减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法

减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
【专利摘要】本发明提供痘苗病毒的克隆毒株。还提供从病毒制备物中鉴别及分离减毒的溶瘤克隆毒株的方法。还提供克隆毒株的修饰的重组形式。所述克隆毒株及病毒制备物可以用于诊断和治疗方法，特别是治疗和诊断或者监测增生性病症的治疗，包括肿瘤疾病，例如但不限于实体肿瘤和血液癌症。
【专利说明】减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2011年4月15日申请的美国临时申请系列号61/517,297、2011 年11月4日申请的美国临时申请系列号61/628,684的优先权，每个申请属于Aladar A. Szalay，Nanhai Chen，Yong A. Yu and Qian Zhang并且发明名称是"Clonal Strains of Attenuated Vaccinia Viruses and Methods of Use Thereof，'。
[0003] 本申请与同日申请的美国专利申请号（Attorney Dkt. No. 33316. 04832. US03/4832)，发明名称为"Clonal Strains ofTUtenuated Vaccinia Viruses and Methods ofUse Thereof"相关，该申请要求美国临时申请系列号61/517, 297和61/628, 684的优先 权。
[0004] 当允许时，每个上述申请的主题全文引入本文。
[0005] 援引引入电子形式的序列表
[0006] 在此提交序列表电子版本，其内容全部引入本文。电子文件大小4. 44Mb，名称为 4832seqPCl. txt〇 发明领域
[0007] 痘苗病毒分离株。
[0008] 发明背景
[0009] 痘苗病毒是一种溶瘤病毒，在肿瘤中积聚。针对治疗性和诊断性应用已经开发了 减毒的痘苗病毒毒株。例如，减毒的病毒包括修饰重组病毒，其一或多个病毒基因被修饰导 致病毒基因的表达丧失或降低或者病毒蛋白质失活。然而，减毒病毒的方法可降低或减弱 该病毒的溶瘤性质。因此，仍需要减毒的溶瘤病毒及鉴别减毒的溶瘤病毒的方法。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供来自LIVP制备物的分离的克隆毒株。本发明提供基本上同质的LIVP 病毒制备物的制备物。本发明还提供通过繁殖分离的克隆毒株而获得的制备物。本发明特 别提供了分离的克隆LIVP毒株，其基因组含有核苷酸序列，该核苷酸序列不同于基因组中 含有SEQ ID N0 :10所示序列的克隆毒株。在一些实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株具 有与SEQ ID N0:10所示核苷酸序列具有至少85%序列相同性但是不包括SEQ ID N0:10所 示核苷酸序列的核苷酸序列。例如，本发明提供的分离的克隆LIVP毒株具有与SEQ ID NO: 10 所示核苷酸序列具有至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或 99. 9 %序列相同性的核苷酸序列。在这样的实例中，序列相同性是指通过比对含有相应于 反向末端重复序列（ITR)(如果其存在的话）的核苷酸的核苷酸序列及使用GAP全局比对 并且末端缺口不罚分而确定的序列相同性。特别地，本发明提供的LIVP克隆毒株与具有 SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的称作GLV-lh68的LIVP毒株相比具有较高的抗肿瘤发生能 力和/或降低的毒性。
[0012] 在本发明提供的LIVP克隆毒株的实例中，分离的克隆LIVP毒株是存在于LIVP分 离株中或者存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中的毒株，所述克隆毒株与具有SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的称作GLV-lh68的病毒毒株相比具有降低的毒性和/或较高的抗肿瘤发 生能力。
[0013] 在本发明提供的LIVP克隆毒株的其它实例中，分离的克隆LIVP毒株是具有如后 述的基因组的毒株，所述基因组不含有非病毒异源核酸，该非病毒异源核酸具有编码非病 毒异源蛋白质的开放读框，所述分离的克隆LIVP毒株与具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列 的称作GLV-lh68的病毒毒株相比还呈现出降低的毒性和/或改良的抗肿瘤发生能力。
[0014] 本发明提供的LIVP克隆毒株包括与具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的称作 GLV-lh68的病毒相比具有降低的毒性的克隆毒株。在其它实例中，本发明提供的LIVP克隆 毒株包括与具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的称作GLV-lh68的病毒相比具有更高抗肿 瘤发生能力的克隆毒株。在进一步的实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株包括与具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的称作GLV-lh68的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗肿瘤发 生能力的克隆毒株。
[0015] 在本发明提供的任何LIVP克隆毒株中，所述LIVP克隆毒株的基因组具有与SEQ ID N0 :10所示核苷酸序列具有至少85%序列相同性的核苷酸序列，但是不含有SEQ ID NO :10所示完整核苷酸序列。例如，所述分离的克隆LIVP毒株具有至少86187188%、 89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94%,95 %,96 %,97%,98 %,99 %,99. 1 % ,99. 2%,99. 3 %, 99. 4%、99. 5%、99. 6%、99. 7%、99. 8%或99. 9%的序列相同性。在这样的实例中，序列相 同性是指通过比对含有相应于反向末端重复序列（ITR)的核苷酸的核苷酸序列及使用与 SEQ ID N0 :10所示核苷酸序列进行GAP全局比对并且末端缺口不罚分而确定的。
[0016] 在本发明提供的呈现出降低的毒性的任何LIVP克隆毒株中，降低的毒性可以在 施用于对象时显现。例如，所述对象可以是人或非人动物，特别是驯化动物。降低的毒性可 以通过任何评估毒性作用的方法确定，例如但不限于指示毒性的参数，如对象的存活降低、 体重降低、发热、皮疹、过敏反应、疲劳、腹痛、对象体内免疫应答的诱发、痘痕形成和/或所 述病毒在非肿瘤组织的积累显著低于LIVP(具有SEQ ID N0 :10所示或者基本如SEQ ID NO :10所示基因组的病毒，典型为至少99%)或者GLV-lh68(具有SEQ ID NO :9所示或者 基本如SEQ ID N0 :9所示基因组的病毒，典型为至少99%)。积累可以通过任何合适方法 检测，如对所述对象进行成像以检测病毒积累，特别是在其中所述病毒表达可检测蛋白质 或者诱导可检测信号或其它这种标志物的情况下。积累也可以通过对身体组织和/或体液 取样进行检测。在一些实例中，降低的毒性是指对象与施用了具有SEQ ID N0 :9所示核苷 酸序列的称作GLV-lh68的病毒的对象相比经历较低的毒性作用或者无毒性作用，其中称 作GLV-lh68的病毒以与所述克隆毒株相似的量及在相同给药方案下施用。在其它实例中， 降低的毒性是指对象不死于施用病毒的施用所诱导的毒性作用。
[0017] 在一些情况中，所述LIVP克隆毒株与参照LIVP毒株相比呈现出降低的毒性及较 高的抗肿瘤活性或者这些活性的组合，所述参照LIVP毒株如具有SEQ ID N0 :9所示基因 组的毒株，特别是称作GLV-lh68的毒株，也称作GL-0NC1。对于任何提供的呈现出较高的 抗肿瘤发生能力的LIVP克隆毒株，其抗肿瘤发生能力可以在施用对象时在体外或体内显 示或评估。较高的抗肿瘤发生能力可以通过在体外或体内评估指示抗肿瘤发生能力的参数 而确定，所述参数选自如肿瘤细胞的感染性、病毒在肿瘤组织中的积累、病毒核酸复制、病 毒产生、病毒基因表达、对宿主细胞的影响、细胞毒性、肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择 性、免疫原性以及在肿瘤细胞中的复制量。在一些实例中，较高的抗肿瘤发生能力是指，在 相同或相似条件下进行相同的体外或体内实验，该实验对指示抗肿瘤发生能力的参数（例 如在给定时间内改变肿瘤大小）进行评估，所述克隆毒株呈现出与具有SEQ ID NO :9所示 核苷酸序列的称作GLV-lh68的病毒的抗肿瘤发生能力相比至少或大约至少110%、120%、 130 %U40 %U50 %U60 %U70 %U80 %U90 %,200 %,250 %,300 %A00 %>500 600 %、700 %、800 %或更高的抗肿瘤发生能力。
[0018] 与SEQ ID NO :10所示核苷酸序列中相应开放读框（0RF)的核苷酸序列相比，本发 明提供的LIVP克隆毒株包括在0RF中具有一或多个核苷酸差异的任何毒株。其它的可以在 其它区域中有差异。例如，一或多个核苷酸差异是一或多个核苷酸缺失、取代或添加（即插 入），特别是改变编码的蛋白质的序列的核苷酸改变。在另一实例中，所述差异是在0RF的 启动子区域中缺失、取代或添加一或多个核苷酸。在进一步的实例中，与SEQ ID N0 :10所 示核苷酸序列中相应0RF不同的0RF编码截短的蛋白质，失活蛋白质或者消除所述病毒产 生的该蛋白质。在任何上述实例中，所述差异可以是在选自名称如下的0RF中：gl001/290、 gl009/283、gl010/282、gl011/280、gl015、gl032、gl034、gl035、gl037、gl069、gl077、 gl079、gl082、gl084、gl088、gl093、gl225、gl230、gl239、gl241、gl257、gl264、gl270、 gl273、gl274、gl277/105、gl280/010及gl283/009。可以存在多个差异。关于精确差异的 知识不是必需的，关键的是所述毒株是呈现出降低的毒性和/或抗肿瘤活性或者这二者的 组合，使得所述病毒作为肿瘤治疗或诊断剂的性质优于GLV-lh68 (即由于所述性质之一明 显改进或者由于这两种性质组合相比于GLV-lh68的性质有所改良）。
[0019] 作为克隆毒株的实例，本发明提供LIVP克隆毒株，其含有SEQ ID N0 :1的 10, 073-180, 095 位核苷酸序列、SEQ ID N0 :2 的 11，243-182, 721 位核苷酸序列、SEQ ID NO :4 的 6, 264-181，390 位核苷酸序列、SEQ ID NO :5 的 7, 044-181，820 位核苷酸序列、SEQ ID NO :6的6, 674-181，409位核苷酸序列、SEQ ID NO :7的6, 716-181，367位核苷酸序列 或者SEQ ID N0 :8的6, 899-181，870位核苷酸序列。本发明还提供LIVP克隆毒株，其含 有与如下核苷酸序列具有至少大约或至少99%序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID N0 :1的 10, 073-180, 095位核苷酸序列、SEQ ID N0 :2 的 11，243-182, 721 位核苷酸序列、SEQ ID N0: 4 的 6, 264-181，390 位核苷酸序列、SEQ ID NO :5 的 7, 044-181，820 位核苷酸序列、SEQ ID NO :6的6, 674-181，409位核苷酸序列、SEQ ID NO :7的6, 716-181,367位核苷酸序列或者 SEQ ID N0 :8 的 6, 899-181，870 位核苷酸序列。
[0020] 在其它实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株含有包括左侧和/或右侧反向末端重 复的核苷酸序列。例如，本发明提供含有SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列的 LIVP克隆毒株。本发明还提供含有与SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至 少99%序列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在LIVP克隆毒株中，本发明提供的是 含有SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列或者与SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列具有至少99%相 同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在其它实例中，在LIVP克隆毒株中，本发明提供的是 含有SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列或者与SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列具有至少99%序 列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在本发明提供的LIVP克隆毒株的任何实例中， 所述LIVP克隆毒株可以通过从细胞培养物中分离LIVP克隆而获得，在所述细胞培养物中 繁殖了具有SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或者具有与SEQ ID N0:l、2、4、 5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的毒株。
[0021] 本发明提供LIVP病毒制备物或者病毒，其含有本发明提供的上述任何LIVP克隆 毒株的基因组。
