专利名称：一种小肽螯合锌复合物的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种小肽螯合锌复合物的制备方法与应用。
背景技术：
动物为了保证每ー个细胞，组织，器官，腺体及系统的正常功能需要特定的微量元素，微量元素是动物不可缺少的营养物质，日粮中添加一定高质量、高利用率的微量元素对动物健康和最大限度发挥其生产潜カ具有十分重要的作用(NRC，1998 ；Richards,2008)。锌是动物体内很多酶的组成成分，也是某些酶的激活剂。例如锌參与糖代谢，每一个胰岛素分子内含有两个锌原子，锌与胰岛素的产生、分泌、贮存以及胰岛素的活性有密切的关系；參与红细胞运送氧气和ニ氧化碳有关的酶中也有锌。锌与核酸及蛋白质的合成 及对细胞的生长有密切的关系。含锌酶參与骨骼生长与营养物质代谢；锌还是维持皮肤正常生长所必需的元素。缺锌影响生长发育，缺锌可使毛发色素变淡、指甲上出现白斑。由于无机微量元素之间存在相互拮抗作用，比如铜、锌之间，铁、锌之间，导致吸收利用率降低。人们多超量添加希望解决缺乏问题，但不仅效果有限，还产生了对环境的污染(Cao，1997)。微量元素的缺乏能够导致许多动物代谢甚至临床疾病的发生。在家畜和禽类生产过程中，微量元素的缺乏直接导致生长缓慢和饲料转化效率下降(NRC，1998)。现在有机微量元素已成为国内外饲料及养埴行业研究的热点。有机微量元素的生物及经济价值已经在动物养殖业得到体现，特别是在母猪、奶牛、种禽上，对提高种用畜禽繁殖率、延长利用年限(母猪至少ー胎)、解决蹄病、改善健康、提升外卖动物表观价值等具有特殊贡献(Cao et al.,2000;敖志刚译，2010 ;刁其玉，2010)。研究显示母猪饲喂有机铁可通过胎盘转送到胚胎中，可显著提高胎儿血液的铁含量(王学梅2002 ；Peters and Mahan, 2008)。Nollet等(2007)在仔鸡日粮中添加有机微量元素，其饲料利用率显著提高，粪便中微量元素的排泄量降低，Mn、Zn、Fe和Cu的排泄量可以分别降低54，37，27，和45%。Castillo等(2008)将有机锌用于乳猪教槽料，提高了饲料的利用效率。Andrieu (2009)综述强调使用有机锌、铜和硒能有效地降低反刍动物乳房炎发病率，減少蹄病发生，提高繁殖性能。大量研究表明，在不同动物中使用有机微量元素均可提闻动物的生长、繁通性能，提闻动物抵御疾病的能力。目前，市场上常见的有机微量元素主要为有机酸类微量元素和氨基酸螯合微量元素。从上世纪80年代开始出现以富马酸铁，葡萄糖酸锌等为代表的有机酸类微量元素。第ニ代的简单有机盐，虽然稳定性好，但与部分营养物质仍会发生拮抗作用。在消化吸收过程中受影响的因素也较多，生物学利用率仍较低。金属离子与氨基酸分子通过配位键结合后，使其分子内电荷趋于中性，形成了较稳定的化学结构(黄雪等，2008 ;)。但在瘤胃或单胃内酸环境下的稳定性问题一致没有很好地解决(梁建光等，2008)。因此，研发ー类生物学利用率高，在瘤胃或单胃内酸环境下的稳定性好的有机微量元素具有十分重要的市场意义。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种小肽螯合锌复合物的制备方法。本发明所采用的技术方案是
ー种小肽螯合锌复合物的制备方法，包括如下步骤
1)将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；
2)将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30 37°C下振荡培养18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，继续酶解6 12h，得到小肽发酵液；或者是往培养液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接种芽孢菌，30 37°C下继续振荡培养18 30h，得到小肽发酵液； 3)測定小肽发酵液中小肽的含量，灭酶后，继续加入水溶性锌盐，混合均勻，控制反应温度在55 65 °C，pH为5 6，进行螯合反应；
4)将反应产物干燥，得到小肽螯合锌复合物。所述蛋白原料为豆柏、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、马铃薯蛋白、菜柏、大豆浓缩蛋白中的至少ー种。所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少ー种。以上原料均可在原料市场购得。姆IOOml培养液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。所述芽孢菌为地衣芽孢杆菌iBaciIlus Iicheniformis)或/和枯草芽孢杆菌{BeilIus subtilis、或 I 和纳豆芽抱杆菌CfeciBw1S natto、。所述芽孢菌的接种浓度为5 X IO7 IOX 107cfu/ml培养液。所述蛋白酶为中性蛋白酶，加入量为400 700 U/g蛋白原料。步骤3)中，小肽与水溶性锌盐的摩尔比为I 3 :1。所述水溶性锌盐为硫酸锌、氯化锌、碳酸锌、こ酸锌中的至少ー种。上述方法制备得到的小肽螯合锌复合物作为饲料添加剂的应用。本发明的有益效果在于
本发明小肽螯合锌制备方法的螯合率高，达到94%以上，所得到的小肽螯合锌复合物在动物胃内的稳定性好，营养更加全面，可用作饲用添加剤，补充日粮的微量元素，提高动物体的免疫机能。
图I是标准蛋白的分子量和出峰时间曲线2是小肽发酵液凝胶G-15洗脱图谱。
具体实施例方式以下实施例中所用到的菌液按以下方法制备
从斜面试管培养基中刮取ー环地衣芽孢杆菌(ガaciBiAs Iicheniformis)或枯草芽孢杆菌iBcillus JrY1S)或纳豆芽孢杆菌{Bacillus菌种加入到液体培养基中,摇
