酶促氨基化的制作方法
【专利摘要】一种方法，其包括步骤(a)在氧及碳水化合物氧化酶辅因子存在的情况下，将含有羟基的烃与具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂接触，和(b)在氨基酸脱氢酶辅因子和该氨基酸脱氢酶的底物氨基酸存在的情况下，将步骤a)中产生的烃与具有氨基转移酶活性的生物试剂和具有辅因子依赖的氨基酸脱氢酶活性的生物试剂接触。
【专利说明】酶促氨基化
[0001]本发明涉及方法，其包括:步骤a)在氧和碳水化合物氧化酶辅因子存在的情况下，将含有羟基的烃与具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂接触，和b)在氨基酸脱氢酶辅因子和氨基酸脱氢酶的底物氨基酸存在的情况下，将步骤a)中产生的烃与具有氨基转移酶活性的生物试剂和具有辅因子依赖的氨基酸脱氢酶活性的生物试剂接触；用于对含有羟基的烃进行氨基交换的含水混合物，其包含具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂、具有氨基转移酶活性的生物试剂、具有氨基酸脱氢酶活性的生物试剂、氧、所述氨基酸脱氢酶的底物氨基酸、碳水化合物氧化酶辅因子和氨基酸脱氢酶辅因子，优选地，和具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的生物试剂；和此类含水反应混合物的用途。
[0002]不可再生的化石燃料的时代即将结束。尽管化学家已经能够依赖煤、石油和天然气实际上无限的供应，但预期由埋藏于海洋沉积物中超过数百万年的细菌、浮游生物、植物和动物物质所形成的这些资源的可用性在不久的将来是受限的。此外，燃烧化石燃料已经与CO2大气浓度的增加和与之相关的气候变化(最显著的是全球变暖)联系起来。因此，用于生产传统上来源于化石资源的化学品的下一代方法将不得不从可再生资源(即容易地且在地质学时间尺度方面快速地可补充的物质)开始。
[0003]工业生物技术，即(生物催化剂)诸如酶或生物作为工业催化剂的应用为许多使用化石资源作为输入物的传统方法提供了备选方法。生物催化剂不但能够转化从可再生材料(常常是在别的情况下不得不丢弃的农业或加工废品)制成的化合物，而且它们不需要使用有毒化合物，以及，最后但并非最不重要地，相比于传统方法，它们降低了温室气体排放。
[0004]胺、氨的有机衍生物代表一类工业上广受欢迎的化合物，包括散装化学品诸如苯胺，一般通过转化从化石碳源中生产的化合物诸如卤代烷或烯来制备。用于合成胺的反应依赖于使用极端温度、有毒化合物诸如HCN和昂贵的或环境有害的催化剂。工业相关的胺的实例包括多种工业化学品的前体苯胺、必需氨基酸赖氨酸和用于生产聚合物的单体二 _(氨基甲基)_呋喃(DAMF)。
[0005]现有技术教导了对于合成DAMF和化学相关的胺的化学途径，涉及HMF至DFF的逐步氧化，随后转化为相应的二肟及随后后者的镍催化的还原(El Hajj等人，1987)。基于可再生材料诸如糖的生物技术途径将是令人期望的。
[0006]因此，导致产生本发明的问题是提供可以用于从含有羟基，优选与芳香族或脂肪族碳环连接的羟基的化合物起始生产胺的系统，所述化合物可以来源于可再生起始材料而非通过分解化石资源的途径获得的化合物。导致产生本发明的另一个问题是提供对于生产有机胺的完整的酶促途径，优选为与现有技术中描述的反应相比，具有广泛底物特异性和/或改善的产率和/或产物特异性的酶促途径和不需要加入有害试剂和/或苛刻的反应条件的酶促途径。
[0007]另一个问题涉及提供用于生产胺的一组反应，其具有整体为O的氧化还原平衡。
[0008]导致产生本发明的另一个问题是提供可以用于生产胺的系统，其从含有羟基，优选与芳香族或脂肪族碳环连接的羟基的化合物起始，而不需要将中间体进行纯化和/或提取步骤或更改溶剂。
[0009]导致产生本发明的问题通过所附独立权利要求和从属权利要求的主题解决。
[0010]在第一方面，导致产生本发明的问题通过以下方法解决，其包括步骤:
(a)在氧和碳水化合物氧化酶辅因子存在的情况下，将含有羟基的烃与具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂接触，和
(b)在氨基酸脱氢酶辅因子和氨基酸脱氢酶的底物氨基酸存在的情况下，将步骤a)中产生的烃与具有氨基转移酶活性的生物试剂和具有辅因子依赖的氨基酸脱氢酶活性的生物试剂接触。
[0011]在第一方面的实施方案中，所述含有羟基的烃包含具有至少一个选自-(CH2)x - OH的取代基的5或6元环，其中X是0-4。
[0012]在第一方面的实施方案中，所述含有羟基的烃选自式(I)或(II)所示的化合物:
◎A。" 命八。H
dX3csC- -B
r3Cl?R3_
其中A、B、C、D、E和F中最多两个是各自且独立地选自N、S和O的原子，并且其他为C， 其中R3选自H、卤素、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、-(CH5)s-CR4O1
-(CH2)-NH2l"(CH2LK)-R4, -(CH2IirCHiSH, -(CH2)s^COOR4,
其中X是0-20，优选0-4，更优选1-2，
并且其中R4选自H和取代的或未取代的烷基、环烷基、芳基和杂芳基。
[0013]在第一方面的实施方案中，A、B、C、D、E和F中最多两个是各自且独立地选自N和O的原子，并且其他为C，
其中 R3 选自-(CH2XR4O, -{CH2)r-NH2l -(CH2)l1-OR4 和-(CH2XOOR4,
其中X是0-4，更优选1-2，
并且其中R4选自H和含有1-4个碳原子的烷基。
[0014]在第一方面的实施方案中，A、B、C、D、E和F均为C原子。
[0015]在第一方面的实施方案中，所述含有羟基的烃是环烷醇，优选环己醇。
