专利名称：一种猪免疫性状相关的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的一种猪免疫性状相关的分子标记及其应用，特别涉及扩增包含与猪免疫性状相关的GBP2基因上单核苷酸多态性位点的序列的特异引物对，该特异弓I物对可用于鉴别猪的免疫性状。
背景技术：
近年来，现代育种技术在改良猪生产性状方面做出了很大贡献，但对健康和抵抗疾病的能力的遗传改良确没有得到足够重视。一些预防性措施的应用，如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物和疫苗等，在现代养猪业中发挥了重要作用，但随着全球对减少药物和疫苗使用的呼声越来越高，采用分子遗传学方法从本质上提高畜禽机体自身抗病能力越来越受到关注，成为研究的重点。抗病力一般受先天性免疫和后天性免疫所协调。先天免疫快速，一般发生在接触病原96h之内，无病原特异性，主要与单核细胞(如巨噬细胞)、粒细胞(如嗜中性粒细胞)和自然杀伤细胞等白细胞、红细胞及血液中天然存在的抗微生物分子、补体系统、细胞因子和急性期蛋白因子有关。白细胞根据常规方法离心后可大致分为三大类，即淋巴细胞、中间白细胞(主要为巨噬细胞等单核细胞)以及中性粒细胞，其在免疫中的作用主要为细胞吞噬及产生特异抗体。红细胞有许多与免疫有关的物质如CRl、CR3、ra58、ra59、DAF、S0D等，数目众多，自成系统。红细胞是血循环中最重要的固有免疫细胞，具有识别、黏附、浓缩、杀伤抗原和清除循环免疫复合物(CIC)的能力，参与机体免疫调控，并有完整的自我调控系统，在许多疾病免疫发病机制中，红细胞天然免疫缺陷占有很重要的地位。后天免疫包括细胞免疫和体液免疫两个方面，是通过特定的遗传机理产生特殊的抗原翻译，即特异性免疫应答。按遗传基础的不同，抗病力可分为特殊抗病力和一般抗病力，特殊抗病力是指猪对某一特定疾病或病原体的抗性，这一抗性主要受一个主基因位点控制，表现为宿主体内存在或缺失某种分子或其受体。一般抗病力不限于对某一种病原体的抗性，病原体抗原性差异对一般抗病力基本没有影响，它体现了机体对疾病的整体防御功能。在疾病发生时，大多数抗病力都受到遗传因素及环境因素的影响，即使是由特定病原体所致的传染病或寄生虫，在不同种群和个体中的抗性也不同。个体免疫力是衡量动物健康的重要指标，它属于数量性状，其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作者提出了一个大的难题，即如何在保持和提高生产性能的基础上同时提高个体免疫能力是育种工作者研究的新课题。不过，最近国外少量研究表明猪免疫能力与生产性能的关系是双向的，某种情况下即正常状态免疫能力的增强能提高猪的生长速度，饲料效率等主要生产性能，而单纯针对生产性能的选择却导致猪免疫能力下降即相关等位基因的丢失或频率的降低。但是，目前二者的相互关系仍然不是很明了，从基因组水平揭示出生产性能和免疫力的控制基因体系间的具体关系，是解决上述难题的有效途径。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。
对于猪抗病性状的候选基因，目前已有多例报道，其中研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和F18受体基因。研究表明动物体内如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置，a-(l，2)-海藻糖转移酶 I (a (1,2) fucosyltransferase, FUT I)基因是 F18 受体(ECF18R)的候选基因，位于猪6号染色体上。此外，E. coli F4受体基因也与猪的腹泻有关。氟烷基因(Hal)是另一个影响较大的抗性相关基因，它的氟烷敏感等位基因(Haln)可导致猪的体质和抵抗力下降，产生剧烈的应激反应。猪的干扰素被证明对繁殖障碍与呼吸道综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、胃肠炎冠状病毒等多种重大传染病病毒均具有广谱防御和抑制作用，因而干扰素基因、干扰素受体基因是选择猪的非特异性抗病力的重要候选基因。另外，MHC已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关，其它有研究的与抗病力有关的基因是MXl (Myxovirus (influenza) resistanceI，粘液病毒(流感)抗性因子 I)、NRAMPl (Natural resistance-associated macrophageprotein I,与巨曬细胞有关的天然抗性蛋白I), ILl (Interleukins I,白细胞介素I)、PPARG (Peroxisome proliferator activated receptor gamma,过氧化物酶体增殖激活受体Y)等基因。早在1979年，Gupta发现经干扰素Y刺激后，在人的成纤维细胞中可产生一种约67kDa的蛋白，由于其具有GTP结合和水解的活性，被命名为干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白(interferon-inducible guanylate binding proteins, GBPs)。