专利名称：以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法
技术领域：
本发明涉及以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法。将人工合成的、按照植物所偏爱的密码子优化后的水蛭素基因及蛋白酶切割识别信号与油体蛋白基因进行体外拼接，然后通过转基因途径以融合蛋白的方式在大豆中表达并定位在大豆油体的表面，从大豆种子中分离出油体及融合改造后的油体蛋白并经蛋白酶进行特异性切割可释放出有活性的重组水蛭素蛋白。
水蛭素是吸血水蛭(俗称蚂蟥)唾液或身体中所含有的一类抗凝血多肽，分子量比较小，约为7000Da，属于酸性蛋白(等电点pI＝3.9)[1]，它们可与凝血酶蛋白分子形成1∶1非共价结合的复合物并成为迄今为止已知的最有效的凝血酶蛋白抑制剂。上个世纪80年代，三种天然水蛭素(HV1、HV2和HV3)的氨基酸序列相继得到报道[2，3，4]，这三个水蛭素各含有65-66个氨基酸残基，相互之间具有85％以上的序列同源性。在这些水蛭素蛋白分子N端的保守区内(1-47残基之间)含有6个半胱氨酸残基，在这些半胱氨酸残基之间形成的二硫键使N端成为一个紧凑的、非极性的结构域，它可与凝血酶的催化位点结合；水蛭素的C端(49-66残基之间)可通过大量的静电和亲水作用与凝血酶的血纤蛋白原识别位点结合，这两个结构域共同作用可有效地抑制凝血酶所有主要的生物学活性[5]。
水蛭素具有重大的药用价值，这不仅是因为它能够非常特异性地作用于凝血酶，而且它还具有许多特性使它比现在使用许多抗凝血因子如肝素更为优越。每个水蛭头部大约含有20ug水蛭素[6]，因此，从水蛭中提取天然的水蛭素蛋白的量很有限，完全不能够满足人们的需求。具有生物活性的重组水蛭素异构体蛋白基因已经被克隆并在大肠杆菌[3，4]、酵母[7，8]、多角体病毒侵染的昆虫细胞[9]和链霉菌(Streptomyces lividans)成功表达[10]，这些表达系统生产的重组水蛭素从几毫克到几十毫克不等，纯化程度可达99％以上。
油体是一些植物种子中储存三酰甘油(triacylglycerols，TAG)的亚细胞器官，呈球形，在其内部储藏有液态的TAG，外部则是由磷脂单分子层(PL)及嵌入其内的油体蛋白(oleosin)组成的半单位膜所包裹。在所有产油种子内如大豆、油菜和花生都含有大量油体及油体蛋白[11]。
油体蛋白分子结构比较独特，中部是一个疏水的氨基酸长链，比已知的其它蛋白都要长，具有很强的疏水性，因此这部分氨基酸序列可稳固地嵌入到油体脂质膜内。疏水的核心骨架两侧是亲水的N端和C端，通常游离在油体脂质膜的外侧，这些亲水部分在不同植物中氨基酸序列和长度上是不同的。
油体蛋白独特的分子结构和生化特性使其适于应用在重组外源蛋白的生产中，首先，油体蛋白在产油种子内含量很高，例如在大豆中，估计油体蛋白约占到种子总蛋白的2％-10％左右，该含量与同一植物种子储藏蛋白的积累水平相当[12]。其次，当种子研磨后用缓冲液提取时，油体及油体蛋白会浮在水面上，经过反复离心洗涤很容易洗去其它蛋白成份而将油体蛋白浓缩到一个很高的地步[12，13]，油体蛋白通过这种方式很容易与种子储藏蛋白和其它蛋白成份分离开来，如果将其它外源蛋白与油体蛋白的N端或C端融合表达时可能遵守同样的分离原则，这就为重组外源蛋白的下游加工带来极大的方便。
尽管大豆是一种双子叶植物，但正如本领域专家所熟知的那样，大豆的遗传转化是非常困难的，国内外迄今只有抗除草剂等极少数种类转基因大豆获得成功，因此，在本发明之前，还没有人通过转基因的方式，利用大豆油体生产其他外源重组蛋白、尤其是水蛭素蛋白，也没有人根据大豆所偏爱的密码子对水蛭素基因进行修饰和改造，以便最大程度地提高该外源蛋白在植物中的表达效率。
本发明利用油体蛋白的分子结构特点、在种子内的高表达特性以及易于分离和纯化的特点在转基因大豆中生产出具有活性的重组水蛭素蛋白。按照一个优先的实施方案，本发明涉及对水蛭素1蛋白基因(HV1)按照大豆所偏爱的密码子进行修饰和改造，以便改造后的基因能够更高效地在大豆种子中进行表达。
本发明提供了以油体蛋白作载体、以融合蛋白的方式生产重组水蛭素的方法，按照一个优先的实施方案，水蛭素基因与油体蛋白基因的N端或C端编码序列进行体外拼接，但这种拼接并不会改变彼此的阅读框架，也不会影响融合后的油体蛋白在大豆油体上的定位。通过抽提大豆油体，很容易将重组水蛭素与其他大豆种子蛋白分离开来，由此可简化提纯过程和大大降低生产成本。
按照一个实施方案，本发明涉及自融合蛋白状态下释放出有活性重组水蛭素的的方法，因为在油体蛋白与水蛭素编码序列之间含有蛋白酶特异性切割识别信号，经蛋白酶消化处理，有活性的重组外源蛋白被释放出来。按照一个优先的实施方案，这种识别信号能够被肠肽酶或Xa因子所识别，在从大豆种子中分离出大豆油体及油体蛋白(融合蛋白)后，利用肠肽酶或Xa因子处理该融合蛋白便可以将重组水蛭素释放出来，成为有活性的蛋白多肽。
对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体或DNA片段的构建，它们在获得本发明所指的转基因大豆以及有活性重组水蛭素的过程中起重要作用。按照一个优先的实施方案，用于转化大豆的质粒载体或DNA片段由编码油体蛋白-蛋白酶切割识别信号-水蛭素基因的DNA序列和操纵该DNA序列在大豆中表达的一个植物启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择或标记基因，主要用于转基因大豆的筛选。在某些具体实施方案中，本发明所使用的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子或油体蛋白基因的启动子。本发明提供的质粒载体或DNA片段可用于基因枪法转化大豆。
