专利名称：一种基于rna干扰的抗柑橘全爪螨育种方法
技术领域：
本发明属于育种技术领域，尤其涉及一种基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法。
背景技术：
柑橘全爪螨是一种世界性柑橘害螨，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗性药。基于RNA干扰技术获得抗昆虫的转基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。昆虫几丁质酶参与昆虫(螨类)蜕皮、围食膜降解和防御等重要生命活动，通过柑橘全爪螨几丁质酶基因构建RNA干扰载体，进而获得转基因柑橘材料对柑橘全爪螨进行控制具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法，旨在解决利用RNA干扰技术进行育种的问题。
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本发明实施例是这样实现的，一种基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法，该育种方法从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出几丁质酶基因Unigenel0731，进行真实性检测后应用RACE技术获得全长序列，然后在NCBI上搜索比对保守序列，合成对应的dsRNA，将正、反向几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi载体“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，将此RNAi载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染，进而对转基因柑橘苗木进行抗螨性评价，获得抗柑橘全爪螨的转基因材料。进一步，通过柑橘全爪螨转录组搜索，获得几丁质酶基因Unigenel0731,然后RACE扩增全长基因，NCBI上比对找出保守序列设计构建dsRNA。进一步，将正向目标基因10731P1F1质粒双酶切，同时将载体PFGC5941质粒用相同两个酶酶切；用T4连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物P1，F1PCR检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC-10731P1F1”；将得到的“PFGC-10731P1F1”质粒双酶切，同时相同酶切反向目标基因10731P2F2，T4连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到“PFGC5941-正向片段10731P1F1/反向片段10731P2F2”。进一步，将获得的农杆菌LBA4404菌株侵染外植体，并进行抗柑橘全爪螨评价将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接。提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS基因序列的特异引进行扩增、电泳检测；最终对转基因柑橘苗进行抗柑橘全爪螨评价，选取抗性高的材料备用。本发明应用几丁质酶在昆虫发育过程中的调控作用，通过柑橘全爪螨几丁质酶基因构建RNA干扰载体，最终获得含特异dsRNA的转基因柑橘材料。该转基因材料在生产上的推广应用必将对柑橘全爪螨的控制发挥重要作用，同时减少化学农药使用量，因而具有极其广阔的市场前景。
图1是本发明实施例提供的基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法的实现流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。图1示出了本发明实施例提供的基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法的实现流
程。 该育种方法从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出几丁质酶基因Unigenel0731，进行真实性检测后应用RACE技术获得全长序列，然后在NCBI上搜索比对保守序列，合成对应的dsRNA，将正、反向几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi载体“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，将此RNAi载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染，进而对转基因柑橘苗木进行抗螨性评价，获得抗柑橘全爪螨的转基因材料。进一步，通过柑橘全爪螨转录组搜索，获得几丁质酶基因Unigenel0731，然后RACE扩增全长基因，NCBI上比对找出保守序列设计构建dsRNA。进一步，将正向目标基因10731P1F1质粒双酶切，同时将载体PFGC5941质粒用相同两个酶酶切；用T4连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物P1，F1PCR检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC-10731P1F1”；将得到的“PFGC-10731P1F1”质粒双酶切，同时相同酶切反向目标基因10731P2F2，T4连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到“PFGC5941-正向片段10731P1F1/反向片段10731P2F2”。进一步，将获得的农杆菌LBA4404菌株侵染外植体，并进行抗柑橘全爪螨评价将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接。提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS基因序列的特异引进行扩增、电泳检测；最终对转基因柑橘苗进行抗柑橘全爪螨评价，选取抗性高的材料备用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
基因序列表
Unigenel0731
ACGACGGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGATGTTAGTTAATGGTTAGTTGTTGACGATTCACAATTAACCTTAAGTGATACTTGACTGTTTAAATTGTGCGAAATTGTAACTTTAACATGrrACCCTTTTCGAGTTTAATTGTTACTTTCACTCTTTTATTTGGAACAATTAACTGTCAGAATTGTCCATCAAGTGAGGGATATTTTCAAGATCCTTCGAACTGTTCAAAATTTTTCTACTGTTCGAGCGGAAAAATTGTTCACAAATACGAATGCGGTTCTAATTCCGTTTTTAATCCTGACCTGAAAATCTGCGATTGGAAAGAAAACACCAAATGTGAATCTGATTCATCTCCATCATCGACCACAACAACAGCGGCTAAACCTTTGGTCGGAGAAAACGAAATTCCCGATAATTCAATTGAGACTTCAAGTTCTAACCCGCCGACTTCATCATCTACCTTTGCCCCGACAACCTCGTCAACCTCACCCTCGA.CTTCAGCCCCAACTTCCACTTCCACTTCAACTTCAACCACAACTCAAACTTCAAA'r'GTAATTGAl'GTTGAAACTGAGAAl'CCATATGAATGGCATCCACCCATTGGACCCACAACGACCGCCGAACCTGATCCAATGGAAGGTTTTAATGACGATTATAAGATCGTCTGTTATTTCACCAATTGGGCTTGGTACAGACCTCAAGGAGCAAAATTCATCCCCGAAGACACTAATTCAAAGTATTGTACTCATATCAATTATGGATTCGCTGTTCTTGATTCCTCTTCATTGACTATTAAAATTCACGATTCATGGGCTGATGTTGATAATCGTTTCTTGAAACGTGTCGCTGGTTTAAGGAAAAATAATCCACGATTGAAGGTTTTACT 丁 TCATTGGGAGGTTGGAATGATTCAGCCGGTGATAAOTACTCGAGGTTGGTGAACAATCCATCGGCTCGACGAAACTTCATTAACCATTCGATCCAATTTTTGGCCAAATTTGGTTTCGATGGGTTAGATCTCGACTGGGAGTACCCAAAGTGCTGGCAAACTACTTGTAAAGATGGACCAGAATCTGACAAGGCCAATTTCGCTCTTTTCGTTCATGAATTGAGACAAGCATATGAATCAAAAGGATGGCTATTGACCGCTGCAGTCTCACCTTCTAAACAGGTCATTGATGCTGGTTACGATGTTCCCGCTTTAGCrFAAAGACTTTGACTTCATAAACGTCATGGCCTATGATATGCACGGACAATGGGACAAGTTTGCCGCTCATCATGCACCTT1ATACCCAAGACAAGAGTCTTC-ATCATTCGACCCCAACGATGGTATiTTCAACATTAACTATACTGTTAATTACTGGATCGATCAAGGAATGCCCAAGAAAAAGGTCATTCTTGGTGTTCCTTTCTATGGTCGCTCTTTCGCCCTCGAAGGTCAAGCYGRTTCACATTCAITGAAAGGCTATGGTGCTGCTGCTCTTCAAGGAGGTGAACCGGGTACATTTACCCGAGAAAAGGGTTACCTCGCTTTCTATGAAATCTGCGACTACCAAAAGAATCAAGGTTGGACTAAGGCTCGAGATCCGACAACCGGACTGCCTTTCGCTTTCAAGGGTAACCAATGGGTCGGTTATGATGACACCGAACAGATGAGAAAGAAAAGTGAATTCATCAAGAGCCTCGACATCGGAGGTGCGATGGTCTGGGCTCTCGATCTCGACGATTTCATGGGCCGATGTTGTTCCACGAAATGGCCTTTGCTCAAGACTTTGAATGCGGGATTAAGAGGAGTTAAATCTTTCGAAGCGATTGATTGTTAATCTGATTGATAAATGATCGAAAATCTTGGGAGTGATTTCACAAAAATCGTCTTTGTTTTAATTATAAAAATGATTACATTTCTTATACGTTTGTTAAGAGGGGATATATAGAGATTTATACAGTAC
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正向片段10731P1F1为
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反向片段10731P2F2为
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GTCATGGCCTATGATATGCACGGACAATGGGACAAGTTTCGGGATCCCG
权利要求
1.一种基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法，其特征在于，该育种方法从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出几丁质酶基因Unigenel0731，进行真实性检测后应用RACE技术获得全长序列，然后在NCBI上搜索比对保守序列，合成对应的dsRNA，将正、反向几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi载体“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，将此RNAi载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染，进而对转基因柑橘苗木进行抗螨性评价，获得抗柑橘全爪螨的转基因材料。
2.如权利要求1所述的抗柑橘全爪螨育种方法，其特征在于，I)、通过柑橘全爪螨转录组搜索，获得几丁质酶基因Unigenel0731，然后RACE扩增全长基因，NCBI上比对找出保守序列设计构建dsRNA。
3.如权利要求1所述的抗柑橘全爪螨育种方法，其特征在于，将正向目标基因10731P1F1质粒双酶切，同时将载体PFGC5941质粒用相同两个酶酶切；用T4连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物Pl，FlPCR检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC-10731P1F1” ；将得到的“PFGC-10731P1F1”质粒双酶切，同时相同酶切反向目标基因10731P2F2，T4连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到“PFGC5941-正向片段10731P1F1/反向片段10731P2F2”。
4.如权利要求1所述的抗柑橘全爪螨育种方法，其特征在于，将获得的农杆菌LBA4404菌株侵染外植体，并进行抗柑橘全爪螨评价 将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接。提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS基因序列的特异引进行扩增、电泳检测；最终对转基因柑橘苗进行抗柑橘全爪螨评价，选取抗性高的材料备用。
全文摘要
本发明公开了一种基于RNA干扰的抗柑橘全爪螨育种方法，从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出几丁质酶基因Unigene10731，进行真实性检测后应用RACE技术获得全长序列，然后在NCBI上搜索比对保守序列，合成对应的dsRNA，将正、反向几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi载体“PFGC-10731P1F1/10731P2F2”，将此RNAi载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染，进而对转基因柑橘苗木进行抗螨性评价，获得抗柑橘全爪螨的转基因材料。
文档编号C12N15/84GK103045643SQ20121049231
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者冉春, 张云飞, 刘浩强, 何永睿, 陈善春, 陈飞, 李鸿筠, 李俊丽 申请人:冉春