GBP 家族属于 GTP 酶超家族，类似于其他家族成员，如Mx (myxovirus) GTPase家族和P47GTPase家族,被发现具有抗病毒能力。人的GBPl(hGBPl)和小鼠的 GBP2 (mGBP2)均证实了对 VSV (vesicular stomatitisvirus,水泡性口膜炎病毒)和EMCV(encephalomyocarditis virus,脑炎心肌炎病毒)的抵抗作用。并且mGBP2抑制EMCV的作用依赖于GTP结合的活性，但是mGBP2对VSV的抑制却和GTP结合的活性无关，表明不同的病毒类型可能对GBPs的效应机制有不同的影响。mGBPs在感染Listeria monocytogenes (单核细胞增多性李司特氏菌)和Toxoplasma gondi (鼠弓形体)后显著上调，并且可观察到GBPs蛋白包围T. gondii形成的寄生泡，由此推测，mGBPs可能在抵抗细菌和原生动物感染中起作用。在猪霍乱沙门氏菌感染的基因表达谱芯片分析中，发现猪GBPl和GBP2基因均显著上调近10倍。已有的研究证据提示GBPs基因的过表达可能直接参与宿主对病原体的抵抗。迄今为止，尚未见猪GBP2基因突变位点的多态性与性状关联分析的研究和应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种猪免疫性状相关的分子标记，即扩增如下DNA片段的PCR引物对猪基因组DNA或cDNA上的任意一段含有序列表序列I自5’末端第231位核苷酸的DNA片段；该？0 引物对可用于鉴别或辅助鉴别猪免疫性状，所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。
在上述PCR引物对中，所述PCR引物对具体可由序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA组成。
序列表序列I所示核苷酸序列为猪免疫性状相关的猪GBP2基因的部分基因组DNA序列，在其自5’末端第231位核苷酸存在由C到G的突变；当该位点的核苷酸突变为G时，引起氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸，并产生I个限制性内切酶Eamll05I的识别序列(GACNNN'NNGTC);将该位点为C纯合型的猪命名为CC基因型猪，将该位点为G纯合型的猪命名为GG基因型猪，将该位点为CG杂合型的猪命名为CG基因型猪；本发明通过实验证明，该位点由C到G的突变与猪的红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积免疫性状相关联。
本发明保护上述任意一种PCR引物对在制备鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的试剂或试剂盒中的应用，所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。本发明的另一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的试剂，所述试剂由独立包装的序列表序列2所示的单链DNA和独立包装的序列表序列3所示的单链DNA组成；所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。本发明还提供一种鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的试剂盒，所述试剂盒中含有所述试剂；所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。所述试剂盒中还可含有独立包装的限制性内切酶Eaml 1051。本发明保护上述任一所述试剂或试剂盒在猪育种中的应用。本发明还提供一种鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的方法，包括如下步骤检测待测猪对应于序列表序列I自5’末端第231位核苷酸是C还是G，确定待测猪的基因型是CC、CG还是GG，若所述待测猪的基因型是CC，则将所述待测猪候选为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种高于CG和GG基因型猪；若所述待测猪的基因型是CG，则将所述待测猪候选为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种高于GG基因型猪且低于CC基因型猪；若所述待测猪的基因型是GG，则将所述待测猪候选为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种低于CG和CC基因型猪。本发明还提供一种猪的育种方法，包括选择CC基因型的猪作为亲本进行杂交的步骤，或向CC基因型的猪中导入目的基因进行转基因育种的步骤。上述红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积具体可为17日龄猪的红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积。