专利名称：趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化的制作方法
技术领域：
本发明涉及在酸性pH和/或存在强螯合剂的情况下，与其亲本酶相比具有改进的稳定性的α-淀粉酶的变体。此外，本发明涉及编码所述变体的核酸、产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。
背景技术：
α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。α -淀粉酶在几个已知应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化(例如在高果糖糖浆的制备中或者作为从淀粉产生乙醇的一部分)中的工业使用具有悠久的历史。α -淀粉酶的这些以及其它应用是已知的，并且利用源自微生物的α -淀粉酶，特别是细菌α -淀粉酶。最先使用的细菌α -淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也称作Termamyl，其已经得到广泛表征并且已经确定了这个酶的晶体结构。碱性淀粉酶，如AA560(SEQ ID NO: 2)，其披露于WO 00/60060中，形成了特殊的α-淀粉酶组，其已经用于洗涤剂中。已经对很多这些已知的细菌淀粉酶进行了修饰，从而改善它们在特定应用中的功能。Termamyl和很多高效α -淀粉酶的活性都需要I丐。在Termamyl的晶体结构中，发现在α-淀粉酶结构中有四个钙原子通过带负电的氨基酸残基配位结合。对于钙的需要在存在强螯合化合物的应用中是不足之处，如在洗涤剂中或从全谷物产生乙醇的过程中，其中使用α-淀粉酶水解包含大量天然螯合剂如肌醇六磷酸(盐)的植物材料。已知对钙不敏感的淀粉酶，例如，EP 1022334和WO 03/083054中披露的α -淀粉酶，和具有UNIPROT:Q03657中所披露序列的环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans) α -淀粉酶，但是在多种应用中进行淀粉水解和淀粉去除时，这些淀粉酶不及对钙敏感的淀粉酶。因此，提供与其亲本酶相比钙敏感性降低的钙敏感α -淀粉酶的变体是有益的。
发明内容
本发明涉及亲本Termamyl-样α -淀粉酶的分离的变体，其在对应于SEQID NO: 2的氨基酸1-485中的位置163、188、205、208和209的两个、三个、四个或五个位置包含改变，其中所述改变独立地为(i)紧邻所述位置下游的氨基酸的插入， (ii)占据所述位置的氨基酸的缺失，和/或(iii)占据所述位置的氨基酸的取代，和其中所述变体具有α -淀粉酶活性。
本发明的变体进一步包含一个或多个其它取代。此外，所述分离的变体可以包含已知可改善α-淀粉酶性能的其他改变，包括对应于氨基酸183和184的缺失和在位置186、193、195、202、206、214、244、452、474和475中一个或多个位置的取代，并且每个位置对应于具有SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。本发明的变体与亲本α -淀粉酶相比，钙敏感性降低。本发明还涉及编码变体α -淀粉酶或具有α -淀粉酶活性的多肽的分离的核苷酸序列，和包含所述核苷酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞。还提供用于制备本发明的变体的方法。本发明还涉及包含本发明的变体的组合物，特别是洗涤剂添加剂组合物、洗涤剂 组合物、用于手动或自动洗涤餐具的组合物或用于手动或自动洗涤衣物的组合物。此外，本发明涉及根据本发明的α -淀粉酶变体用于洗涤和/或餐具洗涤、织物退浆和淀粉液化的用途。本发明还涉及使用本发明的变体产生乙醇或其它化学品的方法。发明详述定义α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一组酶组成,其催化淀粉和其它直链和支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。cDNA :术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。编码序列术语“编码序列”意指直接指定多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。调控序列(control sequence):术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。表达术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。片段术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α -淀粉酶活性。宿主细胞术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。改进的pH稳定性术语“改进的pH稳定性”在本文中定义为在特定pH温育一段时间后显示酶活性保留的变体酶，所述pH可降低亲本酶的酶活性。改进的pH稳定性还可以产生在这种pH条件下能更好地催化反应的变体。分离的变体术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。举例而言，变体如通过SDS-PAGE测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。成熟多肽术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生两种或更多种由相同多核苷酸表达的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/ 或N端氨基酸)的混合物。核酸构建体术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。可操作地连接术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。亲本酶本文使用的术语“亲本” α -淀粉酶指对其进行修饰，例如，取代，插入，缺失，和/或截短而产生本发明的酶变体的α -淀粉酶。这个术语还指与变体进行比较和比对的多肽。亲本可为天然存在(野生型)的多肽，或可为通过任何适当手段制备的变体。例如，亲本蛋白质可为天然存在的多肽的变体，其经过修饰或者在氨基酸序列中发生改变。亲本还可为等位变体，其为由占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式中的任一种编码的多肽。序列同一性参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000, Trends Genet. 16:276-277),优选3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty) 10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty) 0. 