395400405Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu Glu41041权利要求
一种包括nCLU蛋白的人核型簇蛋白，在癌症治疗中的应用。
2.一种人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于包括多克隆位点、人Clusterin基因、 标记基因、启动子和终止信号polyA基因。
3.根据权利要求2所述的人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于所述真核表达载体 还包括复制起点基因和内部核糖体插入位点基因。
4.一种人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于包括ColEl复制起点、取自于SV40的 PolyA信号、合成内含子、氨苄青霉素抗性基因、潮霉素磷酸化酶基因、人巨细胞病毒启动 子、衍生自脑心肌炎病毒的内部核糖体插入位点和人Clusterin基因。
5.一种人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于由pIREShyg3载体和人Clusterin基 因组成。
6.根据权利要求2-5之一所述的人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于所述的人 Clusterin基因为SEQ ID No 1及其简并序列。
7.根据权利要求2-5之一所述的所述的人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于所述 的人Clusterin基因与所述SEQ ID No :1及其简并序列具有40%、50%、60%、70%、80% 或90%以上同源性的序列。
8.根据权利要求7所述的人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于与所述的SEQID No 1及其简并序列相应的蛋白为nCLU。
9.根据权利要求8所述的人核型簇蛋白真核表达载体，其特征在于所述的nCLU包括 SEQ ID No 2及其突变蛋白。
10.一种含有权利要求2-7之一所述的人核型簇蛋白真核表达载体的细胞，在人簇蛋 白对癌细胞生物学行为作用机制研究中的应用。
11.一种权利要求2-7之一所述的人核型簇蛋白真核表达载体，在癌症治疗中的应用。
全文摘要
一种包括nCLU蛋白的人核型簇蛋白。该簇蛋白的真核表达载体包括多克隆位点、复制起点基因、人Clusterin基因、启动子、标记基因和终止信号polyA等基因。将表达载体转染癌症细胞后，能使细胞增殖受到抑制，且细胞运动迁移和侵袭能力亦明显减弱，这表明人核型簇蛋白及其表达载体能用于癌症的治疗。
文档编号C12N5/10GK101816779SQ20101002303
公开日2010年9月1日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者李鹤成 申请人:李鹤成