[0016]在第一方面的实施方案中，所述氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性是由选自来自镰刀菌NRRL 2903 (Fusariuni NRRL 2903)的半乳糖氧化酶的Ml变体、来自黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的批喃糖氧化酶、来自皱波角叉菜{Chondrus crisp us)的己糖氧化酶及其同源物的酶提供的活性。
[0017]在第一方面的实施方案中，所述氨基酸脱氢酶是丙氨酸脱氢酶。
[0018]在第一方面的实施方案中，所述氨基转移酶选自来自河流弧菌{Vibriofluvial is)和脱氮副球菌(Peireicoccus deni trificans)的ω -氨基转移酶及其同源物。
[0019]在第一方面的实施方案中，在具有甲酸脱氢酶活性的生物试剂存在的情况下进行步骤b)。[0020]在第一方面的实施方案中，在具有葡萄糖脱氢酶活性的生物试剂存在的情况下进行步骤b)。
[0021]在第一方面的实施方案中，由所述具有氨基酸脱氢酶活性的生物试剂产生的氧化还原因子被所述具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的生物试剂所消耗。
[0022]在第一方面的实施方案中，在H2O2-降解活性存在的情况下进行步骤a)。
[0023]在第一方面的实施方案中，所述H2O2-降解活性由选自过氧化氢酶和辣根过氧化物酶/ABTS及其同源物的生物试剂提供。
[0024]在第一方面的实施方案中，步骤a)和步骤b)在相同的反应混合物中同时进行。
[0025]在第一方面的实施方案中，在加入对氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性必需的组分后，将至少一种对于氨基转移酶活性必需的组分，优选具有氨基转移酶活性的生物试剂加入到反应混合物中。
[0026]在第一方面的实施方案中，氧压力的水平为2-7巴,优选3-5巴。
[0027]在第一方面的实施方案中，选自具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂、具有氨基转移酶活性的生物试剂、具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的生物试剂和具有辅因子依赖的丙氨酸脱 氢酶活性的生物试剂中的一种或多种，优选所有均与活细胞相关。
[0028]在第二方面，导致产生本发明的问题通过用于对含有羟基的烃进行氨基交换的混合物的用途解决，所述混合物包含具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂、具有氨基转移酶活性的生物试剂、具有氨基酸脱氢酶活性的生物试剂、氧、所述氨基酸脱氢酶的底物氨基酸、碳水化合物氧化酶辅因子和氨基酸脱氢酶辅因子，优选地，和具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的生物试剂，其中一种或多于一种，优选所有的生物试剂均为或者包含具有目标活性的异源多肽。
[0029]在第三方面，导致产生本发明的问题通过含水反应混合物解决，所述含水反应混合物包含含有羟基的烃、具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的生物试剂、氧、碳水化合物氧化酶辅因子、具有氨基转移酶活性的生物试剂、具有氨基酸脱氢酶的生物试剂、氨基酸脱氢酶辅因子、所述氨基酸脱氢酶的底物氨基酸，优选地，和具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的生物试剂，其中一种或多于一种，优选所有的生物试剂均为或者包含具有目标活性的异源多肽。
[0030]在第三方面的优选实施方案中，所指定的生物试剂的每一种是包含一种或多种具有目标活性的异源活性多肽的全细胞生物催化剂，优选地，包含多于一种异源活性多肽的一种全细胞生物催化剂具有所有的目标活性。
[0031]本发明的第二和第三方面的进一步的实施方案包括本发明的第一方面的实施方案。
[0032]本发明基于令人惊奇的发现，即存在可以用于催化含有羟基的烃的氧化和随后的氨基交换的一系列反应，其中完全基于生物技术催化剂，将所述羟基转化为胺基。此外，本发明人已经令人惊奇地发现所有这些反应彼此之间是完全相容的，并且可以在同一反应器中使用相同的缓冲系统同时进行。此外，本发明人已经令人惊奇地发现合适的一系列反应，其可以在完全没有添加或去除电子的情况下进行。
[0033]本发明的方法可以用于转化广泛范围的化合物。在优选的实施方案中，如本文所用，术语“含有羟基的烃”指含有经C-C键连接的两个碳原子且含有至少一个羟基(后者优选与碳原子连接)的任何有机化合物。在优选的实施方案中，此类烃的碳链选自环状的或线性的烷、烯、炔、烷基或烯基芳基和烷基或烯基杂芳基。
[0034]在优选的实施方案中，所述含有羟基的烃选自式(III)所示的化合物:
【权利要求】
1.一种方法，其包括步骤: (a)在氧和碳水化合物氧化酶辅因子存在的情况下，将含有羟基的烃与具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂接触，和 (b)在氨基酸脱氢酶辅因子和氨基酸脱氢酶的底物氨基酸存在的情况下，将步骤a)中产生的烃与具有氨基转移酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂和具有辅因子依赖的氨基酸脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂接触， 其中所述含有羟基的烃包含具有至少一个选自-(CH2)x- OH的取代基的5或6元环，其中X是0-4,并且 其中所述具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽选自来自镰刀菌NRRL 2903的半乳糖氧化酶的Ml变体、来自黄孢原毛平革菌的吡喃糖氧化酶、来自皱波角叉菜的己糖氧化酶及其同源物。
