专利名称：抗a、抗b血型定型试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用杂交瘤技术生产杂交瘤细胞及由其制备的单克隆抗体和血型定型试剂。
背景技术：
自Landsteinor (1900)发现ABO血型以来,血型鉴定试剂主要用人血清,存在着个体间差异较大、质量不稳定、成本高、需耗用大量人血等问题。多年来各国学者一直致力寻找一种理想的试剂代替人血清，先后用鱼类、蜗牛、扁豆等动植物组织浆液进行研究，但由于种种问题未能普及推广应用。Voak(1980)和Sacks(1981)用淋巴细胞杂交技术先后建立了分泌抗A型、抗B型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其用于ABO系统血型鉴定。迄今已有几株具有良好特性的抗A、抗B是可用的，其中1983年英国剑桥医学研究所分子生物 学实验室研制的ABO血型系统McAb已达到美国食品和药品管理局(FDA)的技术标准，获准由英国特别生物技术公司(Celltech)大批生产并销往西欧、美洲和日本市场；1987年法国(CNTS)和日本出售同类产品。据美国波士顿生物医学咨询公司调查，血液制品的McAb以92%的年增长率递增，1990年达到I亿3千万美元。如今，在世界各国，ABO血型单克隆抗体试剂已成为常规试剂，在我国抗A、抗B单克隆抗体血型试剂占所有临床应用的ABO血型试剂总量90%以上。我国是一个13亿人口的大国，对血型定型试剂需求量非常大，而目前市场上供应的血型定型试剂在质量和数量上不能满足市场的需求。目前市场上抗A抗B试剂生产用细胞株由于细胞培养分泌上清抗体盐水凝集效价不够国家标准，为达到国家标准，在试剂中添加少量腹水，这样会大大增加成本，而且由于腹水中杂抗体会对试剂结果产生干扰。由此，开发安全可靠、性价比高的抗A、抗B单克隆抗体血型试剂具有较大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种交杂瘤细胞，其保藏编号分别为CCTCCC201215和CCTCC C201216 ;分别由人A血型红细胞、人B血型红细胞免疫小鼠后制备获得。本发明的另一个目的是提供上述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体，所述单克隆抗体分别为A血型的单克隆抗体和B血型的单克隆抗体。本发明的又一个目的是提供了包含所述A血型的单克隆抗体和B血型的单克隆抗体的血型定型试剂；进一步提供了包含所述试剂的试剂盒及其使用方法。本发明的抗A和抗B单抗细胞株由于分泌上清的抗体盐水凝集效价很高，达到甚至超过国家标准，且经实验证明所述抗A抗B单克隆抗体可完全满足临床血型筛查的需求，具有特异性强、稳定性好、生产成本低等优点，各项指标达到国内外同类产品的水平。生物材料的保藏信息分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别命名为9H5和8G9，于2012年9月18日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC C201215和CCTCC C201216。
具体实施例方式以下实施例有助于进一步了解本发明的优点和特点，不应视为对本发明的限制。所使用的实验材料如无特别说明均为普通市售。实施例I抗A抗B血型单克隆抗体的制备_2] I.免疫方法和程序:免疫原分别采用人A血型红细胞、人B血型红细胞。免疫动物(湖北省实验动物中心提供)BALB/C小鼠，雌性，6_8周龄。方法A型或B型红细胞分别用生理盐水洗涤两次并调制成I亿/每毫升浓度；对免疫动物进行多点注射，每隔一周注射一次，第四针加强后三天取脾脏细胞用于细胞融合。