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用 Needle 标记为“最高同一'I"生(longest identity) ”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一'丨生百分比，并计算如下(同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，见上文)，优选3. O. O版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分O. 5和EDNAFULL (NCBINUC4. 4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)亚序列术语“亚序列(subsequence) ”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。变体术语“变体”在本文中定义为在多肽的一个或多个特定位置包含一个或多个氨基酸残基的一个或多个改变，如取代、插入、缺失和/或截短的α -淀粉酶。野生型酶术语“野生型” α-淀粉酶表示由天然存在的微生物，如在自然界中发现的酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。变体命名规则在本发明中，采用α -淀粉酶变体中氨基酸残基位置的特定编号方式。例如，通过比对已知α-淀粉酶的氨基酸序列，可以用氨基酸位置编号命名任何α-淀粉酶酶中的任 何氨基酸残基。使用源于SEQ ID NO: 2中披露的α -淀粉酶氨基酸序列的编号系统，与大量其它α -淀粉酶的氨基酸序列比对，可以表示结构同源性区域中α -淀粉酶中的氨基酸残基的位置。在描述本发明的多种α -淀粉酶变体时，为便于提述，适用下述命名法。在所有情况下，采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“Τ226Α”。多个突变用加号(“ + ”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突变，分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。在详明特定位置(其中根据实际的亲本可以由不同氨基酸占据所述位置)的氨基酸取代的情况中，原始氨基酸可以表示为X或Xaa。例如“X226A”意指占据位置226的氨基酸用A或Ala取代，与原始序列(亲本序列)中占据位置226的氨基酸无关。篮失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示为“Glyl95*”或“G195*”。多个缺失用加号(“ + ”)分隔，例如，“Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。通入。对于氨基酸插入，使用下述命名法原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸表示为“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸#1、新插入氨基酸#2，等等]。例如，在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLySAla”或“G195GKA”。在这种情况下，通过向插入的氨基酸残基前面的氨基酸残基位置编号加小写字母来对插入的氨基酸残基编号。因此在上述实例中序列为
权利要求
1.一种分离的变体α-淀粉酶，其在与SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置163、188、205、208和209相对应的位置包含两个或更多个改变，其中 (a)所述变体与SEQID勵2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16和17中任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性， (b)每个改变独立地为取代、缺失或插入；并且 (C)所述变体具有α-淀粉酶活性。
2.权利要求I 的变体，其与 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16 和 17 中任一个具有至少80%的序列同一性。
3.权利要求I 的变体，其与 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16 和 17 中任一个具有至少90%的序列同一性。
4.权利要求I 的变体，其与 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、ll、12、13、14、15、16 和 17 中任一个具有至少95%的序列同一性。
5.权利要求1-4中任一项的变体，其中在位置163、188、205、208和209的改变为取代。
6.权利要求1-5中任一项的变体，其中所述改变选自X163Q，N，X188N,X205N, X208Y和 X209N, S。
7.权利要求1-6中任一项的变体,其进一步包含选自下组的一个或多个改变在与位置183和184相对应的位置的缺失，和在与选自下组的位置相对应的位置的取代186、193、195、202、206、214、244、452、474 和 475。
8.权利要求1-7中任一项的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变X181*+X182*， X182*+X183*， X183*+X184*， X185K, X167W, X202L/I/T, X203Y,X167W+X168E+X169E+X170R, X51T+X109G+X203Y, X109G+X203Y,X189W,X189ff+xl90E+xl93T,X190E, X193T, X303K, X303K+x305R+x306D+X409N+X432N+X434D, X305R, X306D, X409N,X432N, X434D。
9.权利要求1-8中任一项的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变A113E，N116V, V117F, L118K, A119V, V120I, N123D, N126D, N128T, Q129K, G133E, D134P, Y135F,T136E, A139G, D144T, N150D, T151Q, D154S, R158N, W159S, Y160E, V165T, W167F, Q169A,S170K, R171G, Q172*， F173E, Q174R, N175T, R176G, I177V, Y178F, K179R, F180I, R181A,D183E, G184N, A186K, W189E, E190N, S193T/D, N195F, Y203F, V206I，E212D，V214R 和 N215R。
10.权利要求1-9中任一项的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变D183*+G184*，G186A,Y, T, T193F, N195F, M202L, I, T,S,A, I206F,Y, V214I,S244A, D, E, N, Q, ff, T452HY, G474R, G475R。
