专利名称：一种修复硝基甲苯污染土壤的菌剂及使用方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种修复硝基甲苯污染土壤的菌剂及其使用方法。
背景技术：
TNT(2，4，6三硝基甲苯)是目前产量最高的生产炸药，近年来弹药车间中TNT的制造、加工和包装已经导致土壤高浓缩的污染，最终将导致地下水的污染。人长期暴露于硝基甲苯会增加患贫血症和肝功能不正常的机会。注射了或吸入三硝基甲苯的动物亦发现会影 响血液和肝脏、脾脏发大和其他有关免疫系统的坏影响。亦有证据证明了 TNT对男性的生殖功能有不良影响，而TNT也被列为一种可能致癌物。目前，该类污染物处理难度较大。现有技术中对硝基甲苯污染处理的方式主要有物理方法吸附法和萃取法；化学法浓缩焚烧法、紫外照射法、臭氧及组合臭氧氧化法等；然而，物理方法、化学方法处理三硝基甲苯废水，操作复杂，费用贵，治理不彻底，效果令人不堪满意。生物法是利用生物的新陈代谢作用对废水中的污染物进行转化，使之无害化的处理方式。硝基甲苯类化合物降解菌对硝基甲苯的彻底降解是十分必需的。许多化工厂已经应用降解性微生物处理硝基甲苯，并且已经取得了显著的效果。但是还不能完全满足实际的需要，因此，开发一种建设投资少、运行成本低、处理效率好的修复硝基甲苯污染土壤的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于修复硝基甲苯污染土壤的菌剂和利用高效复合菌剂处理污染土壤的方法。本发明的高效复合微生物菌剂，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，其制备方法简便，方法易行，其操作简便，利于生产。本发明是采用如下技术方案实现的—种修复硝基甲苯污染土壤的菌剂，该菌剂的活性成分包括下列重量百分比的原料亚硝化菌30 %，枯草芽孢杆菌15 %，粪产碱杆菌10 %，铜绿假单孢菌10 %，酿酒酵母10%，红球菌10%，巨大芽孢杆菌8%，黑曲霉7%。上述菌剂中所述亚硝化菌优选为亚硝化菌(Nitrosomonas europaea) CCTCC No M2010002 (CN101955885 公开使用)；所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC No 0954(CN1554744 公开使用)；所述幾产喊杆菌优选为幾产喊杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555(例如参见文献 Structural studies of an extracellular polysaccharide (S-130) elaboratedby AlcaligenesATCC31555, Carbohydrate Research,1986)；
所述铜绿假单孢菌优选为铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC15442 (例如参见文献 Adaptation of Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 todidecyIdimethyIammonium bromide induces changes in membrane fatty acidcomposition and in resistance of cells, Journal of Applied Microbiology,2001);所述酿酒酵母优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC No M208110 (CN101434911 公开使用)；所述红球菌优选为红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 15906(例如参见Cloning and Characterization of Benzoate Catabolic Genes in the Gram-PositivePolychlorinated Biphenyl DegraderRhodococcus sp.Strain RHAl, J.Bacteriol.November 2001)；所述巨大芽孢杆菌优选为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium) CGMCC No:2267(CN101215532)；所述黑曲霉优选为黑曲霉(Aspergillusnige)CCTCC No :M206034(CN1924000)。本发明所述菌种均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)以及美国模式培养物集存库(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)购买得到。其中各菌种发酵液制备步骤是I、各种菌种的单独扩大培养A、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的培养将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌试管种首先接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，28-30°C，作一级斜面培养，然后接种到三角瓶里做振荡二级液体培养，然后转入液体发酵罐做三级液体培养，最后接种到固体培养基上作四级培养，至产品中活菌数达到2. 0-4. OXlO8个/克。 B、红球菌的培养将红球菌菌种分别接种在营养肉汤培养基(参照微生物学试验课本)上，28-30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到 2. 0-5. OX IO8 个 / 克。C、酿酒酵母或黑曲霉的培养酿酒酵母或黑曲霉首先接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28-30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到I. 0-5. OXlO8个/克。D、铜绿假单孢菌培养或粪产碱杆菌铜绿假单孢菌或粪产碱杆菌首先在培养基上，28-30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到
