用于胸膜间皮瘤患者的早期发现的分子标志物及其表达分析方法

用于胸膜间皮瘤患者的早期发现的分子标志物及其表达分析方法
【专利摘要】本发明的课题是开发简便且廉价、可信度高的间皮瘤的检查方法、和该检查方法中使用的试剂盒。作为解决问题的方法是，本发明提供间皮瘤的检查方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。本发明提供用于间皮瘤的诊断的试剂盒，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。在本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是健常者。本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
【专利说明】用于胸膜间皮瘤患者的早期发现的分子标志物及其表达分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及间皮瘤的检查方法、和用于间皮瘤的诊断的试剂盒。具体地，涉及包含血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白(Periostin)的浓度的测定步骤的间皮瘤的检查方法、和包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体的用于间皮瘤的诊断的试剂盒。
【背景技术】
[0002]已知间皮瘤由于石棉的吸引而发生。间皮瘤根据发生部位而分类为胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心膜间皮瘤。胸膜中的发生最多，占全部间皮瘤的8成?9成(非专利文献I)。良性的胸膜间皮瘤称为纤维性间皮瘤，在肺炎、外伤等之后，胸膜发生纤维增生，结果形成局限性的肿块；与此相对，恶性胸膜间皮瘤是由胸膜间皮(覆盖包裹肺的胸膜的肺侧表面的二重的膜)发生的肿瘤，是恶性度高的肿瘤。恶性胸膜间皮瘤进行组合了外科疗法、内科疗法和放射线疗法的治疗，但仍属于预后差的肿瘤之一。间皮瘤具有潜伏期非常长的特征，从向石棉的曝露到间皮瘤发生的时间为11?54年(中位数38.6年)。鉴于日本石棉使用最多的时期为1970?1990年，预计到2030年为止间皮瘤患者持续增加。该长的潜伏期连同没有对早期发现有用的筛选法的现状，造成了发病发现的延迟。晚期例的经过极不良，快速扩散、数年以内死亡的病例为大半。然而，对于可以治愈切除的早期发现例，却可以期待长期生存。因此，能够早期发现的新的筛选检查的开发成为迫切的课题。
[0003]恶性胸膜间皮瘤的早期诊断极困难，当因为胸痛、胸积水造成的呼吸困难等自觉症状而发现时，基本上已经是晚期。作为在诊断恶性胸膜间皮瘤时有用的标志物，可列举胸水中的透明质酸、CYFRA、CEA等，但具有作为样品必须采集胸水、诊断精度低等大的问题。进而，为了进行确实的诊断，必须使用活检材料进行真正的病理组织诊断，精神、肉体、社会的负担极大。另外，恶性胸膜间皮瘤作为组织型分为上皮型、肉瘤型、其混合型(双相型)，但特别是肉瘤型没有有效的诊断方法，预后劣恶。因此，多数情况下诊断为恶性间皮瘤诊断时，已经大范围扩散、不可能进行根治手术，预后极不良，I年生存率为50%左右，2年生存率为20%左右。
[0004]由于石棉曝露而非肿瘤性炎症性的障害在肺、胸膜内发生，因此石棉曝露者在间皮瘤未发病的阶段已经发现医学影像学异常。因此，认为医学影像学检查作为筛选有用性低。另外相对于曝露者的数，实际发病的病例的比例小。现状是渴望对于石棉曝露者简便且廉价、可信度高的检查方法。
[0005]首先，本
【发明者】们着眼于作为血中的肿瘤标志物的间皮素(mesothelin)阳性例限于上皮型的间皮瘤，尝试探索对于肉瘤型的胸膜间皮瘤例也能确认阳性例的标志物。肉瘤型胸膜间皮瘤的诊断被倡导必须进行细胞诊断、胸膜活检、图像诊断，诊断极困难(非专利文献2)。本
【发明者】们经由利用了质谱装置的IDA(信息相关采集,Information DependentAnalysis)、运用了数据库的生物信息学分析、使用了 DNA微阵列的与基因表达的比较、利用基序(motif)检索的蛋白质功能预测、利用与内标资料的比较的定量化等工序，通过应用蛋白质组分析结果的挖掘技术来分析胸膜间皮瘤组织样品中的蛋白质表达谱，尝试获得数百种蛋白质的表达信息，并成功地获得。
[0006]进而为了进行作为血液中的标志物的候选缩小研究，进行了以血液为对象的蛋白质组学分析:利用了质谱装置的MRM(多反应监测，Multiple Reaction Monitoring)。并且，对于所述数百种蛋白质中的特别数十种蛋白质，与作为对照的正常胸膜间皮组织样品比较，确认了在恶性胸膜间皮瘤组织样品中其存在量增大。进而，在恶性胸膜间皮瘤病例血液样品中，与作为对照的除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患病例比较，确认了骨膜蛋白(Periostin)的浓度上升。