上述CC、CG和GG三种基因型猪的确定方法具体可为以待测猪的基因组DNA为I旲板，用所述由序列表序列2所不的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA组成的PCR弓丨物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；用限制性内切酶Eamll05I酶切得到的PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物的Eamll05I酶切产物确定待测猪的基因型是CC、CG和GG这三种基因型中的哪一种、或候选为CC、CG和GG这三种基因型中的哪一种若所述Eamll05I酶切产物满足如下I)的条件，则确定所述待测猪的基因型为GG，或候选为GG ;若所述PCR扩增产物满足如下2)的条件，则确定所述待测猪的基因型为CC，或候选为CC ;若所述PCR扩增产物满足如下3)的条件，则确定所述待测猪的基因型为CG或候选为CG I)所述酶切产物显示154bp和236bp的两条带；2)所述酶切产物显示390bp的一条带；
3)所述酶切产物显示390bp、154bp和236bp的三条带。本发明根据发现的与猪免疫性状相关的GBP2基因上的SNP(231e/()设计特异引物对，利用PCR-RFLP-Eaml 1051多态性对待测猪样本进行基因型分析，并通过17种免疫性状关联分析证明了 17日龄猪的红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积三种免疫性状与SNP(231c/g)位点相关联，且CC基因型17日龄猪的红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积的值高于另外两种基因型猪。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记，在猪的抗病育种中具有重要意义。
图I为发生碱基突变的基因序列与已知基因序列的对比图。其中，上方为发生碱基突变的部分基因序列，下方为与发生碱基突变的基因序列相对应的部分猪GBP2基因组DNA序列，S表示发生突变的位点。图2为特异引物对PCR扩增部分猪GBP2基因组DNA的电泳图。其中，泳道I为390bp的目的产物，泳道M为分子量标准，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp。图3为部分基因型样本的PCR-RFLP多态性检测结果。其中，泳道M为分子量标准，从上到下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp和IOObp，其余泳道为CC、CG或GG基
因型样本的带型。图4为利用猪GBP2基因SNPs位点对进行猪免疫性状进行关联分析的流程图。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、猪GBP2基因的单核苷酸多态性(SNP)和PCR-RFLP多态性检测一、猪GBP2基因SNP (231C/G)的特异引物对的设计在猪GBP2基因的基因组DNA (GenBank收录号NC_010446. 4)中，发现一个SNP (如图I所示)，根据该SNP设计一对特异引物对如下上游引物5’-CCTCACAAGAGAGTGGATAGT-3’ (如序列表序列 2 所示)，上游引物5’ -TAGTCCCAATAACCTTGCTTC-3’ (如序列表序列3所示)。靶序列如序列表的序列I所示(390bp)，该序列包括猪GBP2基因组DNA的部分第4内含子、第5外显子和部分第5内含子。序列表的序列I自5’末端第231位核苷酸位核苷酸存在C — G的突变，该突变位点对应于猪GBP2基因组DNA (GenBank收录号NC_010446. 4)的第12147位和猪GBP2基因部分cDNA序列即序列表序列4 (含完整的CDS序列和部分非翻译序列)的第602位，当该核苷酸突变为G时，存在I个限制性内切酶Eamll05I的识别序列(GACNNN'NNGTC)，酶切位点位于序列表序列I自5’末端第236位和第237位核苷酸之间。二、应用特异引物对对各个群体进行分型
待测猪属于外来欧美血缘的猪种大白猪、长白猪和杜洛克猪；属于中国地方血缘的二花脸猪、大花白猪、通城猪和玉山黑猪。
I、提取待测猪的基因组DNA。2、以基因组DNA为模板，用步骤一设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系(10 ii L) =DNA 模板 0. 5 y L (25ngDNA)，双蒸水 7. 5 y L，10 X PCRbuffer I u L, dNTP 0. 3 u L, IOmM 引物各 0. 3 u L, Taq 酶 1U。PCR扩增程序941预变性5111111后，941变性308、601退火308、721延伸358，33个循环，最后72°C延伸5min。PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示。3、将PCR扩增产物用限制性内切酶Eamll05I酶切，得到酶切产物。酶切反应体系(IOii L):其中IOXbuffer I U L，PCR扩增产物3 ii L，限制性内切酶Eaml 1051 0. 2 y L (2. 0U)，用 ddH20 补足 10 y L。酶切反应体系混匀后离心，37°C温育12h。4、将酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照像，记录基因型并统计基因频率。