[0022] 本发明提供重组或修饰的LIVP病毒毒株，其含有上述任何LIVP克隆毒株的基 因组，上述LIVP克隆毒株被修饰为在基因组中还含有异源核酸，如编码异源基因产物的 核酸。在一些实例中，所述异源核酸（如编码异源基因产物的核酸）被插入或置换病毒 基因组中非必需基因或区域中。例如，编码异源基因产物的核酸被插入在病毒基因组中 的血凝素（HA)、胸腺激酶（TK)、F14. 5L、痘苗病毒生长因子（VGF)、A35R、NIL、E2L/E3L、 K1L/K2L、过氧化物歧化酶基因座、7. 5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或者I4L基因座。本发 明提供的病毒通过本领域技术人员已知的任何方法修饰和/或使用，如治疗肿瘤，作为针 对来自插入基因组中的抗原的病原体的疫苗，用于诊断以及用于诊断和治疗，所述方法包 括例如国际PCT申请No. W02009/054996、国际PCT申请No. W02009/139921、美国专利申 请 No. US-2009-0081639、US-2009-0053244、US-2009-0098529 和美国专利 No. 7, 754, 221、 7, 588, 767、7, 588, 771和7, 662, 398中所描述的修饰以及方法/用途。
[0023] 在本发明提供的重组或修饰的LIVP病毒毒株中，异源基因产物包括一或多种治 疗和/或诊断的制剂或试剂。在一些实例中，所述异源基因产物是抗癌剂、抗转移剂、抗血 管发生剂、免疫调节分子、抗原、细胞基质降解基因、组织再生及人类体细胞多能性重塑基 因、修饰底物以产生可检测产物或信号或者通过抗体可检测的酶、可结合造影剂的蛋白质、 光学成像或检测的基因、PET成像的基因及MRI成像的基因。例如，抗转移剂是抑制转移 或者在体外细胞侵袭测定中抑制细胞侵袭的物质。在另一实例中，抗血管发生剂是抑制肿 瘤中血管形成的物质。在进一步的实例中，组织再生和人类体细胞多能性重塑基因是newt AG (nAG)、0ct4、NANOG、Ngn3、Pdxl 或 Mafa。
[0024] 在本发明提供的重组或修饰的LIVP病毒毒株的实例中，异源基因产物是选自如 下的一种治疗剂：激素、生长因子、细胞因子、共刺激分子、核酶、转运蛋白、单链抗体、反义 RNA、前体药物转化酶、siRNA、microRNA、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分 裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管发生抑制剂、肿瘤阻抑物、细胞毒性蛋白、细胞抑制蛋白和组 织因子。例如，所述异源基因产物是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、单核细胞趋 化蛋白-1 (MCP-1)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-24(IL-24)、干扰素-γ诱导的蛋白 质10(IP-10)、与HSV糖蛋白D竞争T-淋巴细胞上表达的受体HVEM的淋巴毒素诱导表达 物（LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信号转导及转录激活蛋白（STATlalpha)、STATlbeta、 血纤蛋白溶酶原k5结构域（hK5)、色素上皮细胞-分化因子（PEDF)、单链抗-VEGF抗体、单 链抗-DLL4抗体、单链抗成纤维细胞激活蛋白（FAP)、匪23、钙粘着蛋白1 (ECAD或cdhl)、 松弛肽1 (RLN1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、红细胞生成素（ΕΡ0)、microRNA126(miR-126)、 microRNA181、microRNA335、锰超氧化物歧化酶（MnSOD)、E3泛素蛋白连接酶l(HACEl)、 钠尿肽前体蛋白A(nppal)、羧肽酶G2(CPG2)、醇脱氢酶（ADH)、CDC6、或者骨形态生成蛋白 4 (BMP4)。例如、单链抗-VEGF抗体称作G6。
[0025] 在本发明的含有编码诊断剂的异源基因产物的重组或修饰的LIVP毒株的实例 中，所述诊断剂是可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质。例如，所述诊断剂是萤光素 酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、结合和/或转运造影剂、生色团、可检测的化合物或配体的受 体或转运蛋白。在这样的实例中，结合和/或转运造影剂的受体或转运蛋白是铁受体、铁转 运蛋白、或者铜摄取转运蛋白。在特定的实例中，所述诊断剂是绿色痛头虫（click beetle) 萤光素酶、lux操纵子、红外线荧光蛋白、黄素还原酶蛋白、mNeptune远红光荧光蛋白、绿色 荧光蛋白（GFP)、红色荧光蛋白（RFP)、腔肠素结合蛋白（CBP)、人肾上腺素受体（hNET)、碘 化钠同向转运（NIS)蛋白、细胞色素 p450家族酶、allostatin A受体（AlstR)、Pepl受体 (PEPR-1)、LAT-4、固醇14 α -去甲基化酶（Cyp51)，转移受体（TR)、铁蛋白、二价金属转运蛋 白（DMT)、趋磁性蛋白A(MagA)或者顺钼内流转运蛋白（CTR1)。
[0026] 在本发明提供的重组或修饰的LIVP病毒毒株中，编码异源基因产物的核酸与启 动子可操纵地连接。例如，所述启动子是哺乳动物启动子，包括病毒启动子。在一些实例 中，所述启动子是 P7.5k、Pllk、PSE、PSEL、P SL、H5R、TK、P28、Cl 1R、G8R、F17R、I3L、I8R、AIL、A2L、 A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、DIR、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、MIL、N2L、P4b 或者 K1 启动子。
[0027] 本发明提供含有上述本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的组合物。本发明 还提供含有上述本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的药物组合物。在其它实例中，本 发明提供的组合物或药物组合物可含有一或多种不同的病毒毒株。在一些实例中，所述药 物组合物含有药物学可接受的载体。本发明提供的药物组合物可以配制用于局部或全身施 用。在其它实例中，所述药物组合物配制物用于抗病毒或抗癌疫苗或者抗癌治疗施用。
[0028] 本发明提供含有本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株与治疗剂或诊断剂的组 合。在一些实例中，所述治疗剂选自化疗剂、免疫抑制剂和抗病毒剂。例如，所述化疗剂是 抗转移剂或抗血管发生剂。在一些实例中，所述化疗剂是细胞因子、趋化因子、生长因子、光 增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号调节剂、抗代 谢物、抗癌疫苗或治疗剂、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗 癌抗生素、免疫治疗剂或者前述任何化疗剂的组合。在其它实例中，所述化疗剂是顺钼、卡 钼、吉西他滨、伊立替康、抗-EGFR抗体或者抗-VEGF抗体。在一些实例中，所述免疫抑制 剂是糖皮质激素、烷化剂、抗代谢物或抗体。在其它实例中，所述抗病毒剂是西多福韦、格列 卫、更昔洛韦、阿昔洛韦或ST-246。例如，所述抗病毒剂是化疗剂。在本发明提供的药剂组 合的任何实例中，所述病毒和化疗剂和/或抗病毒剂配制为单一组合物或者分别配制为两 或多个组合物。
[0029] 本发明提供试剂盒，其含有上述任何LIVP病毒毒株，上述任何组合物或药物组合 物或者上述任何组合，以及选择性包含所述组合物的施用说明书。
[0030] 本发明提供用于治疗对象中增生性病症的方法、用途或组合物，所述治疗通过施 用上述任何药物组合物进行，例如含有本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的上述任何 药物组合物。所述增生性疾病可以是癌症。例如，所述癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢 癌、肺癌、结肠癌或者胰腺癌。所述增生性病症可以是肿瘤或转移。在本发明的方法中，所 述对象可以是人或者非人对象。
[0031] 在用于治疗增生性病症的典型的方法、用途或组合物的实例中，所述病毒可以施 用或者配制为一个量施用，所述量为至少或者大约或者是1X 105pfu，在施用周期至少一 次。例如，施用的或者配制的病毒的量为至少或者至少大约或者是1X 105pfu、1X 106pfu、 1 X 107pfu、1 X 108pfu、1 X 109pfu、1 X 101Qpfu、1 X 10upfu、1 X 1012pfu、1 X 1013pfu 或 IX 1014pfu，施用至少一次或者在一个施用周期至少一次。例如，用于本发明的方法、用 途或组合物的配制物中的病毒毒株的浓度可以是1X10 6至lXl〇16pfu/ml，或者至少或 者大约或者是 lX106pfu/ml、lX107pfu/ml、lX108pfu/ml、lX10 9pfu/ml、lX10lclpfu/ ml、1 X 10npfu/ml、1 X 1012pfu/ml、1 X 1013pfu/ml、1 X 1014pfu/ml、1 X 1015pfu/ml 或者 IX 1016pfu/ml。在这样的实例中，在施用周期中施用所述量的病毒2次，3次、4次、5次、6 次或7次。例如，所述量的病毒在施用周期第一天、周期的第一天和第二天、周期的连续前 三天的每一天、周期的连续前四天的每一天、周期的连续前五天的每一天、周期的连续前六 天的每一天或者周期的连续前七天的每一天施用。所述施用周期可以是7天、14天、21天 或者28天。
[0032] 在本发明的方法中，也可以施用治疗增生性病症的第二种治疗剂。其可以与所述 病毒单独、相继或相间施用。技术人员熟知治疗增生性病症如癌症的各种治疗剂。例如，在 本发明的方法中，对增生性病症的进一步治疗包括但不限于手术、放射性治疗、免疫抑制治 疗或者施用抗癌剂。例如，抗癌剂包括细胞因子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒素、抗癌 抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗或 治疗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗 剂或者前述任何物质的组合。所述抗癌剂可以是顺钼、卡钼、吉西他滨、伊立替康、抗-EGFR 抗体或者抗-VEGF抗体。在这样的实例中，所述病毒和抗癌剂是相继、同时或者相间施用 的。
[0033] 在上述方法或使用中，包括但不限于用于治疗增生性病症，所述病毒是在局部 (locally)、体表（topically)或全身性施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、经内窥镜、病变 内（intralesionally)、肌肉注射、皮内、腹膜内、囊内（intravesicularly)、关节内、胸膜 内、经皮、皮下、口服、胃肠外、鼻内、气管内、通过吸入、颅内、前列腺内、玻璃体内、体表、目艮 内、阴道或者直肠。例如，所述病毒是静脉内或者腹膜内施用的。
[0034] 本发明提供检测对象体内肿瘤或者转移的方法，通过给对象施用本发明提供的任 何LIVP病毒或者克隆毒株或者含有本发明提供的任何LIVP病毒毒株或克隆毒株的组合 物或药物组合物进行检测。为了进行诊断或检测，所述病毒含有编码可检测蛋白或者诱导 可检测信号的蛋白质的核酸，检测所述可检测的蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质，通过 检测表明对象体内肿瘤或转移的存在情况。在本发明的检测方法中，所述可检测蛋白或者 诱导可检测信号的蛋白质选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或转运蛋白，所述 受体或转运蛋白结合和/或转运造影剂、生色团、可被检测的化合物或配体。例如，所述可 检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质是绿色荧光蛋白（GFP)、红色荧光蛋白（RFP)、铁受 体、铁转运蛋白、钠或其它离子转运蛋白如人肾上腺素受体（hNET)或者碘化钠同向转运蛋 白（NIS)。在本发明提供的检测方法中，所述可检测蛋白或可检测信号是通过微光成像、荧 光光谱、X-光成像、磁共振成像（MRI)、磁共振光谱（MRS)、正电子成像术（PET)或者单光子 发射计算机断层扫描（SPECT)。
[0035] 本发明提供检测宿主体内病毒活性的方法，该方法通过给对象施用本发明提供的 任何LIVP病毒或克隆毒株进行。所述病毒含有编码可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋 白质的核酸，检测所述可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质，通过检测表明所述病毒 是活化的或者具有溶瘤活性。在这样的实例中，所述对象患有肿瘤或癌症。在所述方法的 实例中，检测可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质的步骤是来自对象的体液样品。例 如，所述体液是尿，血液，泪或者脑脊液。
[0036] 本发明提供含有本发明提供的任何LIVP病毒毒株或克隆毒株的宿主细胞。
[0037] 本发明提供一种选择用于癌症治疗和诊断的LIVP克隆毒株的方法，包括（i)提供 第一个LIVP病毒样品，其含有具有不同基因组序列的病毒颗粒的混合物；（ii)从所述样品 中选择及分离单个克隆分离株；（iii)测定每个克隆分离株的毒性；（iv)测定每个克隆分 离株的抗肿瘤发生能力；及（v)选择与参照LIVP病毒毒株相比呈现出更高抗肿瘤发生能 力和降低的毒性的克隆毒株，其中将呈现出降低的毒性和更高的抗肿瘤发生能力的克隆分 离株鉴定为用于癌症治疗或诊断的LIVP克隆毒株。在选择LIVP克隆毒株的方法中，参照 LIVP病毒可以是第一个LIVP病毒样品。在一些实例中，参照LIVP病毒是减毒的重组LIVP 病毒。例如，参照LIVP病毒是称作GLV-lh68的病毒，其基因组具有SEQ ID N0:9所示核苷 酸序列（GLV-lh68)。