本发明也提供了获得转基因大豆细胞的方法，它包括以下步骤1.水蛭素基因的密码子优化；2.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码油体蛋白-蛋白酶切割识别信号-水蛭素的融合蛋白基因，而且该基因被置于一个植物启动子的操纵之下；3.用质粒载体或上述DNA片段转化大豆细胞。按照一个优先的实施方案，还包括从转化的大豆细胞再生出完整的转基因大豆的方法。
本发明提供了大豆的各种遗传转化方法。尽管在下面描述的某些优先实施方案中仅利用了特定的转化方法，但显而易见的是，本领域专家所早已熟知的其它植物转化方法也应包括在本发明的权利要求范围之内，这些方法包括微管注射、PEG融合和电融合法。按照某些优先实施方案，使用的是农杆菌介导的转化方法，特别指Ti质粒参与的农杆菌转化系统。在其它一些优先实施方案中，还可以使用基因枪法转化大豆细胞或植株。
为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考
图1细菌质粒载体pGEMHV1的构建过程。
图2大豆油体蛋白基因的克隆及细菌质粒载体pGEMO的构建过程。
图3植物表达载体pBI0H的构建过程。其中GUS代表β-Glucuronidase(葡糖醛酸酶)基因；融合蛋白基因代表大豆油体蛋白基因-肠肽酶切割识别信号-水蛭素1拼接完成后所形成的融合蛋白基因。
图4质粒pBIOH的T-DNA中所含的2个结构基因及其调控表达序列。其中Nos-Pro代表胭脂碱合成酶启动子；npt-II代表新霉素磷酸转移酶基因；Nos-Ter代表胭脂碱合成酶终止子；35S Pro代表花椰菜花叶病毒35S启动子；RB代表DNA右边界序列；LB代表DNA左边界序列。
图5PCR检测油体蛋白-水蛭素融合蛋白基因在不同转基因大豆株系中的整合情况。其中1为λDNA/EcoRI+HindIII Marker，2为阳性对照扩增结果，以pBIOH质粒DNA为模板，3为以非转基因大豆DNA为模板的阴性对照扩增产物，4-8为不同转基因大豆株系的扩增产物。
图6不同株系转基因大豆叶片中油体蛋白-水蛭素融合蛋白基因mRNA的Northern杂交结果。1为非转基因大豆，2-6为转基因大豆植株。
图7经大豆油体抽提、肠肽酶切割和硫酸铵沉淀后纯化出的重组HV1的SDS-PAGE分析。其中1为标准分子量蛋白(Amersham Biosciences)；2为非转基因大豆种子总可溶性蛋白提取物；3为转基因大豆种子总可溶性蛋白提取物；4为经大豆种子油体抽提、肠肽酶切割和硫酸铵沉淀后获得的部分纯化的重组HV1。
图8通过凝血酶抑制显色定量分析检测大豆重组水蛭素的活性。其中1为工作缓冲液中加入2ul空白缓冲液(阴性对照)；2为工作缓冲液中加入2ul大豆重组水蛭素；3为工作缓冲液中加入了2ul天然水蛭素(阳性对照)；4为工作缓冲液中加入了2ul肠肽酶(阴性对照)。
本发明包括以下几个组成部分1.按照植物所偏爱的密码子，对水蛭素基因进行修饰和改造，改造后的基因在大豆中将更稳定和更高效地表达；2利用DNA重组技木构建质粒表达载体，它含有编码油体蛋白-蛋白酶切割识别信号-水蛭素基因的DNA序列和操纵该DNA序列在大豆中表达的一个植物启动子组成。3.对大豆进行遗传转化，使编码上述融合蛋白的基因稳定地整合入大豆染色体中并可遗传给后代；4.从转化的大豆细胞中再生出完整的转基因植株，而且该植株能够稳定、高效地产生油体蛋白与水蛭素所构成的融合蛋白；5.重组水蛭素的分离和纯化，其特征在于从所述的转基因大豆成熟的种子中提取出油体、加入蛋白酶进行消化以便水蛭素从油体中释放出来，然后使用硫酸铵沉淀和冷冻干燥，最后获得有活性的重组水蛭素蛋白。
1.水蛭素基因的修饰和改造尽管水蛭和大豆都属于真核生物，但它们在基因密码子偏好方面仍然存在着一定的差异，这种差异会导致外源基因在大豆细胞内不够稳定，另外基因的转录和翻译效率都会受到一定的影响。
完整的水蛭素基因被人工合成，在合成基因的过程中，保留原来的氨基酸序列不变但密码子改为大豆所偏爱的密码子[14]。改造后的水蛭素基因在植物中将更稳定和更高效地表达；2.大豆转化方法有许多种方法可以将外源基因导入到大豆中，其中将外源基因稳定整合入大豆染色体基因组DNA的主要方法包括1)农杆菌介导法；2)DNA直接摄入法，包括PEG介导的原生质融合法、电激法、微管注射法以及使用基因枪将DNA直接送入植物细胞和组织等。
农杆菌介导法是利用质粒载体将特定的DNA片段整合入植物染色体基因组DNA。最常用的方法是叶盘法，它适用于任何易于再生成完整植株的植物外植体。农杆菌转化方法特别适用于双子叶植物包括大豆的转化。
正如上面已提到的各种DNA直接摄入转化方法，电激法是先将原生质体置于放在一个强电场中，在电流作用下将外源DNA送入原生质体内。微管注射法是用微管将DNA直接注射入细胞中。基因枪法是将DNA先吸附在硫酸镁或钨粒上，这些颗粒被加速射入植物细胞或组织中。
按照本发明的一个优先实施方案，农杆菌Ti质粒系统被选用。农杆菌的Ti质粒中含有一段叫做转移DNA(T-DNA)的，它可以进入大豆细胞中并最后整合入大豆的染色体中。转移载体的构建分为两步，首先是构建一个可以在大肠杆菌中复制的质粒，这个质粒含有编码油体蛋白-蛋白酶切割识别信号-水蛭素基因的DNA序列和操纵该DNA序列在大豆中表达的一个植物启动子组成，该DNA序列的两端含有T-DNA边界序列，它负责目的基因在大豆基因组中的插入位点。通常另外一个选择标志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右边界序列中，该基因在大豆细胞中表达后可提供一个选择标记证实大豆或大豆细胞是否含有整合的T-DNA序列。载体构建的第二步是将质粒从大肠杆菌转移到农杆菌中。这可以通过三亲交配的方式或DNA直接导入方式完成。为了T-DNA的转移，所用的农杆菌菌株中还要含有一套诱导基因，它们在T-DNA转移到大豆细胞中起重要作用。
