琼脂包埋法固定化污泥中产氢微生物的改性方法
【专利摘要】本发明是通过添加厌氧菌琼脂和γ-氧化铝对琼脂包埋法固定化污泥中的产氢微生物进行改性。普通琼脂与厌氧菌琼脂的质量比为2:1~4:1，γ-氧化铝的添加量为1.5~2.5%，琼脂溶液与污泥的体积比为2:3~3:2，滴球成形后接种于厌氧发酵制氢体系中。厌氧菌琼脂能够为产氢微生物提供营养、缩短适应期，被微生物利用后形成一定的孔道有利于传质。γ-氧化铝无毒、无臭、硬度大、比表面积大、吸附性强、溶液透过速率快，有利于微生物的附着，有利于增强琼脂小球的机械强度和促进传质过程。本发明对琼脂包埋法改性后，能够提高累积产氢量、缩短产氢延迟时间、提高比产氢率和产气中氢气的浓度，保持系统持续稳定地产氢。
【专利说明】琼脂包埋法固定化污泥中产氢微生物的改性方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种产氢微生物固定法的改性。通过添加少量厌氧菌琼脂来缩短产氢微生物的适应时间，并添加Y-氧化铝提高琼脂颗粒的机械性能，主要用于厌氧发酵制氢体系，提高微生物抗负荷能力、维持产氢系统的稳定。
【背景技术】
[0002]随着社会经济的发展，人们对化石燃料的开采和利用与日俱增，而地球上储备的化石燃料有限，从而导致了 “能源危机”。而且化石燃料燃烧带来了严重的环境污染问题。所以，寻求一种替代的、可再生的能源物质成为必然。氢气的燃烧热值较高为142.35kJ/g，是汽油的2.75倍，酒精的3.9倍，焦炭的4.5倍。由于其燃烧只产生水，无二次污染，且可再生，因此被誉为“清洁能源”和“未来能源”。传统的制氢方法有水电解制氢，水煤气转化制氢，煤、焦炭气化制氢等。而这些方法需要消耗大量的能量，并没有摆脱对化石燃料的依附。生物制氢是目前研究进展最快并有希望成为规模化生产的一种制氢方法，不依赖化石燃料、生产过程清洁、使用原料低廉。光合产氢和厌氧发酵产氢是生物制氢的两种主要途径，其中厌氧发酵法备受关注，主要由于发酵细菌产氢能力高、易实现持续产氢、设备简单、操作方便、可以利用较广泛的生物质等优点。
[0003]在厌氧发酵产氢反应体系中，接种微生物主要有悬浮态和固定化两种形态。一般悬浮态微生物容易随着出水而流失，使发酵系统中的生物量减少、产氢性能易受到影响。固定化微生物可以保证高浓度的产氢菌、防止产氢菌受到恶劣环境的冲击等。因此寻找一种良好的固定化微生物的方法显得尤为重要。专利CN10117767A报道了通过微生物固定化技术的得到的包埋颗粒的性能得到显著提高。包埋法是目前细胞固定化技术中最常用、研究最广的方法，是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物空隙的网络空间中，阻止细胞的泄露同时允许底物渗入和产物扩散。现有的包埋固定化载体主要分为有机合成高分子载体和天然高分子凝胶载体两类。有机合成高分子载体的优点是抗微生物分解性好、机械强度高、化学性能稳定等，但载体聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞损害较大。而天然高分子凝胶是从自然界中分离提取出来的物质，具有生物无毒、传质性能良好、成形方便、固定化密度高等优点。琼脂是从海藻中提取的多糖体，是一种天然高分子凝胶，是包埋技术中常用的一种载体。但是存在机械强度差、耐生物分解性差等缺点。在发酵后期，琼脂颗粒内部受到产气的压力而破碎上浮，使颗粒与有机质的接触面积减小，降低固定化微生物产氢率，同时有机质的降解率也下降。因此，需要对琼脂包埋法固定化产氢菌进行改性，提高固定化细胞传质性能、增加通透性、增强机械强度和耐有毒物质的能力。专利CN101668862A报道了用 有机合成高分子物质作为聚合物材料截留固定化产氢细菌，最适PH转变为较低pH范围，因此耗氢菌影响较少、氢气产率提高。但是这种方法得到的球粒形状不一致、大小不均一，不利于考察固定化效果，且负载了纯菌种不利于底物的多元化利用。
【发明内容】
[0004]本发明是采用厌氧菌琼脂和Y -氧化铝作为添加剂，加入普通琼脂与污泥的混合溶液中，一起在液体石蜡中滴球成形。改性后得到的固定化琼脂颗粒小球在厌氧发酵制氢过程中体现出更好的产氢性能。