[0038] 在选择或鉴定本发明提供的LIVP克隆毒株的方法中，第一个LIVP病毒样品可 以是LIVP病毒毒株或者任何其它本发明提供的其他毒株，所述LIVP病毒毒株具有SEQ ID N0:10所示基因组或者与SEQ ID N0:10至少99%相同的基因组。在其它实例中，第 一个LIVP病毒样品是一种混合物，其通过繁殖用LIVP毒株及另一病毒毒株、基因组DNA 或克隆的DNA感染的细胞，随后从培养物中分离病毒样品而获得，其中所述样品包含通 过感染产生的后代病毒。例如，另一病毒毒株可以是DNA病毒、双链RNA病毒、单链正义 (single-stranded positive sense) RNA病毒或者单链负义RNA病毒。所述DNA病毒可以 是痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或者痘苗病毒；疱疫病毒如单纯疱疫病毒（HSV)、巨细 胞病毒（CMV)、Epstein_Barr病毒（EBV)、嗜肝DNA病毒（例如乙型肝炎病毒）、多瘤病毒、乳 头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；或者单链DNA病毒，如细小病毒。例如，另一病毒毒株是痘 苗病毒毒株。在一些实例中，另一病毒是双链RNA病毒，所述双链RNA病毒是呼肠孤病毒如 轮状病毒。在实例中，其中另一病毒是单链正义RNA病毒，所述单链正义RNA病毒是小RNA 病毒（picornoviruses)如Seneca valley病毒、柯萨奇病毒或脊髓灰质炎病毒、肠道病毒； 披膜病毒如西门利克森林病毒；以及逆转录病毒如人免疫缺陷病毒（HIV)、鼠 Maloney白血 病病毒（MMLV)或者慢病毒。在进一步的实例中，其中另一个病毒是单链负义RNA病毒，所 述单链负义RNA病毒是正粘病毒，如流感病毒；副粘病毒如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎 病毒；或者棒状病毒如水泡性口炎病毒（VSV)。
[0039] 在本发明的选择或鉴别克隆毒株的方法中，从样品中选择单个克隆分离株的步骤 可以通过噬斑测定进行。例如，选择噬斑测定中最大的噬斑。在这样的实例中，可以选择最 大的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个噬斑，并分离为克隆分离 株，在所述方法的步骤（iii)和（iv)中测定每个噬斑的毒性和抗肿瘤发生能力。在其它实 例中，选择的噬斑大于由LIVP病毒样品产生的噬斑的平均大小。
[0040] 在本发明提供的选择克隆毒株的方法的步骤iii)中，毒性是在将选择的克隆分 离株施用于第一个对象及将参照病毒施用第二个对象时在体内评估的，其中第一个和第二 个对象是相同物种、大小和性别的，所述病毒是以相同或相似量在相同或相似给药方案下 施用于每个对象的；在对象中评估及测量指示毒性的参数，作为毒性作用的指示。例如，指 示毒性的参数是对象的存活降低或变弱、体重降低、发热、皮疹、过敏反应、疲劳、腹痛、对象 体内免疫应答诱导或者痘痕形成。在本发明的选择克隆毒株的方法的步骤V)中，选择呈现 出毒性降低的病毒包括：a)在第一个和第二个对象之间对比测量的指示毒性的参数，及b) 鉴定或选择与参照病毒呈现的毒性作用相比呈现出毒性作用降低的克隆分离株。例如，呈 现出毒性降低的克隆分离株是第一个对象的体重不降低，或者与第二个对象对比第一个对 象的体重降低减少。在其它实例中，呈现出毒性降低的克隆分离株是第一个对象与第二个 对象相比在治疗过程中的存活增加。在另外的实例中，选择呈现出毒性降低的克隆分离株， 其在治疗过程中不导致对象死亡。
[0041] 在本发明提供的选择克隆病毒毒株的方法的步骤iv)中，选择的克隆分离株和参 照病毒的抗肿瘤发生能力是在施用于对象时在体外或体内评估的；评估及测量指示抗肿瘤 发生能力的参数。例如，当施用以在体内评估其抗肿瘤发生能力时，将选择的克隆分离株施 用于第一个对象，并将参照病毒施用于第二个对象，其中第一个和第二个对象是相同物种、 大小和性别，所述病毒以相同或相似量及在相同或相似给药方案下施用于每个对象。指示 抗肿瘤发生能力的参数可包括肿瘤的感染性、病毒在肿瘤组织内的积累、肿瘤细胞内的病 毒核酸复制、肿瘤细胞内的病毒产生、肿瘤细胞内的病毒基因表达、肿瘤细胞的细胞毒性、 肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择性、降低的肿瘤大小、增加的肿瘤体积、降低的肿瘤重 量或者特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答的起始。在本发明提供的选择克隆病毒毒株的方 法的步骤v)中，选择呈现出更高抗肿瘤发生能力的病毒包括：c)对比由选择的克隆分离株 及参照病毒呈现的指示抗肿瘤发生能力的参数；及d)鉴定或选择与参照病毒呈现的抗肿 瘤发生能力相比呈现出更高抗肿瘤发生能力的克隆分离株。例如，更高的抗肿瘤发生能力 是指，在评估指示抗肿瘤发生能力的参数的体外或体内实验中，在相同测定中并在相同或 相似条件下，所述克隆分离株与参照病毒的抗肿瘤发生能力相比呈现出至少或大约或大约 至少 120 %、130 %、140 %、150 %、160 %、170 %、180 %、190 %、200 %、250 %、300 %、400 %、 500 %、600 %、700 %、800 %或更高的抗肿瘤发生能力。
[0042] 在本发明的选择克隆病毒毒株的方法中，施用于对象以在体内评估毒性或抗肿瘤 发生能力的步骤的对象是非人动物或者是人。在本发明的方法中，所述对象可具有肿瘤或 癌症。例如，所述肿瘤是乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤或者胰腺肿瘤。 所述肿瘤可以是异种移植物、同种异体移植物或者自发/天然肿瘤。
[0043] 在本发明的选择克隆病毒毒株的方法中，可以分析选择的克隆毒株的基因组，以 评估序列的同源性，由此仅选择具有同源基因组序列的那些分离株。例如，通过如测序、限 制性分析、PCR、Southern印迹或者蛋白质表达等方法分析基因组。
[0044] 本发明提供通过本发明的任何选择克隆毒株的方法产生或选择的克隆毒株。
[0045] 发明详述
[0046] 大纲
[0047] A.定义
[0048] B.分离克隆痘苗病毒毒株的方法
[0049] 1.亲代病毒制备物或混合物
[0050] 2.分离克隆毒株
[0051] 3.抗肿瘤发生
[0052] a.肿瘤相关复制指示物
[0053] b.细胞毒性
[0054] c.肿瘤生长
[0055] 4.毒性/安全性
[0056] 5.基因组分析
[0057] C.分离的克隆病毒毒株
[0058] 1. LIVP
[0059] 2. LIVP克隆毒株
[0060] 典型的LIVP克隆毒株
[0061] D. LIVP毒株的修饰
[0062] 1.异源核酸
[0063] 2.典型的修饰
[0064] a.诊断性基因产物
[0065] b.治疗性基因产物
[0066] c.抗原
[0067] d.改变病毒的减毒的修饰
[0068] 3.异源基因表达的控制
[0069] 4.产生修饰的病毒的方法
[0070] E.病毒的繁殖和产生
[0071] 1.繁殖的宿主细胞
[0072] 2.浓度确定
[0073] 3.保藏方法
[0074] 4.病毒的制备
[0075] F.药物组合物、组合和试剂盒
[0076] 1.药物组合物
[0077] 2.宿主细胞
[0078] 3.组合
[0079] 4.试剂盒
[0080] G.治疗、诊断和监测方法
[0081] 1.治疗方法
[0082] 2.诊断和监测方法
[0083] 3.施用
[0084] a.施用所述病毒之前的步骤
[0085] b.施用模式
[0086] c.剂量和给药方案
[0087] d.共同施用
[0088] i.施用多个病毒
[0089] ii.治疗性化合物
[0090] iii.免疫治疗和生物治疗
[0091] e.对象状态
[0092] 4.监测
[0093] a.监测病毒基因表达
[0094] b.监测肿瘤大小
[0095] c.监测抗体效价
[0096] d.监测一般健康状况诊断
[0097] e.监测协同治疗
[0098] H.实施例 [00"] A.定义
[0100] 除非特别指出，本发明所用的所有技术和学术用语均与本发明所属领域技术人员 通常理解的含义相同。除非特别指出，在本申请书中提及的所有专利、专利申请、公开的申 请和出版物、网站及其他公开的材料均通过引用的方式以其全部内容并入本文。当本文术 语有多个定义时，本章节中的定义优先。当述及URL或其它这种标示符或地址时，应理解为 这种标示符可改变并且互联网上的特定信息可以出现或消失，但是等价信息是已知的并且 可以容易获得，例如通过搜索互联网和/或合适数据库。其引用表明这种信息的可获得性 和公共传播。
[0101] 如本文所用，病毒制备物研究所的李斯特毒株（LIVP)或者LIVP病毒毒株是指减 毒的李斯特毒株（ATCC Catalog No. VR-1549)，由俄罗斯莫斯科的病毒制备物研究所通过 适应小牛皮而产生（Al'tshtein et al. (1985) Dokl.Akad.Nauk USSR285 :696-699)。所述 LIVP毒株可例如得自俄罗斯莫斯科的病毒制备物研究所（见例如Kutinova et al. (1995) Vaccinel3 :487-493) ；the Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova et al· (2010)Environ. Sci.Technol. 44 :5121-5126);或者可以得自莫斯科伊万诺夫斯基 病毒学研究所（C0355K0602;Agranovski et al· (2006)Atmospheric Environment 40: 3924-3929)。其也为本领域技术人员熟知，其是在USSR及亚洲和印度用于免疫接种的疫 苗毒株。所述毒株目前由研究人员使用并熟知（见例如Altshteyn et al. (1985)Dokl. Akad. Nauk USSR285 :696-699 ；Kutinova et al. (1994)Arch. Virol. 134：l-9 ；Kutinova et al. (1995)Vaccinel3 :487-493 ；Shchelkunov et al. (1993)Virus Research28 :273-283 ； Sroller et al. (1998)Archives Virologyl43 ： 1311-1320 ；Zinoviev et al. , (1994) Genel47 :209-214 ;and Chkheidze et al· (1993) FEBS336 :340-342)。在 LIVP 毒株中有一 种毒株，其含有具有SEQ ID NO :10所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO :10所示核苷酸序列 至少或者至少大约99%相同的序列的基因组。LIVP病毒毒株涵盖了通过在细胞系中重复 传代繁殖LIVP获得的任何病毒毒株或者病毒制备物。
[0102] 如本文所用，LIVP克隆毒株或LIVP克隆分离株是指源于通过噬斑分离或者繁殖 单个克隆的其它方法得到的LIVP病毒毒株的病毒，其具有序列同源的基因组。因此，LIVP 克隆毒株包括一种病毒，该病毒的基因组存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中。LIVP克 隆毒株不包括通过重组方式使用重组DNA方法遗传工程化导入异源核酸的重组LIVP病毒。 特别地，LIVP克隆毒株的基因组不含有具有编码异源蛋白质的开放读框的异源核酸。例如， LIVP克隆毒株的基因组不含有具有编码非病毒异源蛋白质的开放读框的非病毒异源核酸。 然而，如本文所述，应理解为本发明提供的任何LIVP克隆毒株在其基因组中可以通过重组 方式修饰以产生重组病毒。例如，可以修饰LIVP克隆毒株以产生重组LIVP病毒，其含有具 有编码异源蛋白质的开放读框的插入的核苷酸。
[0103] 如本文所用，LIVP 1. 1. 1是具有SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0104] 如本文所用，LIVP2. 1. 1是具有SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0105] 如本文所用，LIVP4. 1. 1是具有SEQ ID N0 :4所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :4所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0106] 如本文所用，LIVP5. 1. 1是具有SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0107] 如本文所用，LIVP6. 1. 1是具有SEQ ID N0 :6所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :6所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0108] 如本文所用，LIVP7. 1. 1是具有SEQ ID N0 :7所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :7所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0109] 如本文所用，LIVP8. 1. 1是具有SEQ ID N0 :8所示核苷酸序列的基因组或者具有 与SEQ ID N0 :8所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP 克隆毒株。
[0110] 如本文所用，修饰的LIVP病毒毒株是指具有在LIVP中不含有的基因组的LIVP病 毒，而是通过修饰衍生自LIVP的毒株的基因组产生的病毒。典型地，所述病毒的基因组通 过核苷酸的取代（置换）、插入（添加）或者缺失（截短）进行修饰。修饰可以使用本领域 技术人员已知的任何方法进行，如遗传工程和重组DNA方法。因此，修饰的病毒是其基因组 与亲代病毒的基因组相比有改变的病毒。典型的修饰的病毒具有插入病毒基因组中的一或 多个异源核酸序列。典型地，异源核酸含有编码异源蛋白质的开放读框。例如，本发明的修 饰的病毒可含有基因表达盒形式的一或多个异源核酸序列以表达异源基因。