熟悉大豆遗传转化的人应该知道转化用的农杆菌菌株可以有多种选择，质粒构建也有多种方式，其目的都是为了更有利于大豆的遗传转化。大豆的转化最常用的是植物叶盘转化法，在某些情况下，还需要加入一些辅助细胞。其他的转化方法包括原生质体转化，继而由原生质体再生出大豆细胞及完整植株。
本发明不仅仅限于使用农杆菌Ti质粒转化系统，还应包括其它物理性的手段将外源基因直接导入大豆细胞或原生质体的方法以及其它将外源基因导入大豆细胞的方法。
3.基因表达启动子在转化方法确定之后，一个组成型的、发育调节型的或组织特异型的表达启动子被选择以便外源基因能够在大豆中表达。
所有已知能操纵外源基因在植物细胞中转录的启动子都可以在应用在本发明中。这些启动子可从植物或病毒中获得，如花椰菜花叶病毒35S启动子(包括经过拼接、加倍和突变改造后的35S启动子)；油体蛋白基因启动子；光诱导基因启动子如核糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)或逆境诱导基因如乙醇脱氢酶(Adhl)等，但不仅限于此。
用于大豆转化的质粒通常含有一个选择标志基因。许多有此功能的基因已被开发出来。
下面以农杆菌介导的大豆遗传转化方法为例，描述一个优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。
实施例11.水蛭素基因(HV1)的人工合成迄今为止，尚没有人正式报道自水蛭中克隆出编码水蛭素1(HV1)基因的核苷酸序列，为此，我们只能根据业已公布的HV1的氨基酸序列[15]，在不改变该蛋白氨基酸序列的情况下，按照大豆所偏爱的密码子[14]，人工设计和合成了水蛭素1的全基因序列(见序列表1和2)。为了便于今后质粒载体的构建、融合蛋白基因的拼接和表达及重组水蛭素的释放，在人工合成水蛭素1基因编码序列的同时，在该基因的5’端还同时合成和增加了肠肽酶切割识别位点(见序列表3和4)以及限制性酶切位点KpnI，在HV1基因的3’端中止密码子后增加了限制性酶切位点SacI(上述基因拼接和合成工作由上海博亚生物技术公司代为完成)。
2.HV1基因的克隆上述人工合成的基因片段被直接插入到pGEM-T质粒中的T位点内(Promega公司产品)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有该基因的细菌克隆pGEMHV1(见图1)，然后，通过核苷酸序列分析，确定HV1基因及肠肽酶切割识别信号是正确和完整的(DNA测序由上海博亚生物技术公司代为完成)。
3.大豆油体蛋白基因的克隆根据已公布的大豆油体蛋白基因序列(见GenBanK，U09118)，合成了一对特定的引物，其中上游引物(5’端引物)序列为5’-AATCTAGATCAACCATGACCACACAAGTAC-3’，它内部含有XbaI切割位点，下游引物(3’端引物)为5’-TGCGGTACCGGTTGTTGCTGTCACTGTTGT-3’，它内部含有KpnI切割位点。根据王关林等[16]人的方法，从大豆种子(品种为Century，由中国农业科学院作物科学研究所邱丽鹃研究员提供)提取出其基因组DNA，以此DNA为模板，通过PCR的方法[大豆基因组DNA1ul(约含1ug)作为模版，5’端引物和3’端引物各1ul，10XPCR缓冲液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul约1.5U，加水至总体积30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分钟，共进行35个循环]。扩增获得一段长度约700bp的扩增产物。该产物被直接插入到到pGEM-T质粒中的T位点内(Promega公司产品)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有该基因的细菌克隆pGEMO(见图2)，然后，通过核苷酸序列分析，确定的大豆油体蛋白基因是正确和完整的(见序列表5和6)(DNA测序由上海博亚生物技术公司代为完成)。
实施例21.油体蛋白-水蛭素融合蛋白植物表达载体pBIOH的构建为了构建高效植物表达载体，在人工合成HV1基因时，在其5’端添加了限制性酶切位点KpnI和肠肽酶切割识别信号，在其3’端添加了限制性酶切位点SacI。在克隆大豆油体蛋白基因时，在其5’端添加了限制性酶切位点XbaI，在其3’端添加了限制性酶切位点KpnI。因此含有上述两个基因的质粒载体pGEMHV1和pGEMO分别用KpnI+SacI以及XbaI+KpnI双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳，分离出两个小片段的DNA，尔后这两个基因片段被直接定向插入到质粒pBI121的原GUS基因位点内(经XbaI和SacI双酶切)，便构建成了双元植物表达载体pBIOH。