瓶培养。摇瓶种子培养基与培养条件为葡萄糖1%、酵母膏O. 5%、蛋白胨O. 5%、牛肉膏O. 5%、食盐O. 05%、磷酸ニ氢钾O. 1%。pH=7. 0-7. 2、121°C灭菌18分钟。于32°C恒温摇床中，200r/min振荡培养24h，得到菌种液。以上三个菌种购自广东省微生物菌种保藏中心，地衣芽孢杆菌(McilliisIi cheni formi s )和枯草芽抱杆菌subtil is、的编号分别为 GIM1. 8=AS1. 518,GIM1. 19=AS1. 210。以下实施例中所用到的中性蛋白酶购自肇东市日成酶制剂有限公司，商品型号为AS. 1398，酶活力为 50000U/g。以下实施例中所用到的检测方法和计算公式如下所示
一、检测小肽发酵液中小肽的含量及小肽转化率
I、原理 小肽发酵液中的大分子蛋白质和肽链较长的多肽用三氯醋酸溶液进行沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后经离心、过滤、消化、蒸懼，测定其蛋白质含量即酸溶蛋白。本方法參照大豆肽粉(Soy peptides powder)中华人民共和国轻エ行业标准(QB/ T 2653 -2004)修订而成。2、试剂及仪器
IOOml烧杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白质测定试剂和装置；15%三氯醋酸溶液(TCA溶液)；4500转/分钟的离心机。3、方法
取样将小肽发酵液搅拌均匀后，取IOml样品，80°C烘干，准确称重，用于测定小肽含量，重复三次。具体步骤如下
样品用水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，无损的移入IOOml容量瓶中，定容至刻度(100 ml总样本液)静止10分钟。摇动容量瓶取15ml浑浊液用离心机4500转离心10分钟，取IOml上清液注入试管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，静止沉降15分钟后，用定性滤纸过滤。取滤液IOml (相当于用于消化的样本液为5ml)注入干燥的消化管中，加入硫酸铜O. 2g，硫酸钠3g，再加浓硫酸10ml，消化方法及蒸馏方法与凯氏定氮法相同。样品中肽含量的计算公式
权利要求
1.ー种小肽螯合锌复合物的制备方法，包括如下步骤1)将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；2)将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30 37°C下振荡培养18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，继续酶解6 12h，得到小肽发酵液；或者是往培养液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接种芽孢菌，30 37°C下继续振荡培养18 30h，得到小肽发酵液；3)測定小肽发酵液中小肽的含量，灭酶后，继续加入水溶性锌盐，混合均勻，控制反应温度在55 65 °C，pH为5 6，进行螯合反应；4)将反应产物干燥，得到小肽螯合锌复合物。
2.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于所述蛋白原料为豆柏、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、马铃薯蛋白、菜柏、大豆浓缩蛋白中的至少ー种。
3.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少ー种。
4.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于每IOOml培养液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。
5.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于所述芽孢菌为地衣芽抱杆菌{Bacillus licheniformi s')或/和枯草芽抱杆菌iBcillus subtil is)或/和纳豆芽抱杆菌(ifeciBiAs natto)。
6.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于所述芽孢菌的接种浓度为5 X IO7 IOX 107cfu/ml培养液。
7.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为中性蛋白酶，加入量为400 700 U/g蛋白原料。
8.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于步骤3)中，小肽与水溶性锌盐的摩尔比为I 3 :1。
9.根据权利要求I所述的小肽螯合锌复合物的制备方法，其特征在于所述水溶性锌盐为硫酸锌、氯化锌、碳酸锌、こ酸锌中的至少ー种。
10.权利要求I 9任ー项的方法制备得到的小肽螯合锌复合物作为饲料添加剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小肽螯合锌复合物的制备方法与应用。制备方法包括如下步骤将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；将芽孢菌和蛋白酶接种到灭菌后的培养液中，发酵酶解或酶解发酵，得到小肽发酵液；继续加入水溶性锌盐，控制反应温度在55～65℃，pH为5～6，螯合反应；将反应物干燥，得到小肽螯合锌复合物。本发明小肽螯合锌制备方法的螯合率高，达到94%以上，所得到的小肽螯合锌复合物在动物胃内的稳定性好，并含有多种生物活性成分，营养更加全面，可用作饲用添加剂，补充日粮的微量元素，提高动物体的免疫机能。
文档编号C12R1/07GK102827909SQ20121027291
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者潘军, 张伟强, 王瑞平, 苏全, 马春平 申请人:广州市博善生物饲料有限公司