[0111] 如本文所用，"通过重组方法产生"或者"使用重组DNA方法的方法"或者其变化用 语是指使用公知的分子生物学方法以表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
[0112] 如本文所用，"基因表达盒"或者"表达盒"是一种核酸构建体，含有能引起基因在 与这种序列相容的宿主中表达的核酸元件。表达盒包括至少启动子及可选地，转录终止信 号。典型地，表达盒包括与启动子可操纵地连接的被转录的核酸。表达盒可含有编码如治 疗性基因广物或者可检测的蛋白质或者可选择的标记基因的基因。
[0113] 如本文所用，LIVP GLV-lh68是一种LIVP病毒，其含有ruc-gfp (萤光素酶和绿色 荧光蛋白融合基因（见例如美国专利No. 5, 976, 796)，β -半乳糖苷酶（LacZ)和β -葡糖 苷酸酶（gusA)报道基因，分别插入在F14. 5L、J2R(胸苷激酶）和A56R(血凝素）基因座 中。GLV-lh68的基因组具有SEQIDN0:9所示核苷酸序列，或者与SEQIDN0:9所示核苷 酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列。
[0114] 如本文所用，病毒制备物，如LIVP病毒制备物，是指通过病毒毒株如LIVP病毒毒 株、LIVP克隆毒株或者修饰或重组的病毒毒株在体内或体外在培养系统中繁殖获得的病毒 组合物。例如，LIVP病毒制备物是指通过在宿主细胞中繁殖病毒毒株获得的病毒组合物，典 型是通过从培养系统中使用本领域已知的标准方法进行纯化。病毒制备物通常由许多病毒 颗粒或毒粒组成。如果需要，样品或制备物中病毒颗粒的数目可以使用噬斑实验确定，该实 验假定每个形成的噬斑代表一种感染性病毒颗粒，计算每单位体积的样品噬斑形成单位的 数目（pfu/mL)。制备物中每个病毒颗粒或毒粒与其它病毒颗粒相比可具有相同的基因组序 列（即所述制备物的序列是同源的），或者可具有不同的基因组序列（即所述制备物的序列 是异源的）。本领域技术人员已知在不存在克隆分离的情况中，病毒基因组的异源性或多样 性可随着病毒的再生而发生，如通过在病毒毒株的天然选择过程中发生的同源重组事件而 发生（Plotkin&Orenstein(eds) "Recombinant Vaccinia Virus Vaccines，'in Vaccines， 3rd edition (1999))。
[0115] 如本文所用，病毒混合物是一种病毒制备物，其含有基因组序列不同的许多病毒 颗粒。所述病毒混合物可以通过用两或多个不同病毒毒株或者一个病毒毒株和基因组DNA 或克隆的DNA感染培养系统如宿主细胞，随后对所得病毒进行繁殖和纯化而获得。对于本 发明而言，LIVP病毒制备物可包括通过繁殖用LIVP毒株及另一病毒、基因组DNA或克隆的 DNA感染细胞，及随后从培养物中分离病毒制备物而获得的病毒混合物，其中所述制备物含 有通过感染产生的后代病毒。例如，另一病毒毒株可以是痘病毒，如禽痘病毒，粘液瘤病毒 或其它痘苗病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒（HSV)、巨细胞病毒（CMV)、Epstein-Barr病毒 (EBV)、嗜肝DNA病毒（如乙型肝炎病毒）、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；以 及单链DNA病毒，如细小病毒。另一病毒可以是减毒的病毒、溶瘤病毒或者具有已知的抗肿 瘤活性和/或中等至轻度毒性的其它病毒。
[0116] 如本文所用，"病毒"是指离开宿主细胞不能生长或复制的任何一大群感染性实 体。病毒典型含有在遗传物质RNA或DNA核心周围的蛋白质外壳，但是没有半透膜，仅能在 活细胞中生长和增殖。病毒包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、 逆转录病毒、棒状病毒、乳头瘤病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小核糖核酸 病毒、辛德毕斯病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、柯萨基病毒、流感病毒、腮腺炎病 毒、脊髓灰质炎病毒、及西门利克森林病毒。
[0117] 如本文所用，溶瘤病毒是指在患有肿瘤的对象中在肿瘤细胞中选择性复制的病 毒。一些溶瘤病毒在感染肿瘤细胞之后可杀死该肿瘤细胞。例如，溶瘤病毒可通过裂解肿 瘤细胞或者诱导肿瘤细胞死亡而导致肿瘤细胞死亡。
[0118] 如本文所用，参照LIVP病毒的"减毒的LIVP病毒"是指与LIVP相比呈现出降低 的或减少的毒力、毒性或者致病原性的病毒。
[0119] 如本文所用，病毒的"毒性"（在本文也称作毒力或致病原性）是指在施用该病毒 时对宿主的有害或毒性作用。对于溶瘤病毒，如LIVP，病毒的毒性与其在非肿瘤器官或组织 中的积累相关，该积累可影响宿主的存活或者导致有害或毒性作用。毒性可以通过评估指 示毒性的一或多个参数进行测量。这些参数包括在非肿瘤组织中的积累及对于已经施用该 病毒的对象的存活或健康的影响，如对体重的影响。
[0120] 如本文所用，"指示毒性的参数"是指与其毒性、毒力或致病原性相关的由病毒介 导的性质。指示毒性的参数通常在施用对象时在体内评估。典型的指示毒性的参数包括但 不限于对象的存活降低，体重降低，发热，皮疹，过敏反应，疲乏，腹痛，对象体内免疫应答的 诱导及痘痕形成。评估任何上述参数或本领域技术人员已知的其它毒性性质的测定或测量 法在本说明书中描述或者为本领域技术人员已知。因此，在宿主中介导任一或多种上述活 性或性质的病毒呈现出一定程度的毒性。
[0121] 如本文所用，"降低的毒性"是指在将病毒施用宿主时的毒性或有害作用与未用该 病毒处理的宿主相比或者与施用另一参照或对照病毒的宿主相比减弱或减少。对于本发明 的目的，典型的参照或对照病毒是称作GLV-lh68的LIVP病毒。毒性是否降低或减少可以 通过评估病毒及如果需要也评估对照或参照病毒对于指示毒性的参数的作用而确定。应理 解为当对比两或多个病毒的活性时，在体外测定中使用的或者在体内施用的病毒的量（例 如pfu)是相同或相似的，并且体外测定或体内评估的条件（例如体内给药方案）是相同或 相似的。例如，当对比在体内施用病毒和对照或参照病毒的作用时，所述对象是相同物种、 大小、性别的，并且所述病毒是在相同或相似给药方案下以相同或相似量施用的。特别地， 具有降低的毒性的病毒可意味着当将该病毒施用于宿主时，如治疗疾病，该病毒在宿主的 非肿瘤器官和组织中不积累至导致损害或伤害宿主的程度，或者其使宿主的存活与对照或 参照病毒相比至更高程度。例如，具有降低的毒性的病毒包括在治疗期间不导致对象死亡 的病毒。
[0122] 如本文所用，病毒在特定组织中的积累是指在将病毒施用于宿主足以感染宿主器 官或组织的一段时间之后，该病毒在宿主生物体的特定组织的分布。正如本领域技术人员 所知，病毒的感染时间根据病毒、器官或组织、宿主的免疫活性剂病毒的剂量而变化。通常 地，积累可以在病毒感染后少于1天、大约1天至大约2、3、4、5、6或7天，大约1周至大约 2、3或4周，大约1个月至大约2、3、4、5、6个月或更长时间的时间点确定。对于本发明，病 毒优先在宿主的免疫豁免的组织中积累，如炎症组织或肿瘤组织，但是从其它组织和器官 如非肿瘤组织中清除，该病毒的毒性是轻度或者可耐受程度，至多也不致命。
[0123] 如本文所用，"优先积累"是指病毒在第一个位置比在第二个位置以更高水平积累 (即在第一个位置病毒颗粒的浓度或效价高于在第二个位置病毒颗粒的浓度）。因此，相对 于正常组织或器官优先在免疫豁免组织（躲避免疫系统的组织）如炎症组织和肿瘤组织中 积累的病毒，是指与在正常组织或器官中的病毒积累相比，在免疫豁免组织如肿瘤中以更 高水平（即浓度或病毒效价）积累的病毒。
[0124] 如本文所用，"抗肿瘤活性"或者"抗肿瘤发生的"是指病毒毒株在对象中在体外或 体内阻止或抑制肿瘤形成或生长。抗肿瘤活性可以通过评估指示抗肿瘤活性的一或多个参 数而确定。
[0125] 如本文所用，"指示抗肿瘤活性或抗肿瘤发生活性的参数"是指由病毒介导的与抗 肿瘤活性相关的性质。指示抗肿瘤活性的参数可以在施用于对象时在体外或体内评估。典 型的指示抗肿瘤活性的参数包括但不限于肿瘤细胞的感染性，病毒在肿瘤组织中的积累， 肿瘤细胞中病毒核酸复制，肿瘤细胞中病毒产生，肿瘤细胞中病毒基因表达，肿瘤细胞的细 胞毒性，肿瘤细胞选择性，肿瘤细胞类型选择性，降低的肿瘤大小，增加的肿瘤体积，降低的 肿瘤重量及特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答的起始。评估任何上述参数或其它抗肿瘤发 生性质的实验是本领域技术人员已知的。本文描述了典型的典型的实验。因此，呈现出任 一或多种上述活性或性质的病毒呈现出抗肿瘤活性。
[0126] 如本文所用，"更高的"或"改良的"抗肿瘤活性或抗肿瘤发生能力是指病毒毒株能 在体外或体内阻止或抑制对象中肿瘤的形成或生长至高于参照或对照病毒的程度或者高 于未用病毒处理的程度。对于本发明，典型的参照或对照病毒是称作GLV-lh68的LIVP病 毒。抗肿瘤活性是否"更高"或"改良"可以通过评估病毒，如果需要也评估对照或参照病 毒对指示抗肿瘤活性的参数的作用而确定。应理解为当对比两或多个不同病毒的活性时， 体外测定中使用的或者体内施用的病毒的量（如pfu)是相同或相似的，及在体外测定或体 内评估的条件（如体内给药方案）是相同或相似的。
[0127] 如本文所用，异源核酸（也称作外源核酸或外来核酸）是指不是由表达其的生 物体或病毒在体内正常产生的，或者由生物体或病毒在不同的基因座产生的核酸，或者该 核酸介导或编码中介物，通过影响转录、翻译或者其它可调生物化学过程而改变内源核酸 (如DNA)表达。因此，异源核酸通常对于其导入的病毒而言不是天然内源的。异源核酸可 以是指来自另一病毒的核酸分子，该病毒在相同生物体或另一生物体中，包括相同物种或 另一物种。然而，异源核酸可以是内源的，不过是在不同基因座中表达的或者其表达或序列 改变了的核酸（如质粒）。因此，异源核酸包括不与基因组中发现的对应的核酸分子（如 DNA)精确定向或定位存在的核酸分子。通常地，但是非必然，这种核酸编码不是由所述病 毒正常产生的或者同样不是其表达的病毒中的RNA和蛋白质。任何核酸（如DNA)在病毒 中表达，而本领域技术人员承认或认为该核酸相对于该病毒是异源、外源或外来的，则该核 酸在本文涵盖在异源核酸范围内。异源核酸的范例包括但不限于编码外源肽/蛋白质的核 酸，该肽/蛋白包括诊断剂和/或治疗剂。由异源核酸编码的蛋白质可以在病毒内表达，分 泌或表达在已经导入异源核酸的病毒的表面上。
[0128] 如本文所用，含有异源核酸的病毒克隆毒株或病毒毒株制备物是指这样的毒株， 其含有在亲代克隆毒株中不存在的核酸。例如，其序列如SEQ ID N0 :10所示的病毒是克隆 毒株，但是称作GLV-lh68的SEQ ID N0 :9所示的病毒含有异源核酸，如称作RUC-GFP的插 入体。
[0129] 如本文所用，异源蛋白质或异源多肽（也称作外源蛋白质、外源多肽、外来蛋白质 或外来多肽）是指不是由病毒正常产生的蛋白质。
[0130] 如本文所用，异源核酸与核苷酸序列的调节子和效应子如启动子、增强子、转录和 反义终止位点及其它信号序列的可操纵连接，是指这种核酸（如DNA)与这种核苷酸序列之 间的关系。因此，可操纵地连接或操纵关联是指核酸如DNA与核苷酸的调节或效应序列如 启动子、增强子、转录和反义终止位点及其它信号序列的功能关系。例如，异源DNA与启动 子的可操纵连接是指DNA与启动子之间的物理关系，于是这个DNA的转录通过特异性识别、 结合及转录该DNA的RNA聚合酶从该启动子起始。为了优化表达和/或转录，必须除去、添 加或改变克隆的5'非翻译区，以消除额外的、潜在不合适的可变翻译起始（即开始）密码 子或者在转录或翻译水平可干扰或降低表达的其它序列。此外，共有的核糖体结合位点可 以直接地插入在起始密码子的5'端，并且可以增强表达（见例如Kozak J. Biol. Chem. 266 : 19867-19870(1991)及 Shine and Delgarno, Nature254 (5495) :34-38(1975))。这种修饰 的可取性（或者需求）可以根据经验确定。
[0131] 如本文所用，异源启动子是指不是在野生型生物体或病毒中正常发现的或者与野 生型生物体或病毒相比在不同基因座的启动子。异源启动子通常对于其导入之中的病毒不 是内源的，而是得自另一病毒或者是合成制备的。异源启动子可以是指来自相同生物体或 另一生物体、包括相同物种或另一物种的另一病毒的启动子。然而，异源启动子可以是内源 的，但是其序列有改变的或者在不同基因座（例如在基因组中不同位置或在质粒上）出现 的启动子。因此，异源启动子包括与基因组中发现的对应启动子相比其精确方向或位置不 完全相冋的启动子。
[0132] 合成的启动子是异源启动子，其具有非天然发现的核苷酸序列。合成的启动子可 以是具有合成的序列或者衍生自天然启动子或其一部分的序列的核酸分子。合成的启动子 也可以是杂种启动子，由衍生自不同的天然启动子的不同元件组成。
[0133] 如本文所用，给药方案是指如病毒或其它物质的施用量，以及在施用周期过程中 的施用频率。所述给药方案与治疗的疾病或病症相关联，因此是可变的。
[0134] 如本文所用，施用频率是指在施用周期期间施用的物质的次数。例如，施用频率可 以是天、周或月。例如，频率可以是在施用期间施用一次，两次，三次，四次，五次，六次或七 次。所述频率可以是指在施用周期期间的连续天数。特定的频率与治疗的特定疾病或病症 相关。
[0135] 如本文所用，"施用周期"是指重复的施用病毒的给药方案，其在连续的施用中重 复。例如，典型的施用周期是28天循环。
[0136] 如本文所用，治疗患有病症、失调或疾病的对象是指改善或者另外有益地改变所 述病症、失调或疾病的症状的任何方式。治疗涵盖本发明描述和提供的病毒的任何药物学 应用。
[0137] 如本文所用，疾病或失调是指生物体中得自如感染或遗传缺陷的病理学状况，特 征在于可鉴别的症状。如本发明所述典型的疾病是肿瘤疾病，如癌症。
[0138] 如本文所用，肿瘤疾病是指包括癌症的任何病症，包括肿瘤发生、生长、转移和进 展。