I.0-5. OXlO8 个 / 克，所述培养基成分为=NH4Cl I. 0g, CH3COONa 3. 5g, MgCl2 0. lg, CaCl2
0.lg, KH2PO4 0. 6g, K2HPO4 0. 4g，酵母膏 0. lg，水 IOOOmI，ρΗ7· 2。Ε、亚硝化菌的培养亚硝化菌首先在培养基上，28_30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到I. 0-5. OX IO8个/克，所述培养基成分为2%葡萄糖(w/v)，I. 5%牛肉膏(w/v), I. 5%蛋白胨(w/v),0. 058%硫酸镁(w/v)，O. 025%硫酸锰(w/v),0. 22%乙酸钠(w/v),0. 2%磷酸氢二钾(w/v)，溶剂为水；将以上亚硝化菌、枯草芽孢杆菌、粪产碱杆菌、铜绿假单孢菌、酿酒酵母、红球菌、巨大芽孢杆菌、黑曲霉，所培养的菌液按照质量比例混合得到液体菌剂；F、取上述液体菌剂与载体搅拌混合，优选以硅藻土(40-80目)为载体，按照菌剂载体为3-4 I的重量比混合。干燥将混合好物料进行干燥，干燥温度为20-50°C，干燥后含水量为20-30% ;检验、包装按质量标准检验，成品按重量进行包装，即得固体制剂。注，上述步骤中菌种扩大培养及制备固体制剂的方法不是唯一的，本领域技术人员可以根据常识选择合适的培养基及扩大培养方法，使活菌数达到IO8个/克，以及按照常规制备微生物固体制剂的方法制备。本发明的复合菌剂将各种能形成优势菌群的菌种，配制成高效微生物制剂，能够加速微生物对污染物的降解，以提高系统的生物处理效率，保证系统稳定运行。其含有多种对难降解污染物有优良降解能力的微生物，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，活性高，生物量大，繁殖快，对硝基甲苯污染土壤有良好的降解效果。
具体实施方式
实施例I :一种修复硝基甲苯污染土壤的菌剂，该菌剂的活性成分包括下列重量百分比的原料亚硝化菌30 %，枯草芽孢杆菌15 %，粪产碱杆菌10 %，铜绿假单孢菌10 %，酿酒酵母10%，红球菌10%，巨大芽孢杆菌8%，黑曲霉7%。上述菌剂中所述亚硝化菌优选为亚硝化菌(Nitrosomonas europaea) CCTCC No M2010002 (CN101955885 公开使用)；所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No :0954 ；所述幾产喊杆菌优选为幾产喊杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555 ；所述铜绿假单孢菌优选为铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC15442 ；所述酿酒酵母优选为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CCTCC No M208110 ；所述红球菌优选为红球菌(Rhodococcusrhodochrous) ATCC15906 ；所述巨大芽孢杆菌优选为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium) CGMCC No:2267 ；所述黑曲霉优选为黑曲霉(Aspergillusnige)CCTCC No :M206034。本发明所述菌种均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)以及美国模式培养物集存库(ATCC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买得到。其中各菌种发酵液制备步骤是I、各种菌种的单独扩大培养A、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的培养将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌试管种首先接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，28-30°C，作一级斜面培养，然后接种到三角瓶里做振荡二级液体培养，然后转入液体发酵罐做三级液体培养，最后接种到固体培养基上作四级培养，至产品中活菌数达到2. 0-4. OXlO8个/克。B、红球菌的培养将红球菌菌种分别接种在营养肉汤培养基(参照微生物学试验课本)上，28-30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到 2. 0-5. OX IO8 个 / 克。C、酿酒酵母或黑曲霉的培养酿酒酵母或黑曲霉首先接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28-30°C ，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到I. 0-5. OXlO8个/克。D、铜绿假单孢菌培养或粪产碱杆菌铜绿假单孢菌或粪产碱杆菌首先在培养基上，28-30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到