质粒pBI121购自美国Clonetech公司，它的XbaI限制性酶切位点位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间，而SacI则位于GUS基因终止序列和NOS终止子之间。选用质粒pBI121是因为用XbaI和SacI双酶切后可将GUS基因删除，而随后可插入另外一个新的外源蛋白基因，新基因将能够在植物细胞内高效表达。质粒pBI121还含有新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织与未转化的植物细胞或组织区分开来。nptII基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们均源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
质粒pBIOH含有1)新霉素合成酶基因II(nptII)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)大豆油体蛋白基因-肠肽酶切割识别信号-水蛭素1基因(融合蛋白基因)及操纵该基因的花椰菜花叶病毒35S启动子；3)T-DNA左右边界序列，它可将nptII基因和上述融合蛋白基因转移到植物体内并整合到大豆的染色体中。pBIOH的结构如图3和图4所示。
2.将表达载体pBIOH导入农杆菌(A.tumefaciens)
按照Clonetech公司所提供的方法，含有融合蛋白基因的质粒pBIOH被通过三亲交配的方式转移到农杆菌LBA4404菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司。菌株LBA4404现已被广泛应用，它是改造后的农杆菌菌株，含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒pBIOH向植物细胞内的转移。
农杆菌在含有25mg/L链霉素的50ml YEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl 5克，加蒸馏水至1升，pH7.0)培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pBIOH的DH5α(购自美国GIBCO公司)和含有辅助质粒pRK2013(购自美国Clonetech公司)的HB101(购自美国Clonetech公司)分别接种在含有50mg/L卡那霉素50ml LB培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞分别悬浮在1ml不含任何抗生素的LB培养基中待用。取上述三种细胞悬浮液各200ul，置于同一1.5ml离心管中，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10ul，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有pBIOH质粒的农杆菌菌落开始产生。
用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pBIOH质粒DNA是否存在。
实施例31.大豆的遗传转化大豆(Glycine max L.)栽培品种中豆28号购自中国农业科学院作物科学研究所。按照Horsch等人的方法[17]，利用叶盘法转化大豆。含有表达载体pBIOH的农杆菌菌株LBA4404接种在50ml YEP中，28℃培养2天，4000g离心5分钟，收集菌体，然后重新悬浮在液体的MS培养基中至OD600nm＝0.4，用手术刀片将发芽5-6天后大豆无菌子叶自相连处切开，随即浸入稀释后的农杆菌液中30分钟，然后取出，用滤纸吸干，叶面朝上置于MS固体培养基上，28℃避光培养4天。然后将叶片移置新鲜的选择培养基上[MS基础成分中添加植物激素(Sigma公司)6-BA2mg/L和IBA0.2mg/L，并含有50ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素]培养，给予25℃和16小时光照。以后每隔2个星期更换一次选择性培养基直到叶柄伤口处长出愈伤并分化出幼苗。当幼苗出现并长到足够大时，将幼苗切下来(通常在共培养后4-8个星期)，移到生根培养基上(MS含有0.2mg/mlIBA和50ug/ml卡那霉素)，当根长出后，幼苗被移到无菌的营养土中生长并辅之以适当的温度和光照条件。
2.PCR检测融合蛋白基因在大豆中的整合情况大豆基因组DNA的提取方法基本依据Chee的方法[18]。取0.5g大豆转基因植株新鲜叶片，放入研钵中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml离心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/Lβ-巯基乙醇，10g/L CTAB)，剧烈振荡1分钟，使之充分混匀。在60℃水浴中温浴90分钟，期间每30分钟振荡一次。从水浴中取出离心管，室温下放置4-5分钟，使之冷却，然后加入4.5ml氯仿，轻轻摇动，使之充分混匀。室温下5000g离心10分钟。收集上清液于另一20ml离心管中，加入4.5ml氯仿，重复上述步骤。收集上清液，加入10ml冰冷的异丙醇，轻摇10-15分钟，5000g离心5分钟，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，将DNA浓度调至1ug/ul。