[0139] 如本文所用，癌症是以任何类型恶性肿瘤为原因或者特征的疾病，包括转移癌，淋 巴肿瘤和血癌。典型的癌症包括但不限于白血病，淋巴瘤，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌， 子宫颈癌，膀胱癌，前列腺癌，胶质瘤，腺癌，肝癌和皮肤癌。在人体中的癌症例如包括膀胱 癌，乳腺癌，前列腺癌，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌和CNS癌（如胶质瘤），子宫 颈癌，绒毛膜癌结肠癌和直肠癌，结缔组织癌，消化系统癌症；子宫内膜癌，食管癌；眼癌； 头颈癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肺癌（如小细胞和非小细胞肺癌）；淋巴 瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤，成神经细胞瘤，口腔癌（如唇、舌、口和 咽）；卵巢癌；胰腺癌，眼癌；横纹肌肉瘤；直肠癌，肾癌，呼吸系统癌；肉瘤，皮肤癌；胃癌， 睾丸癌，甲状腺癌；子宫癌，泌尿系统癌，以及其它癌和肉瘤。通常在狗、猫及其它宠物中诊 断的癌症例如包括但不限于淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳腺肿瘤，肥大细胞瘤，脑肿瘤，黑素瘤，腺 鳞癌，肺类癌，支气管腺癌，细支气管腺癌，纤维瘤，粘液软骨瘤，肺肉瘤，神经肉瘤，骨瘤，乳 头瘤，眼癌，Ewing' s肉瘤，Wiln^ s肿瘤，BurkitC s淋巴瘤，小神经胶质细胞瘤，成神 经细胞瘤，破骨细胞瘤，口腔瘤形成，纤维肉瘤，骨肉瘤和横纹肌肉瘤，生殖器鳞状细胞癌， 可传染性性病瘤，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，睾丸支持细胞瘤，血管外皮细胞瘤，组织细胞瘤， 绿色瘤（如粒细胞性肉瘤），角膜乳头瘤，角膜鳞状细胞癌，血管肉瘤，胸膜间皮瘤，基底细 胞瘤，胸腺瘤，胃肿瘤，肾上腺癌，口腔乳头瘤病，血管内皮瘤和囊腺瘤，滤泡性淋巴瘤，肠道 淋巴肉瘤，纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。典型的在啮齿类动物如雪貂中诊断的癌症包括但不 限于胰岛瘤，淋巴瘤，肉瘤，神经瘤，胰岛细胞肿瘤，胃MALT淋巴瘤及胃腺癌。典型的影响农 业牲畜的瘤形成包括但不限于白血病，血管外皮细胞瘤和牛眼瘤形成（在牛中）；包皮纤维 肉瘤，溃疡性鳞状细胞癌，包皮癌，结缔组织瘤形成和肥大细胞瘤（在马中）；肝细胞性肝癌 (在猪中）；淋巴瘤和肺腺瘤病（在绵羊中）；肺肉瘤，淋巴瘤，Rous肉瘤，网状内皮组织增殖 症，纤维肉瘤，肾母细胞瘤，B细胞淋巴瘤和类淋巴白血病（在禽类中）；眼癌，肝脏瘤形成， 淋巴肉瘤（成淋巴细胞性淋巴瘤），浆细胞样白血病和鱼鳔肉瘤（在鱼中），干酪样淋巴结 炎（CLA):由假结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis)细菌导致的绵羊和 山羊的慢性，传染性，接触性疾病，及由南非羊肺炎导致的绵羊的传染性肺部肿瘤。
[0140] 如本文所用，"转移"是指癌症从身体的一部分至另一部分的传播。例如，在转移的 过程中，恶性细胞可以在恶性细胞从中出现的原发肿瘤部位传播，移动至淋巴管和血管中， 其将细胞转运至生物体内的正常组织，在此所述细胞继续增殖。由已经转移传播的细胞形 成的肿瘤称作"转移瘤"、"继发肿瘤"或者"转移"。
[0141] 如本文所用，对患有肿瘤疾病、包括肿瘤或转移瘤的对象的治疗，是指其中肿瘤病 的症状得以减轻或另外有益地改变的任何治疗方式。典型地，对象中肿瘤或转移瘤的治疗 涵盖了导致如下改变的任何治疗方式：肿瘤生长减缓、肿瘤细胞裂解、肿瘤大小降低、预防 新肿瘤生长、或者预防原发转移，包括已知肿瘤血管化、肿瘤细胞分化、肿瘤细胞迁移或者 基底I吴或胞外基质降解。
[0142] 如本文所用，特定病症的改善或减轻，如通过施用特定的药物，是指任何减轻，无 论永久还是暂时的，持久还是短暂的，其可归因于或者与所述组合物的施用相关。
[0143] 如本文所用，病毒或化合物治疗特定疾病的有效量或者治疗有效量是改善或者以 某些方式减轻与该疾病相关症状的量。所述有效量根据个体不同而变化，依赖于许多因素， 包括但不限于年龄、体重、患者的整体身体状况以及疾病的严重度。治疗有效量可以作为单 一剂量施用，或者可以根据给药方案以多剂量施用，所述剂量是有效的。所述剂量可以治愈 疾病，但是典型是为了改善疾病的症状而施用的。可需要重复施用以实现希望的症状减轻。
[0144] 如本文所用，治疗肿瘤病、包括肿瘤或转移瘤的病毒或化合物的有效量或者治疗 有效量是改善或者以某些方式减轻与肿瘤病相关症状的量，包括但不限于减缓肿瘤生长， 肿瘤细胞裂解，肿瘤大小降低，预防新肿瘤生长，或者预防原发肿瘤的转移。
[0145] 如本文所用，关于肿瘤治疗的"治疗指数"是指治疗的能力，包括用本发明提供的 病毒治疗或者与本发明提供的病毒的组合治疗，以导致肿瘤生长减慢和/或肿瘤体积降 低。典型地，治疗指数以与对照治疗如未用病毒治疗的比率表示。治疗指数越高，表示减慢 肿瘤生长和/或降低肿瘤体积的治疗更有效。
[0146] 如本文所用，"延迟的复制"是指治疗性病毒在肿瘤中不能有效复制。呈现出延迟 复制的治疗性病毒可具有在肿瘤细胞中复制的能力，但是以较慢的复制速度复制。在感染 肿瘤之后在肿瘤中呈现出延迟复制的病毒与未呈现出延迟复制的病毒的治疗效力不一样。
[0147] 如本文所用，术语"治疗性病毒"是指用于治疗疾病或病症如肿瘤病如癌症、肿瘤 和/或转移瘤或者炎症或者创伤或者用于诊断或者用于治疗和诊断这二者而施用的病毒。 通常地，本发明的治疗性病毒是呈现出抗肿瘤活性和最小毒性的病毒。
[0148] 如本文所用，肿瘤（tumor)，也称作瘤（neoplasm)，是当细胞以异常高速度增殖时 产生的一种异常组织团块。肿瘤可示出部分或全部缺失正常组织的结构组构及与功能协 调。肿瘤可以是良性（非癌性）或者恶性的（癌性）。如本文所用，肿瘤是指涵盖了造血组 织肿瘤以及实体肿瘤。
[0149] 恶性肿瘤可以大体分为三种主要类型。癌瘤是从上皮结构（如乳腺、前列腺、肺、 结肠、胰腺）中产生的恶性肿瘤。肉瘤是源自结缔组织或者间充质细胞如肌肉、软骨、脂肪 或骨的恶性肿瘤。白血病和淋巴瘤是影响造血组织（关于血细胞形成的结构）包括免疫系 统成分的恶性肿瘤。其它恶性肿瘤包括但不限于神经系统肿瘤（例如纤维神经瘤），生殖细 胞肿瘤，及母细胞（blastic)肿瘤。
[0150] 如本文所用，增生性病症包括涉及细胞异常增殖的任何病症（即与正常组织生长 相比细胞增殖更快速），例如但不限于肿瘤疾病。
[0151] 如本文所用，"肿瘤细胞"是肿瘤细一部分的任何细胞。典型地，本发明提供的病毒 优先感染对象中的肿瘤细胞而非正常细胞。
[0152] 如本文所用，"转移细胞"是具有转移潜力的细胞。转移细胞具有从对象的第一个 转移的能力及可以在不同部位植入组织，在此部位形成第二个肿瘤。
[0153] 如本文所用，"肿瘤发生细胞"是当导入对象的合适部位中时可以形成肿瘤的细 胞。所述细胞可以是非转移或转移的。
[0154] 如本文所用，"正常细胞"是非衍生自肿瘤的细胞。
[0155] 如本文所用，术语"细胞"是指活的生物体的结构和功能的基本单位，与生物科学 中的通常理解相同。细胞可以是单细胞生物，其是自足的及可以独立于其它细胞的功能整 体而存在。细胞也可以是当未分离自其天然存在的环境中时，是由一种以上类型细胞组成 的多细胞生物体的一部分。这种细胞，可被认为是"非生物体"或"非生物"细胞，通常是专 门化的，其仅履行多细胞生物作为整体所履行的功能的亚集合。因此，这种类型的细胞不是 单细胞生物。这种细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括动物细胞，如哺乳动物细胞，人细 胞和非人动物细胞或者非人哺乳动物细胞。动物细胞可包括可在动物中发现的任何动物来 源细胞。因此，动物细胞包括如组成动物的各种器官、组织和系统的细胞。
[0156] 如本文所用，"分离的细胞"是在体外存在的细胞，与其最初衍生自之中的生物体 分离。
[0157] 如本文所用，"细胞系"是衍生自在体外能稳定生长许多世代的原代细胞的一群细 胞。细胞系通常被称作"永生化"细胞系以描述其在体外持续增殖的能力。
[0158] 如本文所用，"肿瘤细胞系"是最初衍生自肿瘤的一群细胞。这种细胞典型已经经 历了在体内的一些改变，由此其理论上在培养中具有无限生长能力；与原代细胞不同，其仅 可以培养有限的一段时间。此外，这种细胞在被注射进易感动物体内之后优选可以形成肿 瘤。
[0159] 如本文所用，"原代细胞"是已经分离自对象的细胞。
[0160] 如本文所用，"宿主细胞"或"靶细胞"可互换使用，是指可以由病毒感染的细胞。
[0161] 如本文所用，术语"组织"是指通常起作用以在生物体内进行特定功能的相似细胞 的组合、集合或聚集体。
[0162] 如本文所用，术语免疫豁免的细胞和免疫豁免的组织是指这样的细胞和组织，如 实体肿瘤，其从免疫系统中逃脱。通常地，将病毒施用对象激发从该对象清除病毒的免疫应 答。然而，免疫豁免的部位是免疫应答屏蔽或逃脱的，使得病毒存活及通常进行复制。免疫 豁免的组织包括增殖中的组织，如肿瘤组织。
[0163] 如本文所用，治疗剂是改善疾病或病症的症状或改善疾病或病症的物质。治疗剂、 治疗性化合物或者治疗方案包括常规的药物和药物疗法，包括进行治疗或预防的疫苗（即 降低获得特定疾病或病症的危险），这些物质为本领域技术人员已知的且在本文中也有描 述。治疗肿瘤病的治疗剂包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡的成分，其可以被激 活以抑制细胞生长或促进细胞死亡，或者激活另一制剂以抑制细胞生长或促进细胞死亡。 用于本发明提供的方法中的治疗剂可以是例如抗癌剂。典型的治疗剂包括例如治疗性微 生物，如治疗性病毒和细菌、细胞因子、生长因子、光增敏剂、放射性同位素、毒素、抗转移剂 物、信号调节物、抗癌抗生素、抗癌性抗体、血管发生抑制剂、放射性治疗、化疗化合物或者 其组合。
[0164] 如本文所用，抗癌剂或化合物（可与"抗肿瘤或抗瘤剂"互换使用）是指用于抗癌 治疗的任何物质或化合物。这些物质包括当单独使用或者与其它化合物或治疗组合使用时 可减轻、降低、改善、预防或者稳定或维持临床症状或者与肿瘤病、肿瘤和癌症相关的诊断 标记的缓和状态，并可用于本发明提供的方法、组合和组合物中。抗癌剂包括抗转移剂。典 型的抗癌剂包括但不限于化疗化合物（如毒素、烷化剂、亚硝基脲、抗癌抗生素、抗转移制 齐IJ、抗有丝分裂剂、局部异构酶抑制剂）、细胞因子、生长因子、激素、光增敏剂、放射性同位 素、信号调节物、抗癌抗体、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸（如反义RNA和siRNA)、血管发生抑制 齐U、放射性治疗或者其组合。典型的化疗化合物包括但不限于Ara-C、顺钼、卡钼、紫杉醇、阿 霉素、吉西他滨、喜树碱、伊立替康、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、长春新碱、5-氟尿嘧啶及氨甲 喋呤。如本文所用，除非特别指出，提及的抗癌或化疗剂包括多种抗癌或化疗剂的组合。
[0165] 如本文所用，"化疗敏化剂"是调节、减弱、逆转或者影响细胞或生物体对指定化疗 药物或化合物的抗性的物质。术语"调节物"、"调节剂"、"减毒物"、"减毒剂"或者"化疗增 敏剂"可互换使用，是指"化疗敏化剂"。在一些实例中，化疗敏化剂也可以是化疗剂。典 型的化疗敏化剂包括但不限于放射，钙通道阻断剂（如异搏定），钙调蛋白抑制剂（如三氟 批啦嗪（trifluoperazine))，卩引哚生物碱（如利血平），喹啉（如奎宁），亲溶酶体剂（如 氯喹），类固醇（如孕酮），三苯乙醇类似物（如三苯氧胺），洗漆剂（如Cremophor EL)， texaphyrins，及环形抗生素（如环孢菌素）。
[0166] 如本文所用，在肿瘤或其它免疫豁免部位产生的化合物是指在肿瘤或肿瘤环境中 由于导入的病毒、通常是表达一或多个基因产物的重组病毒的存在而产生的任何化合物。 例如，在肿瘤中产生的化合物可例如是由重组多肽产生的编码的多肽或RNA，代谢物，或者 由重组多肽及肿瘤或免疫豁免的组织或细胞的细胞机构产生的化合物。
[0167] 如本文所用，对象包括任何生物体，包括考虑对其进行诊断、筛选、监测或治疗的 动物。动物包括哺乳动物如灵长类动物和驯化动物。典型的灵长类动物是人。患者是指患 有疾病或者其疾病待确定或者经确定处于疾病危险中的对象，如哺乳动物、灵长类动物、人 或家畜对象。
[0168] 如本文所用，施用的输送载体是指基于脂质的或者其它基于聚合物的组合物，如 脂质体、胶团（micelle)或反胶团，其与如本发明提供的病毒等制剂结合，输送至宿主对象 体内。
[0169] 如本文所用，载体（或者质粒）是指核酸构建体，其含有用于将异源核酸导入细胞 中以表达所述核酸或核酸复制的分立的元件。所述载体典型保持附加型，但是可以设计为 实现基因或其一部分稳定整合进基因组染色体中。这种载体的选择和使用为本领域技术人 员熟知。表达载体包括能表达与调节序列可操纵地连接的DNA的载体，如启动子区域，其能 实现所述DNA片段的表达。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重 组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为 本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体，及保持附加 型的那些载体，或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
[0170] 如本文所用，术语"病毒载体"根据其在本领域公认的含义使用。其是指核酸载 体，包括至少一个病毒源元件，并可以包装进病毒载体颗粒中。所述病毒载体颗粒可用于将 DNA、RNA或者其它核酸转移至在体外或体内的细胞中。病毒载体包括但不限于痘病毒载体 (如痘苗病毒载体）、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体（如HSV)、杆状病毒载体、 巨细胞病毒（CMV)载体、乳头瘤病毒载体、猿猴病毒（SV40)载体、西门利克森林病毒载体、 噬菌体载体、腺病毒载体及腺相关病毒（AAV)载体。
[0171] 如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸（PNA)及其混合物。核 酸可以是单链或双链的。核酸可编码基因产物，如多肽、调节RNA、microRNA、siRNA和功能 RNA。
