专利名称：一种以大豆吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法
技术领域：
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及以大豆胚尖为外植体，筛选高再生率且对农杆菌高度敏感的基因型，配合高效的侵染方式，提高了农杆菌的转化效率。
背景技术：
大豆是重要的油料作物和饲料作物，利用转基因技术提高大豆品质是当今育种的重要方向，虽然转基因大豆已经在全球大规模种植，但其遗传转化仍是难点之一，因此，建立一个高效、稳定的再生体系是解决大豆遗传转化率低的基石。大豆组织培养的研究可追溯到20世纪60年代，直到80年代才取得飞跃性突破，通过大豆的原生质体、下胚轴、小真叶、幼胚、子叶节、胚尖等外植体相继获得了再生植株。目前，已经建立的大豆遗传转化体系仍存在组培操作技巧性强、植株再生率低、重复性差等问题，严重制约了利用分子生物学手段改良遗传性状。所以，建立一个简便、高效、 稳定的再生体系是大豆遗传转化成功的基础，也是众多研究者需要解决的关键性问题。近些年发展起来的大豆胚尖再生体系因取材方便、再生周期短、操作简便、褐化率低等优点，已经广泛应用于大豆遗传转化技术中。但胚尖再生体系同样存在一些致命的缺点，如基因型依赖性强、转化率低等。因此，筛选适合胚尖再生体系的基因型，采取高效的侵染方式，并建立专属于这个基因型的遗传转化体系，提高转化效率，对大豆遗传转化的发展具有重大实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以大豆吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法。本发明采取的技术方案是，包括下列步骤
(1)选取种皮完整无病害的吉林35号大豆种子，自来水冲洗干净后用75%的酒精处理 50s，无菌水冲洗3 5遍，而后浸泡于无菌水中Mi并切取外植体胚尖；
(2)将外植体先进行超声波处理6s，之后用真空泵辅助农杆菌侵染15min，并于侵染液中添加 0. 03% Silwet L-77 ；
(3)侵染后的胚尖外植体转接到共培养基中，共培养基附加3.0mg . I^e-BA以诱导丛生芽和3.0 mg . L—1硝酸银以抑制褐化和坏死；
(4)共培养3天后移接至丛生芽伸长培养基中，伸长培养基附加0.5mg . L—1 6-BA与 0.2 mg . Γ1 IBA，此阶段添加筛选剂 Basta 0. 6 mg . Γ1 ；
(5)待再生植株长到4.7^5. 3cm时，接入生根培养基，生根培养基以蔗糖作为碳源，选用1/2 MSB并附加0.5 mg .厂1 IBA，待根长势健壮后移栽至营养钵中；
(6)移栽后提取叶片DNA做PCR检测，并采用bar基因试纸条进行蛋白检测。本发明所使用的大豆品种，由吉林大学植物种质资源与利用研究室提供。此项发明以大豆胚尖为外植体，首先，对十个基因型吉林35、吉林47、平安8、东
3农42、美国扁茎、吉大豆1号、吉大豆2号、吉大113、合丰43和绥农10和5个6-BA，0,0. 2、 0.5、1.0、3.0和5.0 mg . L—1水平的诱芽率进行了双因素试验，然后对十个品种进行⑶S 基因的瞬时表达，测定荧光值，综合上述两个试验结果，筛选出高再生率且对农杆菌敏感的品种吉林35。继而，以吉林35号胚尖为受体材料，进行氯气、升汞和酒精三种种子消毒方法比较，消毒后浸泡于无菌水中他，切取外植体胚尖直接进行农杆菌侵染，采用静止、摇床、 真空泵三种侵染方式，lOmin、15min、20min三个侵染时间与超声波处理组合，并于重悬液中添加0.03%和0.06% Silwet L-77。共培养期间采用3. O mg .