[0007]骨膜蛋白最初称为成骨细胞特异性因子-2 (0SF-2)，是作为在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞中特异地表达的基因而被分离鉴定的分子(非专利文献3)。由骨膜蛋白基因所编码的氨基酸序列包含一般的信号序列、富含半胱氨酸的结构域(Cysteine-richDomain)、4次重复的由约150个氨基酸组成的成束蛋白(Fasciclin) I结构域、和羧基末端结构域。骨膜蛋白中存在4种仅羧基末端区不同的剪接突变体的同种型。有骨膜蛋白不是在肺癌的肿瘤细胞本身、而是在肿瘤周围的间质细胞中高表达的报告(非专利文献4、5)；血清中的骨膜蛋白虽然没有发现在非小细胞性肺癌存在诊断中的有用性，但有可能成为预后的标志物的报告(非专利文献4、5);在乳癌中高表达的报告(非专利文献6);在胸腺癌中高表达的报告(非专利文献7);在胰癌中高表达的报告(非专利文献8)。但是这些癌是与间皮瘤完全不同的病状。进而，有公开了识别骨膜蛋白的形成剪接突变体的羧基末端结构域的第17外显子的氨基酸的抗体在心疾患和其他癌种的诊断和治疗中有效的专利申请(专利文献1、2)。但是，关于骨膜蛋白的表达和在血中的存在、与间皮瘤的关系到目前为止未知。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:国际公开第W02007/077934号小册子
[0011]专利文献2:国际公开第W02009/001940号小册子
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1:Fujimoto N.等、J Cancer Res Clin Oncol.、136:1755、2010
[0014]非专利文献2:Husain 等、Arch.Pathol.Lab.Med.> 133:1317、2009
[0015]非专利文献3: Takeshita S.等、Biochem J、294:271、1993
[0016]非专利文献4: Sasaki H.等、Jpn J Cancer Res.、92:869、2001
[0017]非专利文献5:Sasaki H.等、Cancer.、92:843、2001
[0018]非专利文献6:Shao R.等、Mol Cell Biol.,24:3992,2004
[0019]非专利文献7: Sasaki H.等、Cancer Lett.、72:37、2001
[0020]非专利文献8:Baril P.等、0ncogene、26:2082、2007

【发明内容】

[0021]发明要解决的课题
[0022]需要开发简便且廉价、可信度高的间皮瘤的检查方法，和该检查方法中使用的试剂盒。[0023]用于解决课题的方法
[0024]本发明提供间皮瘤的检查方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白(Periostin)蛋白质的浓度的测定步骤。
[0025]本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0026]本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
[0027]本发明的间皮瘤的检查方法中，有时使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
[0028]本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤。
[0029]本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述间皮瘤是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。
[0030]本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述血液样品是受试者的血浆或血清的样品O
[0031]本发明提供用于间皮瘤的诊断的试剂盒，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0032]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。有时所述试剂盒通过ELISA法来测定人骨膜蛋白蛋白质的浓度。
[0033]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
[0034]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时包含固定化了能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体中的一种的固体支持体、和针对所述2种抗体中的另一种的特异性结合配偶体(partner)。有时所述试剂盒通过夹心ELISA法来测定人骨膜蛋白蛋白质的浓度。
[0035]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
[0036]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