取上述大豆基因组DNA1ul(约含1ug)作为模版，加入大豆油体蛋白基因5’端引物和水蛭素基因3’端引物(见实施例1)各1ul，10XPCR缓冲液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul约1.5U，加水至总体积30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分钟，共进行35个循环。反应结束后，取5ul扩增样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图5所示，阴性对照植物中(泳道3)没有发现特异性的条带，而在转基因大豆植株中则可扩增出1个约900bp的特异性条带(泳道4-8)，与预期的结果相一致，该结果表明大豆油体蛋白-肠肽酶切割识别信号-水蛭素1融合蛋白基因已整合进入大豆基因组DNA中。
3.转基因大豆的RNA分析利用地高辛标记的水蛭素基因DNA片段做探针(标记方法见Roche公司试剂盒)，对pBIOH植物表达载体转化后的部分卡那霉素抗性大豆植株RNA进行了杂交分析。
转基因大豆植株的叶片总RNA被提取，方法见参考文献[19]。大约1.0g叶片在液氮中用研钵磨成粉末，加入10ml RNA提取缓冲液(0.2M Tris-HCl，pH6.8；0.2M NaCl；20mM EDTA；2％SDS)，随即加入10ml饱和酚缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA饱和)进行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g离心，收集上层水相，加入0.3M醋酸钾(pH5.2)缓冲液和2.5倍体积的无水乙醇，10000g离心收集沉淀，风干后，沉淀重新悬浮在2ml的水中，随后加入2ml 6M的醋酸铵缓冲液和10ml无水乙醇，10000g离心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新悬浮在0.4ml水中，RAN浓度可通过测定260nm的吸光值进行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25单位。
取10ug RNA样品，约5ul，与2倍体积RNA样品缓冲液(10ml去离子甲酰胺，3.5ml 37％甲醛，2ml 5X MOPS)混合后，65℃加热5分钟，冷却后，加入3ulRNA加样缓冲液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚蓝)，然后经过1％的RNA琼脂糖凝胶电泳。核酸通过毛吸管法转移到尼龙膜(Hybond N+)上，所用的缓冲液为20XSSC，pH7.2(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)，转移时间为16小时。核酸通过紫外线照射后被交连在尼龙膜上，将膜置于预杂交液中[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，100ug/ml鲑鱼精DNA]，68℃预杂交3小时，然后更换新的杂交液[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，1％的封闭剂(BM试剂盒中提供)]，5ml杂交液中加入变性的地高辛标记的DNA探针60ng进行杂交，探针长225bp，它是来自质粒pGEMHV1的KpnI和SacI的双酶切小片段，包括了水蛭素基因的全部编码序列。在杂交液中68℃杂交24小时后，取出杂交膜，于200ml 2XSSC，0.1％SDS缓冲液中室温下洗膜2次，然后于100ml0.1XSSC，0.1％SDS缓冲液中68℃洗膜2次。显色反应基本依据试剂盒中提供的方法(Roche)，尼龙膜先于洗脱缓冲液
中平衡5分钟，然后用50ml 1X封闭缓冲液封闭30分钟，加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体至浓度为75mU/ml，室温下反应30分钟，用洗脱缓冲液2次，每次15分钟。将膜移置20ml显色缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)中平衡5分钟，更换新的底物缓冲液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml显色缓冲液)，遮光条件下显色16小时，待所期望的条带出现后，用水终止反应。
经质粒pBIOH转化后获得的转基因植株和阴性对照植株的RNA杂交结果如图示6。不同转基因植株的RNA杂交信号有差异，这可能是由于基因的插入位点和基因的拷贝数不同引起的。和标准RNA分子量相比，转录的mRNA约有900bp长，与预先估计的相一致。阴性对照植物的RNA泳道中没有观察到杂交信号。mRNA的稳定、大量表达并能够与编码水蛭素1蛋白的DNA核酸探针特异性杂交的结果表明，mRNA的稳定性不会成为水蛭素1基因在大豆中表达的一个问题。
实施例41.大豆油体的分离提取取转基因大豆种子1g，在研钵中充分研磨，将研磨后的细粉全部转移至50ml离心管中，然后往离心管中加入0.5M蔗糖溶液(用0.1M Tris-HCl含10mMKCl，1mM MgCl2，pH7.5配制)30ml，在室温下充分振荡后，5000rpm离心15分钟。匀浆液离心后分成三部分，液面上层主要是油体和与之相联的蛋白，液体部分含有可溶性的种子蛋白，沉淀是不溶性的蛋白和一些颗粒状物质。收集上部含油体的部分，为了除去油体表面残留的松散结合的可溶性蛋白，油体被重新悬浮在较低密度的蔗糖提取液中(0.3M蔗糖中含有0.5M NaCl)，离心后，洗涤后的油体重新漂浮在抽提液的表面，这一过程可反复进行2-3次，直到油体部分所含的蛋白完全是融合蛋白，油体最后悬浮在5ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)含2.5mM CaCl2的缓冲液中。