[0005]改性固定化琼脂颗粒的具体制备步骤如下:
[0006]( I)将琼脂和厌氧菌琼脂加入蒸馏水中，琼脂与厌氧菌琼脂质量比为2: f 4:1，加热使琼脂溶解；
[0007](2)在8(T90°C恒温水浴锅中，热预处理污泥0.5~lh，去除产甲烷菌富集产氢菌；
[0008](3)将溶解的琼脂和预处理后的污泥在5(T55°C下恒温后混合，琼脂溶液与污泥体积比为2: 3^3: 2，搅拌均匀，琼脂最终浓度为2~3% ；
[0009](4)向混合液中加入的Y -氧化铝，添加量为1.5^2.5%，搅拌均匀；
[0010](5)用针筒注射器吸取混合液，滴入上层是液体石蜡(C16飞20)下层是水的量筒中，颗粒粒径为3~4mm，用无菌纱布滤出固定化污泥颗粒；
[0011](6)用0.8%无菌生理盐水冲洗小球颗粒，洗净后备用。
[0012]通过显微镜观察琼脂小球，表面有很多孔道，在孔道内部布满了生长良好的微生物，微生物为杆状，形态较为均一。通过微生物代谢产物的分析，丁酸和乙酸所占比例达70%以上，发酵类型属于“丁酸型”，因此这种杆状菌可能是最常见的产氢菌——梭状芽孢杆菌。说明改性后的载体能够形成一个生物保护龛，避免微生物受到低pH、有毒物质等不良环境的影响。在产氢发酵后期，琼脂颗粒没有出现破损上浮，性质仍较稳定，说明改性后的颗粒机械强度得到提高。
[0013]本发明的几个具体说明和优点:
[0014]第一，混合液中的污泥提供了多种产氢菌，可以利用不同底物。城市剩余污泥富含蛋白质、碳水化合物、脂质等有机物，具有广甲烧菌、硫酸盐还原菌、广乙酸菌、广氢!菌等多种微生物。用于制作固定化产氢菌时，需要一定的预处理手段抑制耗氢菌和富集产氢菌。产甲烷菌等耗氢菌不能生成孢子，采用加热法预处理可以将其去除，保留能够形成孢子的产氢菌。
[0015]第二，厌氧菌琼脂的主要成分是胰酪蛋白胨、L-胱氨酸、硫代乙醇酸钠、葡萄糖、氯化钠、琼脂等，这些营养成分是供厌氧菌生长所需。而产氢菌主要为厌氧菌和兼性厌氧菌，因此向混合液中加入适量的厌氧菌琼脂可以缩短产氢菌的驯化期，从而缩短产氢延迟时间。当形成的琼脂小球中的营养成分被微生物利用后能形成一定的孔道，加快了底物进入小球孔道并被微生物利用进行发酵的过程，产生的气体也能够更加顺利地从小球中释放出来。
[0016]第三，本发明采用的Y-氧化铝(比表面积15(T200m2/g，孔径5~10nm)，无毒、无味、无臭，吸附性强、溶液透过速率快、机械强度大。将Y-氧化铝用于琼脂包埋法固定化产氢微生物的改性过程，主要优势有:1.能够吸附要降解的底物，使底物与微生物充分接触从而加快反应；2.抗压硬度高，有利于增强琼脂球形颗粒的抗压能力和耐水力冲击性；
3.得到的颗粒大小均一，能够维持球形颗粒的机械强度的均匀性和保持球体形状；4.具有多孔性且对微生物没有毒性，有利于微生物的附着和传质过程；5.使用寿命长，发酵反应过程性质稳定；6.使用原料成本较低，制备工艺较简便。[0017]第四，液体石蜡是从原油分馏得到的无色无味的混合物，主要成分是ClfTC2tl的正构烷烃。密度比水轻，不溶于水，性质较温和、无毒。来源广泛，价格便宜。琼脂包埋颗粒在液体石蜡中滴球成形，对产氢微生物没有毒性，且液体石蜡作为分散介质能够分隔每一滴注入的混合溶液，使每一滴溶液单独成球，颗粒形成后不会发生聚合或团聚，形成的颗粒为球形或椭球形且大小均一。在液体石蜡中成形的颗粒比在水溶液中成形的颗粒具有强度高、粒径分布均匀、孔径分布范围窄等优势。成形的琼脂颗粒从液体石蜡层进入下层的水相后能够迅速去除其表面附着的液体石蜡，并能提前适应水相环境，有利于后续的发酵反应的快速启动。
【具体实施方式】
[0018]模拟废水组成:葡萄糖8gL，NH4Cl0.5gL，Na2HP046.27g/L和微量元素IOmL/L-culture, pH6.5~7.0。
[0019]微量元素:K2HP04125mgL,MgCl2.6H20100mg/L, MnSO4.6H2015mg/L,FeSO4.7H2025mg/L, CuSO4.5H205mg/L, CoCl2.H202mg/L。
[0020]滴球过程:用针筒式注射器吸取混合液，滴入上层是液体石蜡(ClfTC2tl)下层是水的量筒中。
