专利名称：华法林个性化用药基因测序试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测基因的单核苷酸多态性(SNP)的试剂盒，具体涉及一种华法林个性化用药基因测序试剂盒。
背景技术：
华法林是临床应用最广泛的口服抗凝药物，主要用于深静脉血栓形成、肺栓塞、房颤、心脏瓣膜置换术后等抗凝治疗。华法林个体差异大、治疗窗口窄，因而调整或确定华法林剂量、避免出血等不良反应的发生一直是临床上抗凝治疗管理的重点和难点。研究发现，患者由于抗凝过量所导致的致命性出血的发生几率为4. 4 9. 3%，而且随着抗凝强度的增大由此产生并发症的概率也会随着增高。目前主要靠监测患者的国际标准化比值(INR) 来调整用药剂量。随着遗传药理学的发展，人们发现编码华法林的靶酶VKORCl和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素，而且在很大程度上解释了华法林的个体差异和种族差异。以遗传药理为基础的药物剂量调整得到各方面的重视，美国FDA建议华法林在用药前应做相关基因型检测，从而可以做到个性化给药。华法林有两种构象R和S。其中S -华法林的作用占60-70%，而R -华法林只有30-40%。S-华法林主要由6 ⑶代谢生成无活性的代谢产物。影响华法林用药量的位点有很多，如VKORCl等，CYP2C9的基因多态性与华法林剂量间的关系早已被证实。亚洲人种常见的突变型为CYP2C9*30 CYP2C9*3突变导致CYP2C9酶活性降低，其活性仅为野生型的5%，突变均降低了酶活性，使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此，需降低用药剂量，以防止不良反应的发生。⑶可以解释20%的华法林剂量；维生素K环氧化物还原酶(VKOR)是华法林作用的靶点，也是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，目前已有一系列VKORCl的单核苷酸多态性与华法林剂量的相关性报道。VKORCl激活VKORC，隻变型的启动子活性高，VKORC的活性变高，凝血作用高，华法林的用量变大。VK0RC13673GG剂量较高，而GA，AA剂量依次降低。VKORCl基因多态性是影响华法林用药剂量个体差异和种族差异的主要因素。VKORCl可以解释30%的华法林剂量。目前，基于华法林个体用药的差异及用药过多或是过少出现的的出血、血栓等危险现象，现在很多医疗机构也开始对患者进行华法林用药前做相关的基因检测，以下是一些相关基因检测试剂盒的专利，但存在或检测位点不全面，或使用不方便等的问题。
发明内容本实用新型所要解决的技术问题是提供一种使用方便，检测全面准确，方便保存运输，成本相对较低的华法林个性化用药基因测序试剂盒。为解决上述技术问题，本实用新型所采用的技术方案为华法林个性化用药基因测序试剂盒，包括盒体、衬垫,所述的衬垫设于盒体内，所述衬垫上横向或纵向排布有与检测位点个数相应的数组样品孔，每组样品孔中样品孔的个数至少为三个，分别放置封装有与检测位点相对应的PCR扩增正向引物、PCR扩增反向引物、测序引物的样品管；所述的衬垫中还布设有2个样品孔，分别放置封装有Taq酶、PCR反应液的样品管。按上述方案，所述衬垫上横向或纵向布设有三组样品孔，分别与三个检测位点相对应，所述放置封装有Taq酶、PCR反应液的样品管的两个样品孔分别设于第一组和第二组样品孔之间、第二组和第三组样品孔之间。本实用新型的有益效果(I)本试剂盒通过横向或纵向排布与检测位点个数相对应的多组样品孔，在各组样品孔中间至少布设三个样品孔，分别放置与检测位点相对应的PCR扩增正向引物、PCR扩增反向引物、测序引物，方便使用者获取及测定完成后进行有序相应放回，使用方便；(2)本试剂盒还另外设有设有2个样品孔，分别封装有Taq酶、PCR反应液的样品管，可大大方便使用者的使用，提高检测效率；(3)本试剂盒中的测序引物和PCR扩增引物以冻干粉的形式储存于样品管内，方便保存和运输，降低成本。