2.重组水蛭素的释放往上述缓冲液中加入20ng肠肽酶(购自New England Biolabs公司)进行融合蛋白的消化。在室温下消化过夜，离心除去油体和与之相联的蛋白，收集含有重组水蛭素的液体部分，加入3g固体硫酸铵至饱和度约80％，室温下搅拌1小时，10000rpm离心15分钟，收集沉淀，加入1ml 10mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液进行悬浮，然后装入透析袋中在4℃下透析过夜，透析缓冲液为2升10mMTris-HCl(pH7.5)。透析完成后从透析袋中吸出透析物，经冷冻干燥后，重新溶解在1ml10mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，蛋白含量约为300ug/ml左右。然后从中取出10ul进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后检测种子总蛋白提取物和纯化后的蛋白提取物，通过比较发现，95％以上的杂蛋白成份被除去(见图7)。
3.重组水蛭素活性的测定重组水蛭素活性的测定采用凝血酶抑制显色定量分析法[20]，实验所用的凝血酶(Thrombin)购自Sigma公司，将其溶解于工作缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH8.0，含100mM/L NaCl和5mM/L CaCl2)至终浓度为0.12-0.14u/ml待用。每200ul上述工作缓冲液中加入2ul上述纯化后的重组水蛭素(浓度为1ug/ml)或对照缓冲液[阳性对照所使用的天然水蛭素购自Sigma公司，货号H7380，溶于10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)至工作浓度为1ug/ml]，25℃下孵育10分钟，然后加入1ul底物缓冲液[产色底物p-tosyl-gly-pro-arg-notroanilide购自Sigma公司，将其溶于蒸馏水中配制成50pM/L的底物缓冲液]，检测2分钟之内405nm光吸收值的变化。结果发现源自大豆的重组水蛭素可以抑制凝血酶的活性，使其活性降低至少达94％以上，其比活性比阳性对照还要高。加入2ul空白缓冲液的阴性对照(10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5)中未表现出任何抑制活性，另外，加入2ul肠肽酶[溶于10mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)，工作浓度为1ug/ml]的阴性对照中也未表现出任何活性(见图8)。
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本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求以及为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。
序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法<160>6<210>1<211>225<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(226)<400>1ggt acc gat gat gat gat aag gtc gtc tac aca gat tgc aca gag tcc ggg cag aac 57Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn1 5 10 15ctc tgc ctc tgc gaa ggg tcc aac gtc tgc ggg cag ggg aac aag tgc atc ctc ggg 114Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly20 25 30 35tcc gat ggg gag aag aac cag tgc gtc aca ggg gag ggg aca cca aag cca cag tcc 171Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser40 45 50 55cac aac gat ggg gat ttc gag gag atc cca gag gag tac ctc cag tag gag ctc 225His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln ***60 65 70<210>2<211>72<212>PRT<213>人工序列<400>2Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser1 5 10 15Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly20 25 30
