林可霉素发酵用复合蛋白粉的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种林可霉素发酵用复合蛋白粉，其由以下质量百分比的组分组成：20％～25％的冷榨黄豆粉、15％～30％的花生饼粉、10～25％的棉籽蛋白粉和20％～55％的鱼粉。本发明的复合蛋白粉经200L发酵罐验证发酵单位可达至9561μg/ml，大幅领先目前国内的平均水平，具有很好的应用价值。
【专利说明】林可霉素发酵用复合蛋白粉
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种林可霉素发酵用复合蛋白粉。
【背景技术】
[0002]自20世纪60年代发现林可霉素(Iincomycin)以来，林可霉素的发酵产率有了大幅度的提高。但是，一般企业生产过程中普遍存在发酵中后期菌丝断裂严重并提前发生自溶的问题，大大影响了林可霉素的生物合成速率以及有效生物合成时间。研究表明，高浓度游离氨基氮和溶解磷能促进细胞的生长和繁殖，可以缩短菌体繁殖所需要的时间，而同时又抑制许多抗生素的生物合成，对工业生产具有重要的指导意义。中国专利申请CN101092597A公开了一种生产林可霉素用复合培养基，其发酵液林可霉素生物效价在7200单位/毫升左右。林可霉素及其衍生物依然是临床上使用量较大的抗生素，因此，亟需解决目前林可霉素发酵生产中存在的问题提高发酵单位。
【发明内容】
[0003]本发明针对林可霉素发酵过程中菌丝提前自溶而影响产物生物合成的问题，根据林可霉素的代谢特性，采用多种动植物蛋白复配并筛选得到一种复合蛋白粉，经200L发酵罐验证发酵单位可达至9561 μ g/ml，具有很好的应用价值。
[0004]因此，本发明目的在于提供一种林可霉素发酵用有机蛋白粉，以利于提高林可霉素的发酵水平。
[0005]本发明提供的复合蛋白粉由多种动植物蛋白复配并筛选得到，该复合氮源含有丰富的蛋白质、氨基酸、植物多糖、维生素及核酸。
`[0006]本发明的林可霉素发酵用复合蛋白粉的特征在于，其由以下质量百分比的组分组成:20 %~25 %的冷榨黄豆粉、15 %~30 %的花生饼粉、10~25 %的棉籽蛋白粉和20 %~55%的鱼粉。
[0007]根据本发明一个优选的实施方式，林可霉素发酵用复合蛋白粉由以下质量百分比的组分组成:20%~25%的冷榨黄豆粉、20%~25%的花生饼粉、15~20%的棉籽蛋白粉和35%~40%的鱼粉。
[0008]本发明中所述复合蛋白粉总氮含量为52.5% -55.5%、氨基氮含量为12.5% -14.5%、总磷含量为 1.6% -1.9%.[0009]本发明的复合蛋白粉能够显著减缓菌丝自溶和提高林可霉素的生物合成速率，从而提高发酵效价。经200L发酵罐验证发酵单位可达至9561 μ g/ml，大幅领先目前国内的平均水平，具有很好的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为如实施例1所述不同种类氮源对林可霉素发酵效价的影响；[0011]图2为如实施例4所述发酵罐中不同氮源对林可霉素发酵效价的影响；
[0012]图3为如实施例4所述不同含量的复合蛋白粉发酵168h时的菌丝形态。
【具体实施方式】
[0013]以下结合具体的实施例，对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0014]本发明中所用的原料来源如下:冷榨黄豆粉、花生饼粉、棉籽蛋白粉、鱼粉、玉米浆、泡敌、硅油等购自河南天方药业股份有限公司；可溶性淀粉购自国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖购自上海西王淀粉糖有限公司；其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
[0015]菌种:林可链霉菌Streptomyces lincolnensis SIP1-A.2118,由河南省天方药业有限公司提供。
[0016]斜面培养基(g/L):可溶性淀粉20，冷榨黄豆粉5，K2HPO40.5，NaCl0.5，KNO3I,MgSO4.7Η200.5，FeSO4.7Η200.01，琼脂 22，ρΗ7.0 ~7.5 ;121°C 灭菌 30min。
[0017]种子培养基(g/L):可溶性淀粉20，葡萄糖15，冷榨黄豆粉20，玉米浆25，(NH4)2S042, CaC034, ρΗ6.5 ~7.5 ; 121。。灭菌 30min。
[0018]原始摇瓶发酵培养基( g/L):淀粉15，葡萄糖65，冷榨黄豆粉25，玉米浆15，(NH4)2S048, NaN038, NaCl5，KH2PO40.2，CaC038, ρΗ6.5 ~7.5 ; 121。。灭菌 30min。
[0019]原始发酵罐培养基(g/L):淀粉10，葡萄糖50，冷榨黄豆粉15，玉米浆15，(NH4) 2S044, NaN034, NH4N034, NaCl5, KH2PO40.5，CaC038，泡敌 0.35，硅油 0.25，ρΗ6.5 ~7.5 ;121°C 灭菌 30min。