图I为本实用新型实施例I的华法林个性化用药基因测序试剂盒的结构示意图。图中I盒体；2衬垫；3样品孔组；4样品孔。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本实用新型的发明内容进行进一步地说明。实施例I如图I所示华法林个性化用药基因测序试剂盒，包括盒体1，衬垫2，所述的衬垫设于盒体内，所述衬垫上纵向排布有三组样品孔组3，分别与三个不同的检测位点相对应，如VKORCl、CYP2C9氺2和CYP2C9*3,每组样品孔中样品孔的个数为三个，分别放置封装有与检测位点相对应的PCR扩增正向引物、PCR扩增反向引物、测序引物的样品管；所述第一组和第二组样品孔之间、第二组和第三组样品孔之间分别设有一个样品孔4，分别放置封装有Taq酶的样品管、封装有PCR反应液的样品管。所述的测序引物和PCR扩增正向引物、PCR扩增反向引物均以冻干粉的形式储存于样品管内。本试剂盒保存于-4°C，尽量减少反复冻融。华法林个性化用药基因测序试剂盒的具体使用方法(I)第一次使用时，首先打开华法林个性化用药基因测序试剂盒，将盒内装PCR扩增正向引物、PCR扩增反向引物的样品管取出，进行短暂离心，再加纯水对引物进行稀释。为了避免反复冻融而影响引物质量，建议先将引物稀释到20umol/L，然后分装到不同的离心管中，贴好标签保存备用。使用时，取出，等到完全溶解后再吸取，配制使体系中引物的终浓度达到10 100pmol/L即可使用。(2)配制 PCR 体系 50uL :模板 DNA 0. 2 I ug ；Taq 酶0. 5ul (5U/uL) ；PCR 引物(F，R)各Iul，PCR反应液9 uL，加入无菌纯水，补齐至50uL，配制好以后涡旋震荡使其混匀。(3)进行PCR程序95 V预变性5分钟；然后94 V变性30秒，60 °〇复性I分钟，72°C延伸I分钟，如此30个循环；再72 V延伸7分钟。(4 ) PCR结束，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。进行测序反应时，测序引物的稀释同上述PCR扩增引物稀释方法，然后进行后续测序步骤；使用者可根据自己的测序仪型号对测序反应体系中的参数设置，进行配套设置。通过对华法林用药者的基因检测，能够更准确地估计华法林的剂量，降低治疗 引导阶段华法林过量的风险，并缩短华法林达到稳定治疗的时间。
权利要求1.华法林个性化用药基因测序试剂盒，包括盒体、衬垫，所述的衬垫设于盒体内，其特征在于所述衬垫上横向或纵向排布有与检测位点个数相应的数组样品孔，每组样品孔中样品孔的个数至少为三个，分别放置封装有测序弓丨物和与检测位点相对应的PCR扩增正向引物、反向引物的样品管；所述的衬垫中还布设有2个样品孔，分别放置封装有Taq酶、PCR反应液的样品管。
2.根据权利要求I所述的华法林个性化用药基因测序试剂盒，其特征在于所述衬垫上横向或纵向布设有三组样品孔，分别与三个检测位点相对应，所述放置封装有Taq酶、PCR反应液的样品管的两个样品孔分别设于第一组和第二组样品孔之间、第二组和第三组样品孔之间。
专利摘要本实用新型涉及一种华法林个性化用药基因测序试剂盒。华法林个性化用药基因测序试剂盒，包括盒体、衬垫，所述的衬垫设于盒体内，其特征在于所述衬垫上横向或纵向排布有与检测位点个数相应的数组样品孔，每组样品孔中样品孔的个数至少为三个，分别放置封装有测序引物和与检测位点相对应的PCR扩增正向引物、反向引物的样品管；所述的衬垫中还布设有2个样品孔，分别放置封装有Taq酶、PCR反应液的样品管。该华法林个性化用药基因测序试剂盒使用方便，检测全面准确，方便保存运输，成本相对较低。
文档编号C12Q1/68GK202730128SQ20122031760
公开日2013年2月13日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者徐谋胜, 李兵, 王珊, 袁雅燕, 王宁 申请人:湖北维达健基因技术有限公司