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr35 40 45Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu50 55 60Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln65 70<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(15)<400>3gat gat gat gat aagAsp Asp Asp Asp Lys<210>4<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肠肽酶切割识别序列<400>4Asp Asp Asp Asp Lys<210>5<211>681<212>DNA<213>大豆(Glycine max L.)油体蛋白基因<220>
<221>CDS<222>(1)...(678)
<400>5atg acc aca caa gta cca cca cac agt gtc caa gtc cac aca aca aca aca cac cgc 57Met Thr Thr Gln Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr Thr His Arg1 5 10 15tac gaa gct ggc gtc gtc ccc ccc gga gcc cgt ttc gaa acg agt tat gaa gca ggc 114Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Gly Ala Arg Phe Glu Thr Ser Tyr Glu Ala Gly20 25 30 35gtc aag gcg gcc tcc att tac cat tcc gag aga ggt cca acg act tcc cag gtc ctc 171Val Lys Ala Ala Ser Ile Tyr His Ser Glu Arg Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu40 45 50 55gcc gtc ctc gcc ggc ctc ccg gtc ggt ggc atc ctg ctc ctc ctg gca gga ttg acc 228Ala Val Leu Ala Gly Leu Pro Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr60 65 70 75ctg gca gga acc ctc acc gga ctg gca gtt gcc acg ccg ctc ttc gtc ctc ttc agc 285Leu Ala Gly Thr Leu Thr Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Leu Phe Ser80 85 90 95ccg gtg ctg gtt cca gcc acg gtc gcc atc ggc ctg gcc gtg gcc ggg ttc ctg acg 342Pro Val Leu Val Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu Thr100 105 110tcg ggg gcc ttc ggg ctc acg gcg ctg tct tcc ttc tcc tgg atc ctg aac tac atc 399Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp Ile Leu Asn Tyr Ile115 120 125 130cgg gag acc cag cca gcc tcg gag aac ctc gcc gcc gcc gcg aag cat cac ctc gcc 456Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Lys His His Leu Ala135 140 145 150gag gcg gcg gag tac gtg ggg cag aag acg aag gaa gtg ggg cag aag acc aag gag 513Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu155 160 165 170gtt ggg cag gat att cag agc aag gca cag gat aca agg gag gca gct gca agg gat 570Val Gly Gln Asp Ile Gln Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp175 180 185 190gca agg gag gca gct gca agg gat gca agg gaa gct gct gca agg gat gca aag gtg 625Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Lys Val195 200 205gag gca agg gat gta aag aga aca aca gtg aca gca aca acc gca acc gca tga 681Glu Ala Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala *210 215 220 225<210>6<211>226<212>PRT<213>大豆(Glycine max L.)油体蛋白