[0172] 如本文所用，在提及反义寡核苷酸时，与RNA的至少一部分互补的序列是指具有 足够互补性的能与所述RNA杂交、通常在中等或高严格条件下杂交形成稳定双链体的核苷 酸序列；在双链反义核酸的情况中，可因此测定双链DNA(即dsRNA)的单一链，或者可以测 定三链体形成。杂交的能力依赖于互补程度及反义核酸的长度。通常地，杂交核酸越长，与 其可含有的编码RNA的碱基错配越多，仍形成稳定的双链体（或者三链体，根据具体情况而 定）。本领域技术人员可以确定错配的可耐受程度，通过使用标准程序确定杂交的复合物的 解链点而确定。
[0173] 如本文所用，可检测的标记或者可检测的组分或者诊断组分（也称作成像标记、 成像剂或者成像组分）是指一种原子、分子或者组合物，其中所述原子、分子或组合物的存 在可以直接或间接测量到。可检测标记可用于使本发明提供的任一或多个病毒成像。可检 测标记可用于本发明提供的任何方法中。可检测标记包括例如化学发光组分，生物光组分， 荧光组分，放射性同位素和金属。检测标记的方法为本领域熟知。这种标记可以例如通过 目测、荧光光谱、反射测量、流式细胞计量术、X-射线、各种磁共振方法如磁共振成像（MRI) 和磁共振波谱（MRS)检测。检测方法也包括任何多种的断层X光摄影方法包括计算机断 层扫描（CT)，轴向计算层析成象技术（CAT)，电子束计算机体层摄影（EBCT)，高分辨率计算 机断层扫描（HRCT),内摆线断层X射线照相术（hypocycloidal tomography)、正电子成像 术（PET)、单一光子发射计算机断层X射线照相术（SPECT)、螺旋计算机断层X射线照相术 和超声断层X射线照相术。可检测标记的直接检测是指例如可检测标记自身的物理现象的 测量，如所述标记自身的能量或离子发射或吸收，例如通过X-射线或MRI测量。间接检测 是指测量原子、分子或组合物直接或间接结合可检测标记的物理现象，如直接或间接结合 可检测标记的原子、分子或组合物的能量和离子发射或吸收。在间接检测的非限制性实例 中，可检测标记可以是生物素，其可以通过与抗生物素蛋白的结合进行检测。非标记的抗生 物素蛋白可以全身性施用以阻断非特异性结合，随后全身性施用标记的抗生物素蛋白。因 此，可检测标记或可检测组分的范围包括可结合的标记或者可结合的组分，其是指原子、分 子或组合物，其中所述原子、分子或组合物的存在可以根据所述标记或组分结合另一原子、 分子或组合物的结果进行检测。典型的可检测标记包括例如金属如胶态金，铁，钆和镓-67， 荧光组分，及放射性同位素。典型的荧光组分和放射性同位素在本文别处提供。
[0174] 如本文所用，放射性核素、放射性同位元素或者放射性同位素可互换使用，是指具 有不稳定核的原子。所述核特征在于可用于传递给核内新产生的放射粒子或者传递给原 子电子的过量的能量。所述放射性同位素在这个过程中经历放射活性衰退，并发射Y射 线和/或亚原子粒子。这种发射可以在体内检测，通过例如但不限于正电子成像术（PET)， 单光子发射计算机断层扫描（SPECT)或者平面γ射线成像等方法进行。放射性同位素可 以天然存在，但是也可以是人工产生的。用于体内成像的典型的放射性同位素包括但不限 于 nC，13C，13N，15N，150, 18F，19F，32P，52Fe，51Cr， 55Co, 55Fe，57Co, 58Co, 57Ni，59Fe6°Co, 64Gu，67G^^ 188Re，192Ir，198AU，211At， 212Bi，213Bi和241Am。放射性同位素可以掺入或者附着于化合物，如代 谢化合物。可以掺入或者与代谢化合物如核苷类似物连接的典型的放射性同位素包括但不 限于231，1241， 1251，1311，18F，19F，nC， 13C，14C，75Br，76Br和3H。典型的放射标记的化合物包括核苷 类似物，例如但不限于放射标记形式的1-(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-碘 尿嘧啶（FIAU)，l-(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-乙基尿嘧啶（FEAU)， 1_(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-甲基尿嘧啶（FMAU)，3'-脱氧-3'-氟代 胸苷（FLT)，9-[4'-氟-3'-(羟基甲基）丁基]鸟嘌呤（FHBG)和9-[(3'-氟-1'-羟 基-2'-丙氧基）甲基]鸟嘌呤（FHPG)，例如[ 1251]-1-(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿 糖呋喃基）-5_碘尿嘧啶（[125I]_FIAU)，[ 1241]-1-(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃 基）-5-碘尿嘧啶（[124I] -FIAU)，[18F] -1- (2'-脱氧-2'-氟-β -D-阿糖呋喃基）-5-碘 尿嘧啶（[18F]_FIAU)，[18F]-l-(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-乙基尿嘧 啶（[ 18F]-FEAU)，[18F]-l-(2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-甲基尿嘧啶 ([ 18F] -FMAU)，[18F] -3'-脱氧-3'-氟代胸苷（[18F] -FLT)，[18F] -9- [4'-氟-3'-(羟 基甲基）丁基]鸟嘌呤（[18F]-FHBG)及[18F]-9-[(3'-氟-1'-羟基-2'-丙氧基）甲 基]鸟嘌呤（[ 18f]-fhpg)。
[0175] 如本文所用，磁共振成像（MRI)是指使用核磁共振光谱仪在固体、特别是在人细 胞、组织和器官中产生特异原子和分子结构的电子图像。MRI是一种非侵入性诊断技术，其 使用核磁共振产生器官及其它身体内部结构的横切面图像。所述对象躺在含有强电磁铁的 大的空心圆筒内部，这样导致身体中某些原子的核（如 1H、13C和19F)磁性排列。然后施予所 述对象无线电波，这导致排成一列的核跳跃；当收回无线电波时，所述核恢复其原始位置， 发射的无线电波然后通过接受仪检测，并由计算机翻译成二维图片。对于一些MRI程序，使 用造影剂如钆以增加成像的精确性。
[0176] 如本文所用，X-射线是指许多高能的光子，或者一束这样的光子，其波长为大约 0. 01-10纳米。X-射线也是指用X-射线拍摄的照片。
[0177] 如本文所用，与一种组分缀合的化合物称作复合物，其包括与组分结合的化合物， 其中所述化合物与组分之间的结合可以产生自一或多个共价键或者非共价相互作用如氢 键，或者静电相互作用。缀合物也可包含连接化合物与组分的接头。典型的化合物包括但 不限于纳米粒子和含铁细胞。典型的组分包括但不限于可检测的组分和治疗剂。
[0178] 如本文所用，发光是指可检测的电磁（EM)射线，一般是当释能的化学过程的激发 态产物伴随光发射而恢复其基态时产生的紫外线（UV)、红外线（IR)或可见的EM射线。化 学发光是得自化学反应的发光。生物发光是得自使用生物分子（或者其合成形式或类似 物）作为底物和/或酶的化学反应的化学发光。荧光是其中在光或其它形式射线刺激或激 发下从一种物质中发射的可见光，如紫外线（UV)、红外线（IR)或可见的EM射线。
[0179] 如本文所用，化学发光是指一种化学反应，其中能量被特异性导向分子，导致其变 为电子激发态并随后释放光子，从而发出可见光。温度对这种能量导向无作用。因此，化学 发光包含化学能直接转变为光能。
[0180] 如本文所用，生物发光是化学发光的一种类型，是指由生物分子特别是蛋白质发 射光。生物发光的基本条件是分子氧，其在存在加氧酶（一种萤光素酶）的情况下是结合 的或游离的，所述萤光素酶作用于底物-萤光素。生物发光是由酶或是一种加氧酶的其他 蛋白质（萤光素酶）产生的，所述加氧酶在存在分子氧的情况中作用于底物萤光素（一种 生物发光底物），并将底物转化为激发态，当恢复至较低能量水平时以光的形式释放能量。
[0181] 如本文所用，产生生物发光的底物和酶一般分别是指萤光素和萤光素酶。当对于 特殊物种提及时，为清楚起见，每个专业术语与其衍生自其中的生物的名称一起使用，例如 痛头虫萤光素酶或萤火虫萤光素酶。
[0182] 如本文所用，萤光素酶是指催化发光反应的加氧酶。例如，细菌萤光素酶催化黄 素单核苷酸（FMN)和脂族醛的氧化，这个反应产生光。在海洋节肢动物中发现的另一类萤 光素酶催化海萤（Cypridina)(Vargula)荧光素的氧化，另一类萤光素酶催化鞘翅目昆虫 (Coleoptera)荧光素的氧化。因此，萤光素酶是指催化生物发光反应（产生生物发光的反 应）的一种酶或发光蛋白。萤光素酶如萤火虫和角尖水蚤（Gaussia)及海肾（Renilla)萤 光素酶是在产生生物发光反应期间起催化作用并且无变化的酶。萤光素酶发光蛋白如荧光 素非共价结合的水母发光蛋白在产生生物发光反应期间被改变，如通过荧光素的释放而改 变。萤光素酶是一种在生物体中天然存在的蛋白质或蛋白质混合物（如细菌萤光素酶）或 其变体或突变体，所述变体或突变体例如是通过诱变产生的具有一或多种与天然存在的蛋 白质不同的性质如热稳定性的变体。萤光素酶及其修饰的突变体或变体形式为本领域所熟 知。对于本发明的目的，提及的萤光素酶是指发光蛋白或萤光素酶。
[0183] 例如海肾（Renilla)萤光素酶是指分离自海肾属成员的一种酶或者得自任何其 他来源如另一种相关桡足类动物或者合成制备的一种等价分子。其涵盖具有保守氨基酸取 代而基本不改变活性的海肾萤光素酶。本领域技术人员已知合适的保守氨基酸取代，通常 不改变所得分子的生物学活性而产生。本领域技术人员意识到通常在多肽的非必需区域中 的单氨基酸取代基本不改变生物学活性（见例如Watsonet al. Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987, TheBenjamin/Cummings Pub. co. , p.224)〇
[0184] 如本文所用，生物发光底物是指在存在萤光素酶及任何必需的激活物的情况中被 氧化并产生光的化合物。这些底物在本文中是指例如荧光素，是在生物发光反应中经历 氧化的底物。这些生物发光底物包括任何荧光素或其类似物或者萤光素酶与之相互作用 产生光的任何合成的化合物。典型的底物包括在产生光的反应中在存在萤光素酶或蛋白 质的情况中被氧化的那些底物。生物发光底物因此包括本领域公认为荧光素的那些化合 物。荧光素例如包括萤火虫荧光素、海萤（Cypridina,也称作Vargula)荧光素（腔肠素 (coelenterazine))、细菌荧光素，以及这些底物的合成类似物或者在产生生物发光的反应 中在存在萤光素酶的情况中被氧化的其他化合物。
[0185] 如本文所用，能转变为生物发光底物是指易受化学反应如氧化或还原反应影响， 由此产生生物发光底物。例如，生物发光细菌的发光反应包含黄素单核苷酸基团（FMN)通 过黄素还原酶还原为还原的黄素单核苷酸（FMNH 2)的反应。还原的黄素单核苷酸（底物） 然后与氧（激活物）和细菌萤光素酶反应，形成一种中间状态的过氧化黄素，其在存在长链 醛的条件下经历进一步反应产生光。对于这个反应，还原的黄素和长链醛是生物发光底物。
[0186] 如本文所用，生物发光产生系统是指进行生物发光反应所需要的一系列试剂。因 此，完成生物发光反应需要的特异性萤光素酶、荧光素及其他底物、溶剂及其他试剂组成生 物发光系统。因此，生物发光产生系统是指在合适的反应条件下产生生物光的任何系列试 齐U。适当的反应条件是指发生生物发光反应必需的条件，如pH、盐浓度及温度。通常地， 生物发光系统包括生物发光底物、荧光素、萤光素酶（包括萤光素酶及发光蛋白），及一或 多种激活物。特定的生物发光系统可参考衍生萤光素酶的特异生物体而鉴别；例如海肾 (Renilla)生物发光系统包括海肾萤光素酶，如分离自海肾或者使用重组方式或者对这些 萤光素酶进行修饰产生的萤光素酶。这个系统还包括完成生物发光反应必需的特定激活 物，如氧和在存在氧的条件下萤光素酶与之反应产生光的底物。
[0187] 如本文所用，荧光蛋白（FP)是指具有发出荧光能力的蛋白质（即在一个波长吸收 能量并在另一个波长发射能量）。例如，绿色荧光蛋白（GFP)是指发射光谱峰值为510nm 或大约510nm的一种多肽。本领域已知在不同波长发射的多种FP。典型的FP包括但不限 于绿色荧光蛋白（GFP)、黄色荧光蛋白（YFP)、橙色荧光蛋白（0FP)、青色荧光蛋白（CFP)、蓝 色荧光蛋白（BFP)、红色荧光蛋白（RFP)、远红外荧光蛋白或者近红外荧光蛋白。从有关光 蛋白的可用色光谱扩展至蓝色、青色、橙色、黄色和红色变体提供了多色跟踪融合蛋白的方 法。
[0188] 如本文所用，Aequorea GFP是指来自Aequorea属的GFP及其突变体或变体。 来自其它物种的这种变体和GFP如Anthozoa造礁珊瑚、Anemonia海葵、Renilla海肾、 Galaxea珊瑚、Acropora褐色珊瑚、Trachyphyllia及Pectiniidae石珊瑚及其它物种是 熟知的，可为本领域技术人员利用和已知。典型的GFP变体包括但不限于BFP、CFP、YFP和 0FP。典型的突光蛋白及其变体包括GFP蛋白，如Emerald(Invitrogen，Carlsbad, CA)， EGFP(Clontech,Palo Alto,CA),Azami-Green(MBL International,Woburn,MA),Kaede(MBL International, Woburn, MA), ZsGreenl(Clontech, Palo Alto, CA)和 CopGFP(Evrogen/ Axxora，LLC，San Diego, CA) ;CFP 蛋白，如 Cerulean (Rizzo, Nat Biotechnol. 22(4): 445-9 (2004)) , mCFP(ffang et al. , PNAS US. A. 101 (48) :16745-9 (2004)), AmCyanl(Clontech, Palo Alto, CA) , MiCy (MBL International, Woburn, MA),及 CyPet(Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol. 23(3) :355-60(2005)) ;BFP 蛋白，如 EBFP(Clontech，Palo Alto，CA) ;YFP 蛋白如 EYFP(Clontech，Palo Alto，CA)，YPet(Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol.23 (3) :355-60(2005)), Venus(Nagai et al. , Nat. Biotechnol. 20(1) :87-90(2002))，ZsYellow(Clontech，Palo Alto,CA)，及mCitrine(Wang et al..，PNAS U S A. 101(48) :16745-9(2004)) ;0FP 蛋白如 cOFP(Strategene，La Jolla， 〇八），1111(0(]\0儿11^61'仙1：；[01^1，￥013111'11，嫩），及1110四1^6;以及其它蛋白（见例如311311611^, Steinbach PA,and Tsien RY·, Nat Methods. 2(12) :905-9 (2005))。