2.单杭制各2. I细胞融合融合用骨髓瘤细胞用小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0 (P2-X_Ag8 · 6 · 5 · 3)(购自中国科学院武汉病毒研究所病毒保藏中心)，为Ig非分泌型。融合方法(I)制备饲养细胞采用BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，作为融合时的饲养细胞；取BALB/C小鼠一只，拉颈处死，75 %乙醇浸泡5分钟，在无菌操作下，用不含小牛血清RPMI1640培养基注入腹腔冲洗，并吸出冲洗液，如此反复4次，洗液用不含小牛血清的RPMI1640培养基洗涤2次，计数，用含20%小牛血清的RPMI1640培养基配制成I. 0X106个/ml的细胞悬液；于96孔板中按50微升/孔滴加。(2)细胞融合取加强免疫后第三天的小鼠，摘眼球放血，拉颈处死，置75%酒精浸泡5分钟，无菌操作取出脾脏，并用眼科剪刀将其剪成数段，放入盛有不含小牛血清RPMI1640培养基的IOml圆底塑料管中，用外包塑料王的研磨棒挤压出脾细胞，静置数分钟，取出细胞悬液，并用不含小牛血清RPMI1640培养基混合，离心洗涤两次，弃上清，计数，配制成细胞悬液；将SP2/0细胞与免疫脾细胞按I : 5比例混合，于4°C、1400rpm离心10分钟，吸净上清，加入50% PEG (Sigma P7181)处理，在5分钟内慢慢加入IOml不含小牛血清的RPMI1640培养基，在IOOOrpm条件下离心10分钟，弃上清，加入含20%小牛血清的RPMI1640培养基配制的HAT (Sigma H0262)中，然后接种到96孔细胞培养板上，于融合后第10-14天挑选有杂交瘤细胞生长的孔，吸取培养上清液进行筛选，并换以HT培养基。2. 2筛诜和克降化筛选采用血凝试管滴定法。方法如下准备一排试管，第一管加入300 μ I生理盐水和100 μ I上述融合细胞培养上清，其它各管分别加入200 μ I生理盐水，做倍比稀释。然后每管中加入200 μ I 2%的红血球，混匀，室温18°C -25°c放置15分钟，IOOOrpm离心I分钟，观察结果。沉淀血块摇动，有不散的血凝块判为阳性。如全部散开无血凝块为阴性。克隆和再克隆采用有限稀释法，在96孔细胞培养板中进行。取阳性孔细胞计数，用含20%小牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞至含量为5个细胞/ml，接种于一块96孔板中，每孔O. 2ml，第10-14天采用间接检测，挑选强阳性孔细胞扩大培养后冻存和再克隆，以连续两次克隆阳性率100%为止；其中，A型或B型免疫小鼠与SP2/0骨髓瘤融合经初步筛选，满足以下条件克隆挑出进行再克隆上清只与免疫血型反应而与其它血型没有交叉反应，上清凝集效价大于I : 64，结果分别从A和B融合细胞中筛选出3个和4个符合上述条件的克隆，并制备对应腹水测滴度，结果见下表I和表2所示表I. A型杂交瘤细胞组织培养上清液和对应腹水的凝血滴度
权利要求
1.一种血型定型试剂，包括 抗A型血型定型试剂，所述试剂含有抗A型血红细胞的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC C201215的杂交瘤细胞株制备； 抗B型血型定型试剂，所述试剂含有抗B型血红细胞的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC C201216的杂交瘤细胞株制备。
2.包括权利要求I所述的血型定型试剂的检测试剂盒。
3.抗A型血型单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCC201215的杂交瘤细胞制备。
4.抗B型血型单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCC201216的杂交瘤细胞制备。
5.一种血型定型方法，包括将待测样品与权利要求I所述的血型定型试剂接触，确定所述待测样品的血型。
全文摘要
本发明提供了抗A、抗B血型的单克隆抗体及生成所述单克隆抗体的交杂瘤细胞，其保藏编号分别为CCTCC C201215和CCTCC C201216；所述杂瘤细胞分别由人A血型红细胞、人B血型红细胞免疫小鼠后筛选获得。本发明还进一步提供了含所述单克隆抗体的试剂及相关试剂盒。
文档编号C12N5/20GK102944684SQ201210440828
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者黄韫韬, 严兵, 尹娟, 刘非 申请人:武汉康莱博生物科技有限公司