[0037]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0038]本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0039]本发明提供间皮瘤的诊断方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。
[0040]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0041]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
[0042]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
[0043]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
[0044]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
[0045]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0046]本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0047]本发明中，间皮瘤是来源于间皮细胞的肿瘤，根据基于原发组织的分类，也指胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心膜间皮瘤中的任一种。另外，根据基于构成肿瘤组织的细胞型的分类，恶性间皮瘤也指上皮型、肉瘤型、和它们的混合型(双相型)的任一种。本发明的间皮瘤有时是胸膜间皮瘤，有时是肉瘤型恶性胸膜间皮瘤。间皮瘤的检查对于石棉曝露者的健康是重要的，因此本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法优选应用于胸膜恶性胸膜间皮瘤。在利用现有的生物化学标志物的间皮瘤的检查方法中，不能检测出肉瘤型和双相型的恶性胸膜间皮瘤，与此相对，本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法能够检测出肉瘤型和双相型的恶性胸膜间皮瘤。因此，本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法优选应用于肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法有时用于从健常者中判别间皮瘤的患者。本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法有时用于从除了恶性胸膜间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者中判别恶性胸膜间皮瘤的患者。这里，除了恶性胸膜间皮瘤以外的呼吸器官疾患是指肺癌、和除了癌以外的呼吸器官疾患。除了癌以外的呼吸器官疾患包含COPD和良性的胸膜间皮瘤，但不限于此。
[0048]本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的受试者是指需要接受间皮瘤的检查的所有人。有时本发明的间皮瘤的检查方法的受试者表现咳、痰、胸痛、呼吸困难等症状。有时所述受试者是可能患间皮瘤的受试者。所述可能患间皮瘤的受试者包含有所述症状的人、和/或经历了石棉吸引或曝露或者怀疑经历了石棉吸引或曝露的人，但不限于此。
[0049]本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的血液样品可以是全血、血浆、血清的任一种。所述血液样品优选为采血后分离的血浆或血清。用于本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法的采血、以及必要时的血浆或血清的调制使用本领域技术人员公知任一技术来实施。简洁地，在血浆的调制中，将包含EDTA、其他螯合剂、但不限于此的血液凝固抑制剂添加到采取的全血样品中后，通过离心除去细胞成分。在血清的调制中，在采取的全血样品中引起血液凝固反应，通过离心分离而从血沉分离血清。用于本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法的胸水的采取、和必要时的胸水样本的调制使用本领域技术人员公知的任一技术来实施(例如，请参照Porcel J.M.和LightR.W.(Am.Fam.Physician.>73:1211、2006))。
[0050]本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的人骨膜蛋白蛋白质，是指包含序列号2所列举的由630个氨基酸组成的氨基酸序列的任一人骨膜蛋白基因产物、以及与识别包含序列号2的氨基酸序列的多肽的抗体结合的人骨膜蛋白基因座的任一突变体的基因产物。
[0051]本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度，可以通过任何方法测定。一般地，人骨膜蛋白蛋白质的浓度，使用能与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的任一分子来测定。人骨膜蛋白蛋白质的浓度优选使用与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的抗体来测定。这里，与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的抗体有时选自多克隆抗体或单克隆抗体、该抗体的抗原结合片段、以及包含该抗原结合片段的重组抗体或嵌合抗体中。