[0189] 如本文所用，红色突光蛋白或RFP是指已经分离自corallimorph Discosoma的 Discosoma RFP(DsRed) (Matz et al. , Nature Biotechnologyl7 :969-973 (1999)),及来自 任何其它物种的红色或远红突光蛋白，如Heteractis造礁珊瑚和Actinia或Entacmaea海 葵，以及其变体。RFP包括例如Discosoma变体，如单体红色突光蛋白1 (mRFPl)，mCherry， tdTomato,mStrawberry,mTangerine(Wang et al. ,PNAS USA. 101(48) :16745-9(2004)), DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA)及 DsRed_Tl(Bevis and Glick, Nat. Biotechnol. ,20 : 83-87(2002)), Anthomedusa J-Red(Evrogen)和 Anemonia AsRed2(Clontech, Palo Alto, CA)。远红外突光蛋白包括例如 Actinia AQ143(Shkrob et al.，Biochem J.392(Pt3): 649-54 (2005)), Entacmaea eqFP611(ffiedenmann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99(18) :11646-51(2002)), Discosoma 变体如mPlum 和mRasberry(Wang et al..，PNAS U S A. 101(48) :16745-9(2004)),以及Heteractis HcRedl和t-HcRed(Clontech，Palo Alto， CA)。
[0190] 如本文所用，体内方法是指在活的对象的身体内进行的方法。
[0191] 如本文所用，遗传治疗或者基因治疗包括将异源核酸如DNA或RNA转移至患有尝 试用这种疗法治疗的病症或病变的哺乳动物、特别是人的某些细胞、靶细胞中。如本文所 用，遗传治疗或基因治疗可包括将异源核酸如DNA转移至微生物（如病毒）中，该微生物 可以被转移至患有尝试用这种疗法治疗的病症或病变的哺乳动物、特别是人体中。核酸如 DNA以某种方式被导入选择的靶细胞中，如直接或间接导入，由此所述异源核酸如DNA被表 达及由其编码的治疗性产物产生。或者，异源核酸如DNA可以以某些方式介导编码治疗性 产物的DNA的表达，或者其可编码在某些方式中是治疗性产物的一种产物如肽或RNA (如 RNAi，包括siRNA)，或者其直接或间接介导治疗性产物的表达。基因治疗也可用于输送编码 基因产物的核酸，其置换缺陷的基因或者增补由哺乳动物或者之中导入其的细胞产生的基 因产物。导入的核酸可以编码治疗性化合物。所述编码治疗性产物的异源核酸如DNA可以 在导入受累宿主的细胞之前修饰，以增强或者另外改变所述产物或其表达。基因治疗法也 可包括输送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节剂。
[0192] 如本文所用，术语过产生或者过表达当用于描述在细胞中产生的一种物质、分子、 化合物或组合物时，是指以高于所述细胞产生所述物质、分子、化合物或组合物的基线、正 常或一般的水平产生或者表达。产生或表达的基线、正常或一般水平包括无产生/表达或 者有限的、限制的或调节的产生/表达。这种过产生或过表达典型通过细胞的修饰实现。
[0193] 如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸的表达的物质或化合物降低或增加 或者另外改变所述蛋白质的活性，或者以某些方式正调节或负调节或者另外改变核酸在细 胞中的表达。
[0194] 如本文所用，"核酸"包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸（PNA)及其混合物。核 酸可以是单链或双链的。当提及探针或引物时，涵盖单链分子，所述探针或引物任选是标记 的，如用可检测标记如荧光标记或放射性标记物标记。这种分子的长度典型是统计学唯一 的或者是低拷贝数的（典型少于5个，通常少于3个）以探查或引发文库。通常地，探针或 引物含有与感兴趣的基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续核苷酸。探针和引 物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
[0195] 如本文所用，肽是指长度大于或等于2个氨基酸及少于或等于40个氨基酸的多 肽。
[0196] 如本文所用，在本发明提供的氨基酸的各个序列中出现的氨基酸根据其已知的三 字母或单字母缩写方式识别（表1)。在各个核酸片段中出现的核苷酸以本领域常规使用的 标准命名法命名。
[0197] 如本文所用，"氨基酸"是指含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。多肽含有两 或多个氨基酸。对于本发明，氨基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸 类似物（即其中α-碳具有侧链的氨基酸）。
[0198] 如本文所用，"氨基酸残基"是指多肽在其肽键经化学消化（水解）时形成的氨基 酸。本文描述的氨基酸残基推定为是"L"异构形式。如此命名的"D"异构体形式中的残基 可以取代任何L-氨基酸，只要所述多肽保留希望的功能性质即可。ΝΗ 2是指在多肽的氨基末 端存在的游离氨基基团。C00H是指在多肽的羧基末端存在的羧基基团。为了与在J. Biol. Chem. 243 :3557-3559 (1968)及采用的 37C. F. R. § § 1. 821-1. 822 中描述的标准多肽命名 法一致，氨基酸残基的缩写在表1中示出：
[0199] 表1 :对应表
【权利要求】
1. 分离的克隆LIVP毒株，其不同于基因组包含SEQ ID N0:10所示核苷酸序列的克隆 毒株。
2. 权利要求1的分离的克隆LIVP毒株，其与GLV-lh68相比具有更高的抗肿瘤发生能 力和/或降低的毒性，其中GLV-lh68具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列。
3. 权利要求1或2的分离的克隆LIVP毒株，其基因组中进一步包含非病毒异源核酸或 者包含开放读框的缺失。
4. 权利要求1-3任一项的分离的克隆LIVP毒株，其与名称为GLV-lh68并具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的病毒相比具有降低的毒性。
5. 权利要求1-3任一项的分离的克隆LIVP毒株，其与名称为GLV-lh68并具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的病毒相比具有更高的抗肿瘤发生能力。
6. 权利要求1-3任一项的分离的克隆LIVP毒株，其与名称为GLV-lh68并具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗肿瘤发生能力。
7. 权利要求1-6任一项的分离的克隆LIVP毒株，其包含与SEQ ID NO : 10所示核苷酸 序列具有至少85 %序列相同性的核苷酸序列，但是不包含SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列。
8. 权利要求7的分离的克隆LIVP毒株，其包含与SEQ ID NO :10所示核苷酸序列具 有至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 99. 1%、99· 2%、99· 3%、99· 4%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%或 99. 9%序列相同性的核 苷酸序列。
9. 权利要求7或8的分离的克隆毒株，其中序列相同性是通过比对含有相应于反向末 端重复（ITR)的核苷酸的核苷酸序列并使用由GAP序列比对程序确定的全局比对而确定 的，其中末端缺口不罚分。
10. 权利要求1-9任一项的分离的克隆毒株，其包含选自如下的核苷酸序列： a) SEQ ID NO: 1 的核苷酸 10, 073-180, 095、SEQ ID NO :2 的核苷酸 11，243-182, 721、 SEQIDN0:4的核苷酸6,264-181，390、SEQIDN0:5的核苷酸7,044-181，820、SEQIDN0 : 6的核苷酸6,674-181，409、SEQIDN0:7的核苷酸6,716-181，367 或者SEQIDN0:8的核 苷酸 6, 899-181，870 ;或者 b) 与SEQIDN0:l的核苷酸10,073-180,095、SEQIDN0:2的核苷酸ll，243-182,721、 SEQIDN0:4的核苷酸6,264-181，390、SEQIDN0:5的核苷酸7,044-181，820、SEQIDN0 : 6的核苷酸6,674-181，409、SEQIDN0:7的核苷酸6,716-181，367 或者SEQIDN0:8的核 苷酸6, 899-181，870的序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列。
11. 权利要求10的分离的克隆毒株，其包含左侧和/或右侧反向末端重复。
12. 权利要求1-11任一项的分离的克隆毒株，其包含SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所 示核苷酸序列，与SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性 的核苷酸序列。
13. 通过繁殖权利要求1-12任一项的分离的克隆LIVP毒株产生的LIVP制备物。
14. 细胞培养物或分离的细胞，其包含权利要求1-12任一项的克隆毒株。
15. 分离的克隆毒株，其如下产生： 繁殖权利要求14的细胞或细胞培养物；及 从所得细胞中分离LIVP克隆。
16. 重组LIVP病毒株，包含： 权利要求1-12或15任一项的LIVP克隆毒株的基因组；及 在所述基因组中的编码异源基因产物的核酸。
17. 权利要求16的重组LIVP病毒株，其中编码异源基因产物的核酸被插入或者置换病 毒基因组中的非必需基因或区域。
18. 权利要求16或17的重组LIVP病毒株，其中编码异源基因产物的核酸被插入在病 毒基因组中的血凝素（HA)、胸苷激酶（TK)、F14. 5L、痘苗病毒生长因子（VGF)、A35R、NIL、 E2L/E3L、K1L/K2L、过氧化物歧化酶基因座、7· 5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L 或 I4L 基因座 中。
19. 权利要求16-18任一项的重组LIVP病毒株，其中所述异源基因产物是治疗剂或诊 断剂。
20. 权利要求16-19任一项的重组LIVP病毒株，其中所述异源基因产物选自抗癌剂、 抗转移剂、抗血管发生剂、免疫调节分子、抗原、细胞基质降解基因、组织再生及人类体细胞 多能性重塑基因、修饰底物产生可检测产物或信号的酶或者可被抗体检测的酶、可以结合 造影剂的蛋白质、用于光学成像或检测的基因、用于PET成像的基因以及用于MRI成像的基 因。
21. 权利要求20的重组LIVP病毒株，其中抗转移剂抑制转移定植或者在体外细胞侵袭 测定中抑制细胞侵袭。
22. 权利要求20的重组LIVP病毒株，其中抗血管发生剂抑制肿瘤中血管形成。
23. 权利要求16-22任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是治疗剂，其选自激 素、生长因子、细胞因子、趋化因子、共刺激分子、核酶、转运蛋白、单链抗体、反义RNA、前体 药物转化酶、siRNA、microRNA、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗 癌多肽抗生素、血管发生抑制剂、肿瘤抑制物、细胞毒性蛋白、细胞抑制蛋白和组织因子。
24. 权利要求16-23任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是治疗剂，其选自 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、白介素-6 (IL-6)、 白介素-24(IL-24)、干扰素 γ诱导的蛋白质10(IP-10)、与HSV糖蛋白D竞争T-淋巴细胞 上表达的受体HVEM的淋巴毒素诱导表达物（LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信号转导及 转录激活蛋白（STATlalpha)、STATlbeta、血纤维蛋白溶酶原k5结构域（hK5)、色素上皮分 化因子（PEDF)、单链抗VEGF抗体、单链抗DLL4抗体、单链抗成纤维细胞活化蛋白（FAP)、 匪23、钙粘着蛋白1 (ECAD或cdhl)、松弛素1 (RLN1)、基质金属肽酶9 (MMP9)、红细胞生成素 (EPO)、microRNA126(miR-126)、microRNA181、microRNA335,锰过氧化物歧化酶（MnSOD)、E3 泛素蛋白连接酶1 (HACE1)、钠尿肽前体A(nppal)、羧肽酶G2 (CPG2)、醇脱氢酶（ADH)、CDC6 和骨形态发生蛋白4(BMP4)。
25. 权利要求24的重组LIVP病毒株，其中单链抗VEGF抗体命名为G6。