厂1 6-BA诱导丛生芽，并于培养基加入不同浓度脯氨酸和硝酸银(0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg . L—1)，以抑制褐化， 诱芽阶段不添加任何激素和附加物质，丛生芽伸长培养基设置3种6-BA浓度(0. 0,0. 2和 0. 5 mg . 171)和3种仍六浓度(0.0、0.2和0.5 mg . Γ1)，生根培养基中设置1/2 MSB、1/4 MSB、蔗糖、葡萄糖和3种IBA浓度(0.2、0. 5和l.Omg . L—1)共12种组合。以合丰35、东农42为对照，采用常规遗传转化方法，而吉林35采用上述的遗传转化方法，移栽后提取叶片DNA做PCR检测，并采用bar基因试纸条进行蛋白检测，最后比较三者间转化率。本发明的有益效果本项发明为大豆遗传转化技术提供了一种高效率的转化方法。与常规的大豆胚尖遗传转化体系相比，本发明缩短了再生周期，采用了强有效的侵染方式，降低了共培养期间的褐化与坏死程度，提高了转化率，建立了以吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法，对解决大豆遗传转化困难、再生率低等问题具有较大的实践意义。下面结合具体实施方法对本发明作详细说明。
图1是不同基因型大豆胚尖的丛生芽诱芽率图； 图2是不同基因型大豆胚尖GUS活性检测结果图； 图3是不同侵染方式GUS活性检测图4是不同浓度Silwet L-77对侵染的影响图，图中A:未侵染B:真空侵染20min C: 真空侵染15min D:重悬液中加入0.03% Silwet L-77真空侵染20min Ε:重悬液中加入 0. 03% Silwet L-77真空侵染15min F:重悬液中加入0.06% Silwet L-77真空侵染20min G:重悬液中加入0. 06% Silwet L-77真空侵染15min 图5是脯氨酸和硝酸银对褐化的影响图； 图6是6-BA和IBA对胚尖再生的影响图7是无机盐、糖类及IBA对生根的影响图，A: 1/2 MSB+蔗糖+0.2mg . Γ1 IBA5B: 1/2 MSB+蔗糖+0. 5mg . L-1 IBA ；C: 1/2 MSB+蔗糖+l.Omg . L-1 IBA ；D:1/4 MSB+蔗糖+0. 2mg .L-1 IBA ；E:1/4 MSB+蔗糖+0. 5mg . L-1 IBA ；F: 1/4 MSB+蔗糖+1. Omg . L-1 IBA ;G: 1/2 MSB+ 葡萄糖 +0. 2mg . Γ1 IBA ；H: 1/2 MSB+ 葡萄糖 +0. 5mg . Γ1 IBA ；1:1/2 MSB+ 葡萄糖 +1. Omg . Γ1 IBA ;J: 1/4 MSB+葡萄糖+0. 2mg . L-1 IBA ；K; 1/4 MSB+葡萄糖+0. 5mg . Γ1 IBA ；L; 1/4 MSB+ 葡萄糖 +1. Omg . L-1 IBA ；
图8是大豆吉林35胚尖遗传转化流程图，Α:真空侵染B:共培养C:诱芽D:生根E: 移栽F:开花G:结荚；
图9是再生植株的PCR检测图；M markerU 阴性对照、2 阳性对照、3_19部分检测样品DNA ；图10是再生植株的蛋白检测图。
具体实施例方式(1)选取种皮完整无病害的吉林35号大豆种子，自来水冲洗干净后用75%的酒精处理50s，无菌水冲洗3 5遍，而后浸泡于无菌水中Mi并切取外植体胚尖；
(2)将外植体先进行超声波处理6s，之后用真空泵辅助农杆菌侵染15min，并于侵染液中添加 0. 03% Silwet L-77 ；
(3)侵染后的胚尖外植体转接到共培养基中，共培养基附加3.0mg . I^e-BA以诱导丛生芽和3.0 mg . L—1硝酸银以抑制褐化和坏死；
(4)共培养3天后移接至丛生芽伸长培养基中，伸长培养基附加0.5mg . L—1 6-BA与 0.2 mg . Γ1 IBA，此阶段添加筛选剂 Basta 0. 6 mg . Γ1 ；