[0052]与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的多克隆抗体或单克隆抗体使用本领域技术人员公知的任一技术来制作。本说明书的实施例中公开了与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的单克隆抗体的制作技术，但本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法可以不限于所述实施例中记载的单克隆抗体地实施。
[0053]本说明书中的“抗体的抗原结合片段”，是指参加抗原结合的抗体的部分。所述抗原结合部位由重(H)链和轻(L)链的N末端的可变(V)区的氨基酸残基形成。所述抗原结合片段除了包含将完整的多克隆抗体或单克隆抗体分别用蛋白质分解酶木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分解而得的Fab片段或F(ab’)2片段之外，还包含Fv片段，该Fv片段包含非共价结合的、包含较多地保持天然抗体分子的抗原识别能力和结合能力的抗原结合部位的％和\区的杂2聚体。
[0054]本发明的抗体中，有时重组抗体通过包括转化适当的细菌宿`主、或者转染适当的哺乳类细胞宿主的抗体基因的表达克隆化来调制。本发明的抗体中，有时嵌合抗体是以所述本发明的重组抗体的抗原结合部位能与所述多肽结合的方式通过同种或异种的抗体的恒定结构域来支持的融合蛋白质。所述嵌合抗体包含:包含与抗体轻链可变区(')可操作地连接的抗体重链可变区(Vh)的单链可变部抗体(scFv),和由骆§它科(CameIidae,包含骆驼、单峰骆驼、羊驼)的动物产生的没有轻链的IgG类的骆驼重链抗体(HCAb)或其重链可变部结构域(VhD)。所述重组抗体可以使用来源于原核生物和真核生物的基因表达系统大量地调制。
[0055]本发明的间皮瘤的检查方法、有时试剂盒和/或诊断方法中的“受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤”，通过与受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的骨膜蛋白结合的抗骨膜蛋白抗体、该抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体等标记来检测或定量。有时所述抗骨膜蛋白抗体直接地或介由接头(linker)而被生物素那样的低分子配基、酶、放射性同位素、色素、荧光色素、化学发光性化合物等标记。针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体包含能与抗骨膜蛋白抗体特异性地结合的本领域技术人员所知的所有物质。所述针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体以受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定没有障碍为条件，可以是能与抗骨膜蛋白抗体结合的任何受体或配基。所述受体或配基有时是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、其他生物体高分子。本发明中使用的针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体有时选自多克隆抗体或单克隆抗体、该抗体的抗原结合片段、和包含该抗原结合片段的嵌合抗体或重组抗体中。抗体的抗原结合片段是指参加抗原结合的抗体的部分。所述抗原结合部位由重(H)链和轻(L)链的N末端的可变(V)区的氨基酸残基形成。有时所述针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体被酶、放射性同位素、色素、荧光色素等标记。所述酶是过氧化物酶(POD)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、碱性磷酸酶(ALP)等。所述酶一般与适当的底物组合使用。检测的步骤有时包括用分光光度计测定吸光度的步骤、和/或用发光计测装置测定发光或荧光的强度的步骤。进而有时与胶乳颗粒等其他微粒结合。此时，有时检测的步骤包括用比浊计测定浊度的步骤。有时定量的步骤包括:将与已知浓度或量的人骨膜蛋白蛋白质结合的抗骨膜蛋白抗体的量数值化而作图制成标准曲线的步骤；和使用所述标准曲线，从与未知浓度或量的受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白蛋白质结合的所述抗骨膜蛋白抗体的量，计算出该受试者的所述血液样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度或量的步骤。为了制成标准曲线，只要有浓度或量已知的人骨膜蛋白蛋白质至少2种即可，为了确保定量精度优选，为3种或4种以上。有时检测或定量的步骤包括通过洗涤而除去未与受试样品结合的抗骨膜蛋白抗体和其他抗体的步骤。这里将使用被酶标记的抗体等的测定技术称为ELISA法。并且，将为了将所述样品中的人骨膜蛋白蛋白质捕捉到固体支持体、和为了检测或定量捕捉到该固体支持体的人骨膜蛋白蛋白质，而使用能同时与人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗人骨膜蛋白蛋白质抗体的测定技术，称为夹心ELISA法。所述2种抗人骨膜蛋白抗体可以是表位不同的2种单克隆抗体，也可以是单克隆抗体与多克隆抗体。