[0021]实施例1
[0022]接种热预处理后的悬浮态污泥IOmL于200mL的废水中，反应温度37 ± I °C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间3.7h，累积产氢量180.9mL,比产氢率157.3mLH2/g-glucose,氢气浓度38.8%，糖类降解率71.9%。
[0023]实施例2
[0024]不添加厌氧菌琼脂，琼脂溶液与污泥体积比为1:1，琼脂浓度为3%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37土1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间8.5h，累积产氢量201.5mL,比产氢率167.8mLH2/g-glucose,氢气浓度39.9%,糖类降解率75.1%。
[0025]实施例3
[0026]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:1，琼脂溶液与污泥体积比为1:1,琼脂浓度为3%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间4.lh，累积产氢量224.9mL，比产氢率175.9mLH2/g-glucose，氢气浓度 45.1%，糖类降解率 79.9%。
[0027]实施例4
[0028]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:1，琼脂溶液与污泥体积比为1:1,琼脂浓度为3%，
Y-氧化铝添加量为2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间5.7h，累积产氢量264.0mL,比产氢率 189.4mLH2/g-glucose，氢气浓度 50.9%，糖类降解率 87.1%。
[0029]实施例5
[0030]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为4:1，琼脂溶液与污泥体积比为3:2，琼脂浓度为2.5%，Y -氧化铝添加量为2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间6.2h，累积产氢量257.4mL,比产氢率187.5mLH2/g-glucose，氢气浓度49.3%，糖类降解率85.8%。
[0031]实施例6
[0032]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为6:1，琼脂溶液与污泥体积比为1:1，琼脂浓度为3%，
Y-氧化铝添加量为2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间6.9h，累积产氢量260.8mL,比产氢率 187.6mLH2/g-glucose，氢气浓度 50.3%，糖类降解率 86.9%。
[0033]实施例7
[0034]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:2，琼脂溶液与污泥体积比为1:1,琼脂浓度为3%，
Y-氧化铝添加量为2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间5.0h，累积产氢量231.8mL,比产氢率 177.3mLH2/g-glucose，氢气浓度 46.2%，糖类降解率 81.7%。
[0035]实施例8
[0036]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:1，琼脂溶液与污泥体积比为1:1,琼脂浓度为3%，
Y-氧化铝添加量为1.5%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间5.2h，累积产氢量246.4mL,比产氢率183.5mLH2/g-glucose，氢气浓度47.1%，糖类降解率83.9%。