26. 权利要求16-20任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是诊断剂，其为可检 测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质。
27. 权利要求16-20或26任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是诊断剂，其 选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或转运蛋白，所述受体或转运蛋白结合于和/ 或转运可检测的造影剂、生色团、化合物或配体。
28. 权利要求27的重组LIVP病毒株，其中结合于和/或转运造影剂的受体或转运蛋白 是铁受体、铁转运蛋白、铜摄取转运蛋白。
29. 权利要求27或28的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是诊断剂，其选自绿色磕 头虫萤光素酶、lux操纵子、红外突光蛋白、黄素还原酶蛋白，mNeptune远红光突光蛋白、绿 色荧光蛋白（GFP)、红色荧光蛋白（RFP)、腔肠素结合蛋白（CBP)、人肾上腺素受体（hNET)、 碘化钠同向转运蛋白（NIS)、细胞色素 p450家族酶、allostatinA受体（AlstR)、Pepl受体 (PEPR-1)、LAT-4、固醇14 α -去甲基酶（Cyp51)、转移受体（TR)、铁蛋白、二价金属转运蛋白 (DMT)、趋磁性蛋白A(MagA)和顺钼内流转运蛋白（CTR1)。
30. 权利要求20的重组LIVP病毒株，其中组织再生及人类体细胞多能性重塑基因选自 newt AG(nAG)、0ct4、NANOG、Ngn3、Pdxl 和 Mafa。
31. 权利要求16-30任一项的重组LIVP病毒株，其中编码异源基因产物的核酸可操纵 地与启动子连接。
32. 权利要求31的重组LIVP病毒株，其中启动子是哺乳动物启动子或病毒启动子。
33. 权利要求31或32的重组LIVP病毒株，其中启动子选自Ρ7.51?、Ρη1?、Ρ 3Ε、Ρι、Ρ^Η5Κ、 ΤΚ、Ρ28、Cl 1R、G8R、F17R、I3L、I8R、AIL、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、DIR、D4R、D5R、 D9R、DllL、D12L、D13L、MlL、N2L、P4b 或 K1 启动子。
34. 组合物，包含权利要求1-33任一项的病毒株。
35. 药物组合物，包含权利要求1-33任一项的病毒株。
36. 权利要求35的药物组合物，进一步包含药物学可接受的载体。
37. 权利要求35或36的药物组合物，其被配制用于局部或全身施用。
38. 权利要求34-37任一项的组合物或药物组合物，包含一或多种不同病毒株。
39. 权利要求35-38任一项的药物组合物，其被配制为用作抗病毒或抗癌疫苗施用。
40. 治疗对象中的增生性病症的方法，包括施用权利要求35-39任一项的药物组合物。
41. 权利要求40的方法，进一步包括施用用于治疗增生性病症的第二种治疗剂。
42. 权利要求40或41的方法，其中增生性疾病是癌症。
43. 权利要求42的方法，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或胰腺 癌。
44. 权利要求40-42任一项的方法，其中增生性病症是肿瘤或转移。
45. 权利要求40-44任一项的方法，其中对象是人类或非人类动物。
46. 权利要求45的方法，其中非人类动物选自马、猫、犬、牛、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔、 鸡、大鼠和豚鼠。
47. 权利要求40-46任一项的方法，其中病毒的施用量是至少或者大约或者是 lxl05pfu，在一个施用周期至少一次。
48. 权利要求40-47任一项的方法，其中病毒的施用量是至少或者大约或者是 lxl05pfu> lxl06pfu> lxl07pfu> lxl08pfu> Ixl09pfu>lxl0icipfu>lxl0npfu>lxl0 12pfu> lxl013pfu或lxl014pfu，在一个施用周期至少一次。
49. 权利要求47或48的方法，其中所述量的病毒在一个施用周期施用二次、三次、四 次、五次、六次或七次。
50. 权利要求47-49任一项的方法，其中所述量的病毒在周期的第一天、周期的第一和 第二天、周期的前三个连续日子的每一天、周期的前四个连续日子的每一天、周期的前五个 连续日子的每一天、周期的前六个连续日子的每一天或者周期的前七个连续日子的每一天 施用。
51. 权利要求47-50任一项的方法，其中施用周期是7天、14天、21天或28天。
52. 权利要求47-51任一项的方法，其中施用周期重复多次。
53. 权利要求40-52任一项的方法，进一步包括另一种治疗，其选自外科手术、放疗、免 疫抑制治疗和施用抗癌剂，其中所述进一步治疗是在病毒之前、之后、同时或相间进行。
54. 权利要求53的方法，其中所述进一步治疗是施用抗癌剂，所述抗癌剂选自细胞因 子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发 生抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分 裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗剂及前述任何抗癌剂的组合。
55. 权利要求53或54的方法，其中抗癌剂选自顺钼、卡钼、吉西他滨、伊立替康、抗 EGFR抗体和抗VEGF抗体。
56. 权利要求54或55的方法，其中病毒和抗癌剂相继、同时或者相间施用。
57. 权利要求40-56任一项的方法，其中病毒经全身性、静脉内、动脉内、肿瘤内、内窥 镜、病变内、肌肉内、皮内、腹膜内、囊内、关节内、胸膜内、经皮、皮下、口服、胃肠外、鼻内、气 管内、经吸入、颅内、前列腺内、玻璃体内、局部、眼部、阴道或直肠施用。
58. 权利要求40-57任一项的方法，其中病毒经静脉内施用。
59. 检测对象中的肿瘤或转移的方法，包括： 给对象施用权利要求1-33任一项的LIVP病毒或克隆毒株，其中所述病毒包含编码可 检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质的核酸；以及 检测所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，其中检测指示对象中肿瘤或转 移的存在。
60. 权利要求59的方法，其中检测通过给对象成像而实现。
61. 权利要求59的方法，其中检测通过检测组织或体液样品中的蛋白质或信号而实 现。
62. 权利要求59-61任一项的方法，其中所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋 白质选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或者转运蛋白，所述受体或者转运蛋白 结合和/或转运可检测的造影剂、生色团、化合物或配体。
63. 权利要求62的方法，其中所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质选自绿 色荧光蛋白（GFP)、红色荧光蛋白（RFP)、铁受体、铁转运蛋白、人肾上腺素受体（hNET)和碘 化钠同向转运蛋白（NIS)。
64. 权利要求59-63任一项的方法，其中所述可检测蛋白质或者可检测信号通过微光 成像、荧光光谱、X-光成像、磁共振成像（MRI)、磁共振光谱（MRS)、正电子成像术（PET)或 单光子发射计算机断层扫描（SPECT)检测。
65. 检测宿主中病毒复制的方法，包括： 给对象施用权利要求1-33任一项的病毒，其中所述病毒包含编码可检测蛋白质或者 诱导可检测信号的蛋白质的核酸；以及 检测所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，其中检测指示病毒在对象中复 制。
66. 权利要求65的方法，其中所述对象具有肿瘤或者癌症。
67. 权利要求65或66的方法，其包括在施用病毒后，从所述对象获得体液样品；及检 测体液中的可检测蛋白质或信号。
68. 权利要求67的方法，其中所述体液选自尿、血液、泪或者脑脊液。
69. 分离的宿主细胞或细胞培养物，包含权利要求1-33任一项的LIVP病毒株。
70. 用于治疗对象中的增生性疾病的组合物，其中所述组合物包含权利要求1-33任一 项的LIVP病毒或克隆毒株。
71. 权利要求1-33任一项的LIVP病毒或克隆毒株在制备用于治疗对象中的增生性病 症的药物组合物中的用途。
72. 权利要求70或71的组合物或用途，其中病毒株的浓度是Ixl06_lxl016pfu/ml或者 是至少或者大约或者是 lxl〇6pfu/ml、lxl07pfu/ml、lxl08pfu/ml、lxl0 9pfu/ml、lxl01Qpfu/ ml、lxlOnpfu/ml、lxl012pfu/ml、lxl013pfu/ml、lxl0 14pfu/ml、lxl015pfu/ml 或 lxl016pfu/ ml〇
73. 权利要求70-72任一项的组合物或用途，其中所述组合物进一步包含抗癌剂。
74. 权利要求73的组合物或用途，其中所述抗癌剂选自细胞因子、趋化因子、生长因 子、光增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号传导调 节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌 抗生素、免疫治疗剂及前述任何抗癌剂的组合。
75. 权利要求73或74的组合物或用途，其中抗癌剂选自顺钼、卡钼、吉西他滨、伊立替 康、抗EGFR抗体和抗VEGF抗体。
76. 权利要求70-75任一项的组合物或用途，其中所述增生性病症是癌症。
77. 权利要求76的组合物或用途，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌 或胰腺癌。
78. 权利要求70-77任一项的组合物或用途，其中癌症是实体瘤癌症或者转移癌。
79. 权利要求78的组合物或用途，其中肿瘤或转移是乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿 瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤或胰腺肿瘤。
80. 权利要求70-79任一项的组合物或用途，其中所述组合物配制为用于全身或局部 施用。
81. 权利要求70-80任一项的组合物或用途，其中所述组合物配制为用于静脉内施用。
82. 选择用于癌症治疗和诊断的LIVP克隆毒株的方法，包括： (i) 提供第一个LIVP病毒样品，其含有具有不同基因组序列的病毒颗粒的混合物； (ii) 从所述样品选择和分离单个克隆分离株； (iii) 测定每个克隆分离株的毒性； (iv) 测定每个克隆分离株的抗肿瘤发生能力；及 (v) 选择与参照LIVP病毒株相比显示更高的抗肿瘤发生能力及降低的毒性的克隆毒 株，其中将显示降低的毒性和更高的抗肿瘤发生能力的克隆分离株鉴定为用于癌症治疗和 诊断的LIVP克隆毒株。
83. 权利要求82的方法，其中所述参照LIVP病毒是减毒重组LIVP病毒。
84. 权利要求82或83的方法，其中所述参照LIVP病毒是命名为GLV-lh68的病毒，其 基因组包含SEQ ID NO :9所示核苷酸序列（GLV-lh68)。
85. 权利要求82-84任一项的方法，其中所述第一个LIVP病毒样品是LIVP病毒株，其 包含具有SEQ ID N0:10所示基因组或者与SEQ ID N0:10至少99%相同的基因组的LIVP。
86. 权利要求82-85任一项的方法，其中第一个LIVP病毒样品是通过繁殖用LIVP毒株 和另一种病毒株、基因组DNA或克隆的DNA感染的细胞，随后从培养物中分离病毒样品而获 得的混合物，其中所述样品包含由感染产生的子代病毒。
87. 权利要求86的方法，其中另一种病毒株选自DNA病毒、双链RNA病毒、单链正义RNA 病毒和单链负义RNA病毒。
88. 权利要求87的方法，其中DNA病毒选自痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或痘苗 病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒（HSV)、巨细胞病毒（CMV)、Epstein-Barr病毒（EBV)、嗜肝 DNA病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；以及单链DNA病毒如细小病毒。
89. 权利要求86-88任一项的方法，其中另一种病毒株是痘苗病毒株。
90. 权利要求87的方法，其中双链RNA病毒是呼肠孤病毒如轮状病毒。
91. 权利要求87的方法，其中单链正义RNA病毒选自小RNA病毒如Seneca valley病 毒、柯萨基病毒或脊髓灰质炎病毒、肠道病毒；披膜病毒如西门利克森林病毒；和逆转录病 毒如人类免疫缺陷病毒（HIV)、鼠 Maloney白血病病毒（MMLV)和慢病毒。
92. 权利要求91的方法，其中单链负义RNA病毒选自正粘病毒如流感病毒；副粘病毒 如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎病毒；以及棒状病毒如水泡性口炎病毒（VSV)。
93. 权利要求82-92任一项的方法，其中通过噬斑测定选择来自样品的单个克隆分离 株。
94. 权利要求93的方法，其中选择噬斑测定中最大的噬斑。
95. 权利要求94的方法，其中至少选择最大的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20个噬斑并且作为克隆分离株而分离，每一个均在步骤（iii)和（iv)中测定 毒性和抗肿瘤发生能力。
96. 权利要求93-95任一项的方法，其中所选择的噬斑大于LIVP病毒样品产生的噬斑 的平均噬斑大小。
97. 由权利要求82-96任一项的方法产生的克隆毒株。
【文档编号】C12N7/00GK104093830SQ201280029139
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】A·A·绍洛伊, N·G·陈, Y·A·于, Q·张 申请人:吉恩勒克斯公司