[0056]本发明的间皮瘤的诊断方法中，在确定受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度时，在所述浓度显示高于基准值的值的情况下，判断所述受试者有间皮瘤的嫌疑。所述基准值可以通过本领域技术人员公知的统计处理计算出。
[0057]有时本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的“受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤”通过本领域技术人员已知的各种手法实施。例如，有时所述手法除了已经说明的ELISA法和胶乳凝集法之外，还通过表面等离子体共振法来实施。
[0058]有时用于实行本发明的免疫学的分析方法的试剂盒除了包含本发明的抗骨膜蛋白抗体之外，还包含用于制成标准曲线的已知浓度或量的对照样品。所述对照样品有时是人骨膜蛋白蛋白质，和/或其融合蛋白质。
[0059]本发明提供以能实行本发明的间皮瘤的诊断方法的方式构成的骨膜蛋白的免疫学的分析装置。所述装置包含=CCD相机等检测单元，分光光度计、荧光分光光度计、比浊计、表面等离子体共振测定器等测定单元，用于试剂、洗涤液和/或样品的注入和/或除去的分配器单元，用于ELISA法用多孔板和/或表面等离子体共振用传感器芯片的操作的机械臂单元，用于这些单元的控制的控制单元等。
[0060]本说明书中所提及的全部文献其全体通过引用而包含在本说明书中。
【专利附图】

【附图说明】
[0061]图1是显示人骨膜蛋白蛋白质的功能结构域的位置、各同种型的结构、与本发明的骨膜蛋白抗体制作中使用的免疫原的结构之间的关系的模式图。
[0062]图2A是使用以P0STN781涂布的微板，研究以人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN781为免疫原而制作的单克隆抗体的反应性的结果的图。
[0063]图2B是使用以P0STN630涂布的微板，研究以人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN630为免疫原而制作的单克隆抗体的反应性的结果的图。
[0064]图3是显示间皮瘤患者和健常者的血浆样本各自的骨膜蛋白的浓度的分布的图。
[0065]图4是对于间皮瘤患者的血浆样本将同一样本的骨膜蛋白和SMRP的血浆中的浓度作图而得的相关图。
[0066]图5是将患者样本中的血浆样本与血清样本中的骨膜蛋白浓度进行比较而得的图。
[0067]图6是将本实施例的恶性胸膜间皮瘤、肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患(图6中表示为“呼吸器官疾患”)的患者样本中的骨膜蛋白浓度的分布进行比较而得的图。
[0068]图7是显示以骨膜蛋白浓度为标志物的、相对于合并了肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患的除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患患者的、本实施例的恶性胸膜间皮瘤患者样本的ROC曲线。
[0069]图8是表示株化癌细胞的培养上清中的骨膜蛋白的测定结果的图。
【具体实施方式】
[0070]以下说明的本发明的实施例仅是为了例示，并不限定本发明的技术的范围。本发明的技术的范围仅由专利权利要求书的记载来限定。可以以不脱离本发明的宗旨为条件，进行本发明的变更，例如，本发明的构成要件的补加、删除和置换。
[0071]实施例1
[0072]抗骨膜蛋白抗体的制作
[0073](I)人骨膜蛋白蛋白质的结构
[0074]图1是显示人骨膜蛋白蛋白质的功能结构域的位置、各同种型的结构、与本发明的骨膜蛋白抗体制作中使用的免疫原的结构之间的关系的模式图。在图1中，EMI和成束蛋白I分别表示EMILIN同源结构域和成束蛋白同源结构域。isol?4分别表示人骨膜蛋白的同种型I?4。P0STN781表示在人骨膜蛋白蛋白质同种型3的781个氨基酸的多肽的羧基末端融合myc标签和his标签(表示为“mychis”)而得的重组蛋白质。P0STN630表示在包含至4个成束蛋白结构域的、人骨膜蛋白蛋白质的全部同种型中共有的630个氨基酸的多肽的羧基末端融合了 myc标签和his标签的重组蛋白质。人骨膜蛋白蛋白质同种型3的781个氨基酸的氨基酸序列在序列号I中列举。人骨膜蛋白蛋白质的所有同种型中共有的包含至4个成束蛋白结构域的630个氨基酸的氨基酸序列在序列号2中列举。
[0075](2)人骨膜蛋白的cDNA获得