(5)待再生植株长到4.7^5. 3cm时，接入生根培养基，生根培养基以蔗糖作为碳源，选用1/2 MSB并附加0.5 mg .厂1 IBA，待根长势健壮后移栽至营养钵中；
(6)移栽后提取叶片DNA做PCR检测，并采用bar基因试纸条进行蛋白检测。本发明所使用的大豆品种，由吉林大学植物种质资源与利用研究室提供。下面结合具体实施例来进步一说明本发明。实施例1 不同基因型大豆胚尖的丛生芽诱芽率
以吉林35、吉林47、平安豆8、东农42、美国扁茎、吉大豆1号、吉大豆2号、吉大豆3号、 合丰43和绥农10为材料，在诱导培养基上分别加入不同浓度6-BA (0,0. 2,0. 5,1. 0,3. 0 和5.0 mg . Γ1)(购自北京鼎国)，光照诱导5 d，转接MSB培养基上(MS大量、MS微量、MS 铁盐和B5有机)，每个处理30个外植体，3次重复。14d调查统计大豆各基因型胚尖不定芽诱导率，结果如图1。从图1可知，供试品种中吉大豆2号整体诱芽率最高，其次为吉林35。整体来看， 适宜的6-BA浓度主要集中在0. 2 3.0 mg . L—1之间。实施例2 不同基因型大豆胚尖⑶S活性检测结果
上述十个品种的胚尖外植体分别浸入转入PCAMBIA1301 (购自CAMBIA)质粒载体的农杆菌EHA105(购自Biovector)重悬液中，真空侵染15 min，洗去外植体上附着的菌液，将外植体转接入共培养基中(1/2MS大量+MS微量+MS铁盐+B5有机+30 g/L蔗糖+0. 8g/L琼月旨+100uMAS+5mg/L6-BA PH5. 4)，培养 3 d。选取未褐化胚尖外植体约IOOmg，加入液氮，研磨成粉末，将粉末装入1. 5ml离心管，加入600ul⑶S提取缓冲液，充分混勻，4°C，12，000rpm，离心lOmin，取上清分装于2个新离心管，4°C保存备用。上清液为GUS蛋白粗提液，其中一部分上清液用分光光度计测蛋白浓度，另一部分上清液加入⑶S反应底物4-MUG(购自长春德尔塔生物)，37V，反应10 min，加反应终止液(0.2 mmol/L Na2CO3)终止反应，在荧光分光光度计下，测定荧光值。计算GUS活性。⑶S荧光定量结果如图2所示，侵染后吉林35⑶S活性最高，远远高于吉大豆2号及其它大豆品种，说明吉林35胚尖外植体对农杆菌敏感性最强，由于其在胚尖转化体系中的诱芽率也相对较高，因此，吉林35可作为大豆胚尖遗传转化体系良好的受体材料。实施例3 不同消毒方法对胚尖出芽率的影响选取种皮完整无病斑、无虫害、无霉菌的成熟吉林35号大豆种子，采用3种种子消毒方法。(1)氯气消毒法大豆种子放于通风橱内的密闭容器中，混合96 ml 5% Naclo和4 ml Hcl (均购自北京鼎国)，消毒6 10 h。(2)升汞消毒法自来水冲洗大豆种子，75%的酒精处理35 s，然后用0.1% Hgcl2消毒10 min，无菌水冲洗3 5遍。(3)酒精消毒法自来水冲洗大豆种子，75%的酒精处理50 s，无菌水冲洗3 5遍。每种消毒方法处理100粒种子，3次重复。结果如下表采用3种方法对吉林35成熟种子进行消毒，均未出现污染现象，但出芽率明显不同。酒精法消毒的发芽率高达98. 3%，效果优于另外两种消毒方法。酒精消毒法对种子伤害较小，可以保证较高的出芽率，是一种简便、易行、可靠的消毒方式。
消毒方法接种数污染数出芽￠/%
P气酒毒法100096 7
升录消爨法.100087.3
_精爾禱法100098—3实施例4 不同侵染方式⑶S活性检测