[0020]稀料培养基(g/L):玉米浆150，冷榨黄豆粉90，CaC036，泡敌1，硅油I。
[0021]培养条件:斜面、种子、摇瓶及发酵罐发酵均采用30°C培养，培养周期分别为7~10d、2d、7d和8d，摇瓶培养的培养基装量为100ml/750ml，转速220r/min。发酵罐中稀料采用分批补料的方式，每隔12小时补一次，补料量为发酵液总体积的2%。
[0022]HPLC检测条件:色谱柱ODS C18，4.6mmX 250mm, 5 μ m ;检测波长:214nm ;进样量:10 μ L ;流速:0.8ml/min ;柱温:35°C ；
[0023]流动相:0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液调pH至6.1):甲醇=50: 50
[0024]实施例1-3:复合蛋白粉用于林可霉素发酵与原配方对比
[0025]实施例1
[0026]复合蛋白粉的质量百分比组成为:冷榨黄豆粉25%，花生饼粉30%，棉籽蛋白粉15%,鱼粉30%。所述复合蛋白粉的总氮含量52.5%、氨基氮含量14.5%、总磷含量1.9%。
[0027]以原始摇瓶发酵培养基(摇瓶发酵单位3500yg/ml左右)为对照，以不同氮源(棉籽蛋白粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、玉米蛋白粉、酵母膏、牛肉膏和实施例1所述的复合蛋白粉)替代对照组中10g/L的冷榨黄豆粉，考察氮源对林可霉素生物合成的影响。结果见图1，其中棉籽蛋白粉、蛋白胨和本发明实施例1的复合蛋白粉均能提高林可霉素的生物合成，尤其是使用本发明实施例1的复合蛋白粉作氮源，林可霉素的发酵效价可提高至 4500 μ g/ml。
[0028]实施例2[0029]复合蛋白粉的质量百分比组成为:冷榨黄豆粉20%，花生饼粉25%，棉籽蛋白粉10%,鱼粉45%。所述复合蛋白粉的总氮含量55.5%、氨基氮含量12.5%、总磷含量1.6%。
[0030]以原始摇瓶发酵培养基为对照，用实施例2的复合蛋白粉替代原始摇瓶发酵培养基中20g/L的冷榨黄豆粉，考察对林可霉素生物合成的影响。最终林可霉素的发酵效价可提高至 4650 μ g/ml ο
[0031]实施例3
[0032]复合蛋白粉的质量百分比组成为:冷榨黄豆粉20%，花生饼粉30%，棉籽蛋白粉25 %，鱼粉25 %。所述复合蛋白粉的总氮含量53 %、氨基氮含量13 %、总磷含量1.7%。
[0033]以原始摇瓶发酵培养基为对照，用实施例3的复合蛋白粉完全替代原始摇瓶发酵培养基中的冷榨黄豆粉，考察对林可霉素生物合成的影响。结果林可霉素的发酵效价可提高至 4695 μ g/ml ο
[0034]以上实验表明，复合蛋白粉可以完全替代原始摇瓶培养基中的冷榨黄豆粉，并能提高林可霉素的发酵单位。
[0035]实施例4:复合蛋白粉用于林可霉素发酵罐工艺
[0036]复合蛋白粉的质量百分比组成为:冷榨黄豆粉25%，花生饼粉20%，棉籽蛋白粉15%，鱼粉40%。所述复合蛋白粉的总氮含量54%、氨基氮含量13.5%、总磷含量1.8%。
[0037]以原始发酵罐培养基为对照，分别用5g/L、10g/L、15g/L的实施例4的复合蛋白粉替代原始发酵罐培养基配方中的冷榨黄豆粉。同时，稀料培养基中90g/L的冷榨黄豆粉也按相同的比例用30g/L、60g/L、90g/L的实施例4的复合蛋白粉替代。考察在200L发酵罐中，复合蛋白粉对林可霉素发酵是否有促进作用，结果如图2所示。结果表明，复合蛋白粉替代冷榨黄豆粉后发酵单位较原始发酵罐培养基配方的5900μ g/ml分别提高16%、39%、63%，其中复合蛋白粉完全替代原始发酵罐培养基`配方中15g/L的冷黄豆粉时，林可霉素的发酵单位达到了 9561 μ g/ml。而且利用复合蛋白粉替代冷黄豆粉后，能够显著减缓菌丝自溶和提高林可霉素的生物合成速率，从而提高发酵效价(图3)。从图3可以看出，用复合蛋白粉替代冷榨黄豆粉进行林可霉素发酵时，在发酵后期能够保持良好的菌丝状态要，明显减少菌丝的断裂现象(对照组)，从而维持产抗活力提高发酵单位。
【权利要求】
1.林可霉素发酵用复合蛋白粉，其特征在于，其由以下质量百分比的组分组成:20%~25%的冷榨黄豆粉、15%~30%的花生饼粉、10~25%的棉籽蛋白粉和20%~55%的鱼粉。
2.根据权利要求1所述的林可霉素发酵用复合蛋白粉，其特征在于，其由以下质量百分比的组分组成:20%~25%的冷榨黄豆粉、20%~25%的花生饼粉、15~20%的棉籽蛋白粉和35%~40%的鱼粉。
3.根据权利要求1或2所述的林可霉素发酵用复合蛋白粉，其特征在于，所述复合蛋白粉的总氮含量为52.5% -55.5%、氨基氮含量为12.5% -14.5%、总磷含量为.1.6% -1.9%。
【文档编号】C12P19/64GK103805658SQ201210454439
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月13日 优先权日:2012年11月13日
【发明者】李继安, 陈代杰, 林惠敏, 蓝鸿, 毛全贵, 张宏周 申请人:上海医药工业研究院, 河南天方药业股份有限公司