<400>6Met Thr Thr Gln Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr1 5 10 15Thr His Arg Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Gly Ala Arg Phe Glu20 25 30Thr Ser Tyr Glu Ala Gly Val Lys Ala Ala Ser Ile Tyr His Ser Glu35 40 45Arg Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Pro50 55 60Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Leu Phe Ser Pro85 90 95Val Leu Val Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe100 105 110Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp115 120 125Ile Leu Asn Tyr Ile Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala130 135 140Ala Ala Ala Lys His His Leu Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln145 150 155 160Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Asp Ile165 170 175Gln Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg180 185 190Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Lys195 200 205Val Glu Ala Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala210 215 220Thr Ala22权利要求
1.一种利用油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法。
2.如权利要求1中的方法，其中所说的油体蛋白在与水蛭素形成融合蛋白后，并不会影响该油体蛋白在大豆油体上的定位。
3.如权利要求1中的方法，其中所说的油体蛋白与水蛭素之间含有可以被其他蛋白酶切割的识别位点，如可以被肠肽酶或Xa因子切割的识别位点。
4.一个用于转化大豆的质粒载体包括一段结构为编码油体蛋白-蛋白酶切割识别位点-水蛭素的DNA序列或者结构为编码水蛭素-蛋白酶切割识别位点-油体蛋白的DNA序列。一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，例如35S启动子或大豆油体蛋白基因启动子，该启动子操纵所说的DNA序列可以在大豆中表达。
5.如权利要求4中的质粒载体，它含有一个选择或标记基因。
6.一段用于基因枪法转化大豆的DNA序列包括一段结构为编码油体蛋白-蛋白酶切割识别位点-水蛭素的DNA序列或者结构为编码水蛭素-蛋白酶切割识别位点-油体蛋白的DNA序列。一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，例如35S启动子或大豆油体蛋白基因启动子，该启动子操纵所说的DNA序列可以在大豆中表达。
7.如权利要求6中的DNA序列，它含有一个选择或标记基因。
8.一种获得转基因大豆细胞的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有一段结构为编码油体蛋白-蛋白酶切割识别位点-水蛭素的DNA序列或者结构为编码水蛭素-蛋白酶切割识别位点-油体蛋白的DNA序列。一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，例如35S启动子或大豆油体蛋白基因启动子，该启动子操纵所说的DNA序列可以在大豆中表达。用该质粒载体或该DNA序列转化大豆细胞。
9.如权利要求8中的方法，它包括从转基因大豆细胞中再生出完整的转基因大豆植株。
10.如权利要求8中的方法，其中所说的大豆细胞是通过农杆菌系统转化的，而该农杆菌中含有Ti质粒的双元载体系统，其中所说的质粒载体是一个整合性载体。
11.重组水蛭素的分离和纯化，其特征在于从所述的转基因大豆成熟的种子中提取出油体、加入蛋白酶进行消化以便水蛭素从油体中释放出来，然后使用硫酸铵沉淀和冷冻干燥，最后获得有活性的重组水蛭素蛋白。
全文摘要
本发明涉及以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法。将人工合成的、按照植物所偏爱的密码子优化后的水蛭素基因及蛋白酶切割识别信号与油体蛋白基因进行体外拼接，然后通过转基因途径以融合蛋白的方式在大豆中表达并定位在大豆油体的表面，从大豆种子中分离出油体及融合改造后的油体蛋白并经蛋白酶进行特异性切割可释放出有活性的重组水蛭素蛋白。
文档编号C12P21/02GK1928096SQ20051009831
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月8日 优先权日2005年9月8日
发明者刘德虎, 徐妙云, 李刚强, 魏昭荣 申请人:中国农业科学院生物技术研究所