将携带PCAMBIA1301农杆菌EHA105对吉林35胚尖进行转化，共设置静止、摇床和真空泵三种侵染方式，10minU5min和20min三个时间处理，附加超声波和无超声波处理，共计 18种侵染组合。侵染后按照例2中的方法，测定蛋白浓度和荧光值，计算GUS活性。GUS荧光定量结果如图3所示，真空侵染后GUS活性的整体平均值高于另外两种侵染方式，且超声波处理一般高于无超声波处理。其中，以超声波处理后真空侵染15min⑶S 活性最高。实施例5 不同浓度Silwet L-77对侵染的影响
将携带PCAMBIA1301农杆菌EHA105对吉林35号胚尖进行转化，设置一个空白对照和6 种处理，分别为未侵染、真空侵染15min、真空侵染20min、重悬液中加入0. 03% Silwet L-77 (购自北京鼎国)真空侵染15min、重悬液中加入0. 03% Silwet L-77真空侵染20min、重悬液中加入0.06% Silwet L-77真空侵染15min和重悬液中加入0. 06% Silwet L-77真空侵染20min。感染后的胚尖外植体转接至共培养培养基中，22°C，黑暗培养。参照Jefferson 等的方法，选择共培养3 d未褐化的胚尖浸泡在X-Gluc (购自上海生工)染色液中，37°C保温过夜，观察染色情况。瞬时表达结果如图4，六种处理间⑶S基因表达结果差异很大，以重悬液中加入 0. 03% Silwet L-77表现较为突出，在根尖分生组织区和顶端分生组织区同时表达，真空侵染20min表达效果最为明显，整个外植体都被染为蓝色。综合实例4，以超声波处理后真空侵染15min，且于重悬液中附加0. 03% Silwet L-77为最佳侵染方法。实施例6 脯氨酸和硝酸银对褐化的影响
以吉林35号为材料，消毒获得外植体，按照上述方法侵染后，倒掉菌液，用灭菌后的滤纸吸干胚尖表面的菌液，然后将外植体平放于铺有滤纸的共培养基中。共培养基和重悬液中分别加入不同浓度脯氨酸(0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg . L—1)和硝酸银(0、1. 0、2. 0、 3.0、4.0和5.0 mg . L—1)，在22°C、黑暗条件下培养。每个处理45个外植体，3次重复，培养5 d，分别调查统计不同浓度附加物下胚尖褐化情况。结果表明(图5)，随着脯氨酸和硝酸银浓度的增加褐化率逐渐降低达到最小值后又升高。脯氨酸和硝酸银均在3. 0 mg . Γ1浓度下胚尖褐化率最低，分别为3. 70%和2. 96%， 表明脯氨酸和硝酸银对褐化率有显著抑制效果。实施例7 :6-BA和IBA对胚尖再生的影响
以吉林35号为试验材料，消毒后浸泡于无菌水中，切去原叶及子叶获得胚尖外植体。 按照实例4和5侵染后共培养3天，接入诱芽培养基中培养14天，而后转接至丛生芽伸长培养基中。丛生芽伸长培养基设置3种6-BA浓度(0.0、0. 2和0. 5 mg . L-1)禾口 3种IBA 浓度(0.0、0. 2和0. 5 mg . L—1)，共9种组合，每个处理30个外植体，3次重复。20d调查统计丛生芽的生长状况和再生率，应用软件SPSS16. 0做丛生芽再生率的方差分析和显著性检验。再生率(％ )=丛生芽高度大于3 cm外植体数目/出芽外植体数目X 100% 如图6所示，6-BA浓度为0.0 mg . L-1时，随着IBA浓度的增加再生率急剧下降；6-BA
浓度为0 .2 mg . L—1时，再生率下降趋势在一定程度上减缓；6-BA浓度为0.5 mg . L—1时， 再生率先增加然后下降。总体趋势表明，6-BA对再生率影响最大，单独使用也可获得较高的再生率，而IBA只有当其浓度低于6-BA浓度时，二者配合使用才能提高再生率，反之，则降低再生率。显著性差异检验表明，不同激素浓度配比间再生率存在差异。0.5 mg . L—1 6_BA 与0.2 mg . Γ1 IBA配合使用和0.5 mg . L—1 6-BA单独使用，再生率显著高于其它组合，二者间无显著差异，但二者配合使用时再生率最高。综合考虑，0.5 mg . L—1 6-BA与0.2 mg