2.权利要求1的方法，其中所述含有羟基的烃选自式(I)或(II)所示的化合物
3.权利要求2的方法， 其中A、B、C、D、E和F中最多两个是各自且独立地选自N和O的原子，并且其他为C， 其中 R3 选自
4.权利要求3的方法，其中所述含有羟基的烃是环烷醇，优选环己醇。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述氨基酸脱氢酶是丙氨酸脱氢酶。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述氨基转移酶选自来自河流弧菌和脱氮副球菌的ω-氨基转移酶及其同源物。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤b)在具有甲酸脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂存在的情况下进行。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤b)在具有葡萄糖脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂存在的情况下进行。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤b)在具有葡萄糖脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂存在的情况下进行。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中由所述具有氨基酸脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂产生的氧化还原因子由所述具有甲酸脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂消耗。
11.权利要求1-8中任一项的方法，其中步骤a)在H2O2-降解活性存在的情况下进行。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述H2O2-降解活性由选自过氧化氢酶和辣根过氧化物酶/ABTS的多肽及其同源物或含有此类多肽的全细胞生物催化剂提供。
13.权利要求1-11中任一项的方法，其中步骤a)和b)在相同的反应混合物中同时进行。
14.权利要求12的方法，其中在加入对氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性必需的组分后，将至少一种对于氨基转移酶活性必需的组分，优选具有氨基转移酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂，加入到反应混合物中。
15.权利要求1-13中任一项的方法,其中氧压力的水平为2-7巴,优选3-5巴。
16.权利要求1-14中任一项的方法，其中选自具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽、 具有氨基转移酶活性的多肽和具有辅因子依赖的丙氨酸脱氢酶活性的多肽的一种或多种，优选所有的多肽与活细胞相关。
17.一种混合物用于对含有羟基的烃进行氨基交换的用途，所述混合物包含具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂、具有氨基转移酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂、具有氨基酸脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂、氧、所述氨基酸脱氢酶的底物氨基酸、碳水化合物氧化酶辅因子和氨基酸脱氢酶辅因子，优选地，和具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂， 其中所述含有羟基的烃包含具有至少一个选自-(CH2)x- OH的取代基的5或6元环，其中X是0-4， 并且其中所述具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽选自来自镰刀菌NRRL 2903的半乳糖氧化酶的Ml变体、来自黄孢原毛平革菌的吡喃糖氧化酶、来自皱波角叉菜的己糖氧化酶及其同源物。
18.—种含水反应混合物,其包含含有羟基的烃、具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂、氧、碳水化合物氧化酶辅因子、具有氨基转移酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂、具有氨基酸脱氢酶的多肽、氨基酸脱氢酶辅因子、所述氨基酸脱氢酶或含有此类多肽的全细胞生物催化剂的底物氨基酸，优选地，和具有甲酸或葡萄糖脱氢酶活性的多肽或含有此类多肽的全细胞生物催化剂，其中一种或多于一种，优选所有所述多肽或全细胞生物催化剂分别是或者包含具有各自的目的活性的异源多肽， 其中所述含有羟基的烃包含具有至少一个选自-(CH2)x- OH的取代基的5或6元环，其中X是0-4， 并且其中所述具有氧依赖及辅因子依赖的碳水化合物氧化酶活性的多肽选自来自镰刀菌NRRL 2903的半乳糖氧化酶的Ml变体、来自黄孢原毛平革菌的吡喃糖氧化酶、来自皱波角叉菜的己糖氧化酶及其同源物。
【文档编号】C12P17/04GK103635583SQ201280029084
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年1月10日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】T.哈斯, J.C.普费弗, K.法贝尔, M.富赫斯 申请人:赢创德固赛有限公司