各样品的酶切产物分三种带型，基于酶切产物的电泳图分型如下带型I :显示154bp和236bp的两条带；带型II :显示390bp的一条带；带型III :显示390bp、154bp和236bp的三条带。5、将步骤2的各个PCR扩增产物分别进行测序，测序结果与带型显示的结果一致，基于测序结果分型如下GG型PCR扩增产物(390bp)为序列表的序列4自5’末端第231位核苷酸突变为G得到的DNA片段，该PCR扩增产物能被限制性内切酶Eaml 1051酶切，产生154bp和236bp的两个酶切产物；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型I。CC型PCR扩增产物(390bp)为序列表的序列4自5’末端第231位核苷酸为C (未发生突变)得到的DNA片段，该PCR扩增产物不能被限制性内切酶Eamll05I酶切；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型II。CG型PCR扩增产物为GG型的PCR产物和CC型的PCR产物的混合物；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型III (即GG型的酶切产物和CC型的酶切产物的叠加)。部分基因型的样本的酶切产物的2%的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。7个群体的基因型及等位基因频率统计结果及卡方检验结果如表I和表2所示。
表I.七个猪品种中GBP2基因SNP(231e/()位点多态性的基因型和基因频率
权利要求
1.扩增如下DNA片段的PCR引物对猪基因组DNA或cDNA上的任意一段含有序列表序列I自5’末端第231位核苷酸的DNA片段。
2.根据权利要求I所述的PCR引物对，其特征在于所述PCR引物对由序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA组成。
3.权利要求I或2所述PCR引物对在制备鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的试剂或试剂盒中的应用，所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。
4.一种鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的试剂，其特征在于所述试剂由独立包装的序列表序列2所示的单链DNA和独立包装的序列表序列3所示的单链DNA组成；所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。
5.一种鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有权利要求4所述的试剂；所述免疫性状为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有独立包装的限制性内切酶Eaml 1051。
7.权利要求4-6中任一所述试剂或试剂盒在猪育种中的应用。
8.一种鉴别或辅助鉴别猪免疫性状的方法，包括如下步骤检测待测猪对应于序列表序列I自5’末端第231位核苷酸是C还是G，确定待测猪的基因型是CC、CG还是GG，若所述待测猪的基因型是CC，则将所述待测猪候选为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种高于CG和GG基因型猪；若所述待测猪的基因型是CG，则将所述待测猪候选为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种高于GG基因型猪且低于CC基因型猪；若所述待测猪的基因型是GG，则将所述待测猪候选为红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种低于CG和CC基因型猪。
9.猪的育种方法，包括选择CC基因型的猪作为亲本进行杂交的步骤，或向CC基因型的猪中导入目的基因进行转基因育种的步骤；所述CC基因型的猪是对应于序列表序列I自5’末端第231位核苷酸是C的纯合体。
全文摘要
本发明公开了一种猪免疫性状相关的分子标记及其应用。所述分子标记即扩增如下DNA片段的PCR引物对猪基因组DNA或cDNA上的任意一段含有序列表序列1白5’末端第231位核苷酸的DNA片段。该PCR引物对可用于鉴别或辅助鉴别猪免疫性状，所述免疫性状为17日龄猪的红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积中的至少一种。所述PCR引物对具体可由序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA组成。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记，在猪的抗病育种中具有重要意义。
文档编号C12N15/11GK102618537SQ20121010945
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者储明星, 周荣, 李奎, 牟玉莲, 贾浩, 赵书红, 马国剑, 黄菁 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所