11.权利要求1-10中任一项的变体，其选自下组D188N+D209S ；D163N+D188N+D209S；D163N+D188N+D205N+D209S ；D163N+D188N+D205N+M208F+D209S ；D207N+D209S ；D163N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D199N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S ；D163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S ；D163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S;D163N+R181A+G182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+N409D+D432N+A434P ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+H408W+N409D+D432N+A434P ；N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W ；和D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W。
12.权利要求1-11中任一项的变体，其选自下组D188N+D209SD163N+D188N+D209SD163N+D188N+D205N+D209SD163N+D188N+D205N+M208F+D209SD207N+D209SD163N+D207N+D209SD163N+D188N+D207N+D209SD163N+D188N+D199N+D207N+D209SD163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209SD163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209SD163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+M208F+D209SD163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S。
13.权利要求1-12中任一项的变体，其选自下组D207N+D186ND207N+D186N+D162ND207N+D186N+D162N+D203ND207N+D186N+D162N+D203N+M206YD207N+D186N+D162N+D203N+M206Y+D105ND207N+A184K+T187E D207N+A184K+T187E+D186ND207N+A184K+T187E+D186N+D162ND207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203ND207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N+M206YD207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N+M206Y+D105N。
14.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1-13中任一项的变体和表面活性剂。
15.一种组合物，其包含权利要求1-13中任一项的变体和选自下组的一个或多个酶β -淀粉酶，纤维素酶(β -葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如，木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支链淀粉酶。
16.权利要求1-13中任一项的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
17.权利要求1-13中任一项的变体用于将织物脱浆的用途。
18.权利要求1-13中任一项的变体用于产生烘培产物的用途。
19.权利要求1-13中任一项的变体用于液化含淀粉材料的用途。
20.一种产生液化淀粉的方法，所述方法包括用权利要求1-13中任一项的变体液化含淀粉材料。
21.—种产生发酵产物的方法，所述方法包括 a.用权利要求1-13中任一项的变体液化含淀粉材料以产生液化醪； b.糖化所述液化醪以产生可发酵的糖；和 c.在存在发酵生物体的情况下发酵所述可发酵的糖。
22.—种产生发酵产物的方法，所述方法包括用权利要求1-13中任一项的变体、葡糖淀粉酶和发酵生物体接触淀粉底物。
23.权利要求21或22的方法，其中发酵产物选自下组醇(例如乙醇和丁醇)，有机酸(例如，琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如，甘油)，抗坏血酸中间物(例如，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2，5- 二酮-D-葡糖酸，和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如，赖氨酸)，蛋白质(例如，抗体及其片段)。
24.编码权利要求1-13中任一项的变体的分离的多核苷酸。
25.包含权利要求24的多核苷酸的核酸构建体。
26.包含权利要求25的核酸构建体的表达载体。
27.包含权利要求25的核酸构建体的宿主细胞。
28.—种产生变体的方法，所述方法包括 a.在适合表达α-淀粉酶的条件下培养权利要求27的宿主细胞；和 b.从所述培养基回收变体。
29.用权利要求24的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
30.一种用于制备亲本α-淀粉酶的变体的方法，所述方法包括下述步骤 a.提供编码亲本α-淀粉酶的核酸，b.在核酸序列中引入改变，而在两个、三个、四个或五个位置产生编码的氨基酸残基的改变，所述位置对应于亲本α-淀粉酶中选自下组的位置163、188、205、208和209 ;所述改变独立地为 (i)紧邻所述位置下游的氨基酸的插入， ( )占据所述位置的氨基酸的缺失，和/或 (iii)占据所述位置的氨基酸的取代， c.任选地在核酸序列中引入其它改变，使亲本α-淀粉酶的B-结构域中的一个或多个氨基酸残基改变为SEQ ID NO:9中对应的氨基酸残基； d.任选地在核酸序列中引入其它改变，而产生选自下组的编码的氨基酸残基的改变X183*+X184*，X186A, Y, T, X193F, X195F, M202L, I, T, S,A, X206F,Y, X214I,X244A, D, E, N, Q, ff, X452H, Y, X474R 和 X475R ； e.在适当的宿主生物体中表达改变的核酸序列；和 f.回收变体α-淀粉酶， 其中每个位置对应于具有SEQ ID ΝΟ:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列中的位置。
全文摘要
本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，所述变体在钙耗竭条件或低pH时稳定性或活性提高。
文档编号C12N9/28GK102884183SQ201180011774
公开日2013年1月16日 申请日期2011年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者C.安德森 申请人:诺维信公司