Γ1 IBA对吉林35丛生芽伸长作用效果最佳。实施例8 无机盐、糖类及IBA对生根的影响
通过上述方法获得再生植株，待其长到5 cm左右时，接入生根培养基。生根培养基中分别设置1/2 MSBU/4 MSB、蔗糖、葡萄糖和3种IBA浓度(0.2、0. 5和l.Omg . L-1)共12 种组合。每种组合30个外植体，3次重复，培养3周后调查每种组合生根状况。由图7可知，蔗糖比葡萄糖能更好地促进生根，而葡萄糖则易产生愈伤且生长较慢，选用蔗糖作为碳源物质情况下，1/2 MSB较1/4 MSB培养基中的根更粗壮且数量多(A与 D)，但是随着IBA浓度增加，这种趋势逐渐消失(C与F)。以蔗糖作为碳源，1/2 MSB配合高浓度的IBA做为生根培养基较为合适。实施例9 合丰35、东农42和吉林35三个品种间转化率的比较
以合丰35、东农42两个品种为对照，采用卫志明等的胚尖遗传转化方法，而吉林35采用本发明中的遗传转化方法，具体流程如图8，待再生植株移栽成活后，用CTAB法提取叶片总DNA，检测目的基因的PCR扩增产物，约为IlOObp (如图9)。取一小块叶片于1. 5ml离心管中，用小棒研磨30s左右，加入500ul蛋白提取液， 继续研磨30s，将含有吸水垫一端的bar基因试纸条插入离心管中，IOmin后观察结果，如图 10，只有一条带的为阴性植株，含有两条带的为阳性植株。
分别统计合丰35、东农42和吉林35侵染后的外植体数目、移栽成活的再生植株数目、PCR和试纸条检测同为阳性的植株数，计算最终转化率。结果如下表，从表中数目可知，吉林35的转化率最高，所取得的较高的转化率主要归功于采用的高效遗传转化方法即各种影响因子的绝佳组合，转化结果充分的验证了吉林35胚尖遗传转化方法的高效性。
权利要求
1. 一种以大豆吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法，其特征在于包括下列步骤(1)选取种皮完整无病害的吉林35号大豆种子，自来水冲洗干净后用75%的酒精处理 50s，无菌水冲洗3 5遍，而后浸泡于无菌水中Mi并切取外植体胚尖；(2)将外植体先进行超声波处理6s，之后用真空泵辅助农杆菌侵染15min，并于侵染液中添加 0. 03% Silwet L-77 ；(3)侵染后的胚尖外植体转接到共培养基中，共培养基附加3.0mg . I^e-BA以诱导丛生芽和3.0 mg . L—1硝酸银以抑制褐化和坏死；(4)共培养3天后移接至丛生芽伸长培养基中，伸长培养基附加0.5mg . L—1 6-BA与 0.2 mg . Γ1 IBA，此阶段添加筛选剂 Basta 0. 6 mg . Γ1 ；(5)待再生植株长到4.7^5. 3cm时，接入生根培养基，生根培养基以蔗糖作为碳源，选用1/2 MSB并附加0.5 mg . Γ1 IBA，待根长势健壮后移栽至营养钵中；(6)移栽后提取叶片DNA做PCR检测，并采用bar基因试纸条进行蛋白检测。
全文摘要
本发明涉及一种以大豆吉林35号胚尖为外植体的高效遗传转化方法，属于植物转基因技术领域。选取种皮完整无病害的吉林35号大豆种子，将外植体先进行超声波处理，侵染后的胚尖外植体转接到共培养基中，共培养、接入生根培养基，待根长势健壮后移栽至营养钵中。本发明缩短了再生周期，采用了强有效的侵染方式，降低了共培养期间的褐化与坏死程度，提高了转化率。
文档编号C12N15/82GK102533848SQ20121001912
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘雅婧, 孙昕, 张鑫生, 李景文, 杨旭光, 王庆钰, 王英, 程浩, 翟莹, 赵健如, 闫帆, 陈虹地 申请人:吉林大学