I.0-5. OXlO8 个 / 克，所述培养基成分为=NH4Cl I. 0g, CH3COONa 3. 5g, MgCl2 O. lg, CaCl2
O.lg, KH2PO4 O. 6g, K2HPO4 O. 4g，酵母膏 O. lg，水 IOOOmI，ρΗ7· 2。Ε、亚硝化菌的培养亚硝化菌首先在培养基上，28_30°C，作一级斜面培养，然后二级种子培养、混合发酵培养等至产品中活菌数达到I. 0-5. OX IO8个/克，所述培养基成分为2%葡萄糖(w/v)，I. 5%牛肉膏(w/v), I. 5%蛋白胨(w/v),O. 058%硫酸镁(w/v)，
O.025%硫酸锰(w/v), O. 22%乙酸钠(w/v), O. 2%磷酸氢二钾(w/v)，溶剂为水；将以上亚硝化菌、枯草芽孢杆菌、粪产碱杆菌、铜绿假单孢菌、酿酒酵母、红球菌、巨大芽孢杆菌、黑曲霉，所培养的固体菌剂按照质量比例混合得到液体菌剂；F、取上述液体菌剂与载体搅拌混合，优选以硅藻土(40-80目)为载体，按照菌剂载体为3-4 I的重量比混合。干燥将混合好物料进行干燥，干燥温度为20-50°C，干燥后含水量为20-30% ;检验、包装按质量标准检验，成品按重量进行包装，即得固体制剂。注，上述步骤中菌种扩大培养及制备固体制剂的方法不是唯一的，本领域技术人员可以根掘常识选择合适的培养基及扩大培养方法，使活菌数达到IO8个/克，以及按照常规制备微生物固体制剂的方法制备。实施例2硝基甲苯污染土壤修复实验将三硝基甲苯TNT200g+ 二硝基甲苯DNT200g+硝基甲苯IOOg总质量为500g，于I立方米的无污染土壤混合均匀，搅拌干燥，过20目筛后备用。首先将上述污染土壤铺展30厘米厚度的薄层，将实施例I制备的菌剂均匀撒于本实验所制备的硝基甲苯污染土壤表层，其中菌剂和土壤的重量比例为I : 2000，然后喷洒水，保持土壤含水量为30%，48小时后，检测硝基甲苯的含量，三硝基甲苯TNT为Og/立方米、二硝基甲苯为2. Ig/立方米以及硝基甲苯的含量为O. 5g/立方米，说明该菌剂已经基本上完全降解了土壤中的硝基苯类物质。实施例3采用本发明实施例I制备的菌剂处理某炸药厂附近的污染土壤，经检测土壤中三硝基甲苯的含量为320g/立方米、二硝基甲苯为72g/立方米以及硝基甲苯183g/立方米；首先将土壤翻松平整，喷洒水，保持土壤含水量为30%，然后按照每立方米土壤使用500g菌剂的添加量播撒菌剂，2天后，检测硝基苯的含量，其中，三硝基甲苯的含量为Og/立方米、二硝基甲苯为I. 3g/立方米以及硝基甲苯O. 6g/立方米。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式
对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种修复硝基甲苯污染土壤的菌剂，该菌剂的活性成分包括下列重量百分比的原料 亚硝化菌30 %，枯草芽孢杆菌15 %，粪产碱杆菌10 %，铜绿假单孢菌10 %，酿酒酵母10%，红球菌10%，巨大芽孢杆菌8%，黑曲霉7%。
2.如权利要求I所述的菌剂，其特征在于 所述亚硝化菌优选为亚硝化菌(Nitrosomonas europaea) CCTCC No M2010002 (CN101955885 公开使用)； 所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) CGMCC No :0954 ； 所述幾产喊杆菌优选为幾产喊杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555 ； 所述铜绿假单孢菌优选为铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 15442 ； 所述酿酒酵母优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC No M 208110 ； 所述红球菌优选为红球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 15906 ； 所述巨大芽孢杆菌优选为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)CGMCC No :2267 ； 所述黑曲霉优选为黑曲霉(Aspergillus nige)CCTCC No :M206034。
3.权利要求1-2任一菌剂在硝基甲苯污染土壤处理中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种修复硝基甲苯污染土壤的菌剂及使用方法，它由下述重量百分比原料配制而成亚硝化菌30％，枯草芽孢杆菌15％，粪产碱杆菌10％，铜绿假单孢菌10％，酿酒酵母10％，红球菌10％，巨大芽孢杆菌8％，黑曲霉7％。本发明的菌剂各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，对硝基甲苯类难降解的化合物有良好的降解效果。
文档编号C12R1/11GK102864108SQ20121036449
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者马小杰, 闫家怡 申请人:马小杰