[0037]实施例9
[0038]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:1，琼脂溶液与污泥体积比为2:3，琼脂浓度为
2.5%，Y -氧化铝添加量为2.5%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间5.0h，累积产氢量265.5mL,比产氢率188.lmLH2/g-glucose，氢气浓度49.5%，糖类降解率88.2%。
[0039]实施例10
[0040]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:1，琼脂溶液与污泥体积比为2:1，琼脂浓度为3%，
Y-氧化铝添加量为2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直径为3~4mm，小球颗粒颜色明显变浅。将琼脂颗粒加入到200mL废水中，反应温度37±1°C，摇床速率13(Tl50rpm。产氢延迟时间6.7h，累积产氢量233.9mL,比产氢率170.lmLH2/g-glucose，氢气浓度42.5%，糖类降解率85.9%。
[0041]实施例11
[0042]琼脂与厌氧菌琼脂质量比为3:1，琼脂溶液与污泥体积比为1:2，琼脂浓度为3%，
Y-氧化铝添加量为2%，混合液一共20mL，用注射器滴球，颗粒小球成形较困难，从液体石蜡层进入水相后，部分污泥从颗粒中溢出进入水相，颗粒破碎。
[0043]从具体实施例可见，实施例2包埋法固定化污泥细胞与实施例1悬浮态污泥相比，产氢延迟时间增加，但 是累积产氢量增加、比产量率增大、氢气浓度提高，固定化能够提升污泥细胞的耐冲击负荷能力。实施例3通过添加厌氧菌琼脂缩短了产氢延迟时间。实施例4添加Y-氧化铝使琼脂小球机械强度增大、持续产氢时间延长、累积产氢量增加、氢气浓度增大。实施例6、7是添加不同量的厌氧菌琼脂，产氢能力都不如实施例4，添加量少则不利于缩短产氢延迟时间，添加量大则不利于琼脂颗粒的机械强度。实施例10是混合液中琼脂多、污泥少，形成的颗粒小球微生物负载量减少，累积产氢量降低。实施例11是混合液中琼脂少、污泥多，不利于滴球成形。总体而言，添加适量的厌氧菌琼脂和Y-氧化铝能够改善琼脂包埋法固定化产 氢菌的产氢性能。
【权利要求】
1.琼脂包埋法固定化污泥中产氢微生物的改性方法，其特征在于:添加厌氧菌琼脂和Y-氧化铝与普通琼脂一起滴球成形，包括以下步骤: (1)普通琼脂与厌氧菌琼脂共同加热溶解得到琼脂溶液，所述的普通琼脂与厌氧菌琼脂质量比为2:1~4:1 ; (2)将琼脂溶液与预处理后的污泥混合均匀，所述的琼脂溶液与预处理后的污泥体积比为2:3~3:2 ; (3)向混合液中加入Y-氧化铝并搅拌均匀，添加的Y-氧化铝的质量为混合液的1.5~2.5% ； (4)用注射器吸取步骤(3)获得的混合液，滴球成形； (5 )用无菌滤布滤出琼脂颗粒后，用生理盐水冲洗干净备用。
2.按照权利要求1所述的改性方法，其特征在于:步骤(2)所得的混合液中琼脂质量浓度为2~3%。
3.按照权利要求1所述的改性方法，其特征在于:步骤(2)所用的污泥采用高温法预处理，在8(T90°C恒温水浴锅中预处理0.5~lh，热预处理可以去除产甲烷菌等耗氢菌并富集产氢菌。
4.按照权利要求1所述的改性方法，其特征在于:步骤(3)所述的用注射器吸取混合液滴球成形过程是将混合液滴入上层是液体石蜡、下层是水的量筒中，液体石蜡层高8~12cm。
5.按照权利要求1所述的改性方法，其特征在于:步骤(3)所述的用注射器吸取混合液，采用16G针头的针筒式注射器，滴球能够形成粒径3~4_的琼脂颗粒。
6.按照权利要求1所述的改性方法，其特征在于:步骤(4)所述的用生理盐水冲洗琼脂颗粒，生理盐水质量浓度为0.8%。
【文档编号】C12N11/14GK103882001SQ201210563167
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】孙承林, 余丽, 于永辉, 于波, 杨旭, 蒋文天 申请人:中国科学院大连化学物理研究所