[0076]基于人骨膜蛋白蛋白质的4种同种型的cDNA序列(同种型1:NM_006475、同种型 2:ΝΜ_001135934、同种型 3:NM_001135935、同种型 4:NM_001135936)，在同种型 I ?4所共有的5’ UTR区和3’ UTR区设计引物。在第I阶段的PCR反应中使用的引物是5’ -AATTCTGAGCTCTCCAAAGCCC-3’(序列号 3)和 5’ -GGCTAACTCCACAAITTCCCTC-3’(序列号4)，第2阶段的PCR反应中使用的引物是5’ -CGGAGAGACTCAAGATGATTCC-3’(序列号5)和 5’ -TCCTGAAGTCAACTTGGCTCTC-3’ (序列号 6)。以插入了人 cDNA 文库的混合物(mosaiccDNA (商标)、Genofi, LLC、San Clemente, CA92673)为模板，使用 PCR 扩增酶(KOD FX、东洋纺织株式会社)和所述引物通过巢式PCR来扩增包含骨膜蛋白的蛋白质编码区全长的cDNA。第I阶段的PCR反应在将[98°C 20秒、55°C 20秒、68°C 2分30秒]进行25个循环的条件下实施，第2阶段的PCR反应在将[98°C 15秒、55°C 15秒、68°C 2分30秒]进行30个循环的条件下实施。第2阶段的PCR反应的扩增产物克隆化到克隆化载体pT7BlueT-Vector (Novagen、夕株式会社)中，使用自动测序仪(Applied Biosystem)确认碱基序列。克隆化的cDNA与同种型3 —致，因而命名为POSTNiso3-pT7。
[0077](3)人骨膜蛋白重组蛋白质的分泌表达系统的构建
[0078]作为用于使动物细胞表达人骨膜蛋白重组蛋白质的载体，使用由CMV启动子控制、通过IRES序列使目的基因的产物与嘌呤霉素-EGFP融合蛋白质同时表达的pQCxmhlPG。PQCxmhIPG是由
【发明者】们对BD Retro-X(商标)Q Vectors的pQCXIP载体进行改变而制作的。P0STN781表达载体如下构建。目的序列的PCR扩增，以P0STNiso3-pT7作为模板，使用 KOD FX 来进行。使用 5’ 引物(5，-CGGGCGGCCGCACCATGATTCCCTTTTTAC-3’、序列号 7、下划线部为 NotI 识别序列)、和 3’ 引物(5，-TTTTTGGACTCGAGCTGAGAACGACCTTCC-3’、序列号
8、下划线部为XhoI识别序列)。反应条件是将[94°C 15秒、55°C 15秒、68°C 2分30秒]进行30个循环。所得的PCR反应产物用限制性酶NotI和XhoI消化，插入pQCxmhlPG的Not1-XhoI部位，从而构建表达载体pQCxmhIPG-P0STN781。P0STN630表达载体如下构建。目的序列的PCR扩增，以上述P0STNiso3-pT7为模板，使用Pfu酶(口 J力株式会社)进行。使用 5’ 引物(5，-CGGGCGGCCGCACCATGATTCCCTTTTTAC-3’、序列号 9、下划线部为 NotI识别序列)和3’引物(5’ -GGTGTCTCGAGTGGATAGAGGAGTTTATC-3’、序列号10、下划线部为XhoI识别序列)。反应条件是将[98 °C 15秒、55 °C 15秒、68°C 2分30秒]进行30个循环。所得的PCR反应产物用限制性酶NotI和XhoI消化，插入pQCxmhlPG的Not1-XhoI部位，从而构建表达载体pQCxmhIPG-P0STN630。
[0079]为了建立人骨膜蛋白重组蛋白质的分泌表达细胞株，使用逆转录病毒包装细胞系统(Pantropic Retroviral Expression System、Clontech、K1063-1、夕力 9 才株式会社)。在涂布了胶原蛋白的IOOmm盘中准备80~90%汇合状态的GP2-293 (Clontech、K1063-1、夕力5 ”'4才株式会社)，使用Lipofectamine2000，将所述表达载体pQCxmhIPG-P0STN781 或 pQCxmhIPG_P0STN630、与 pVSV-G (Clontech ；K1063-1) 一起共转染各11.2 μ g。48小时后，回收包含病毒颗粒的上清，通过超速离心(18，000转/分注、1.5小时、4°C )将所述病毒颗粒作为沉淀物分离。所述沉淀物用30 μ L的TNE(50mM Tris-HCl (pH值7.8)、130mM NaClUmM EDTA)悬浮，调制逆转录病毒载体浓缩液。将逆转录病毒载体浓缩液5 μ L用包含8 μ g/mL海美溴铵(H-9268、'> V ^ r <j ,千''J \ η >株式会社)、和10%牛血清的DMEM(D5796、'> V ^ r )V .; ?千y' ^ >株式会社)150 μ L稀释，调制含有病毒颗粒的培养基。在96孔微板中将以约40%汇合的状态准备的293Τ培养基转换为所述含有病毒颗粒的培养基，进行pQCxmhIPG-P0STN781或pQCxmhIPG_P0STN630的基因导入。所述基因导入后，用包含5 μ g/mL的嘌呤霉素(P-8833、'> V ^ r <j y千y' ^ >株式会社)、和10%胎牛血清的DMEM进行扩大培养，建立人骨膜蛋白重组蛋白质的表达细胞株P0STN781/st293T 和 P0STN630/st293T。
[0080](4)人骨膜蛋白蛋白质的纯化
[0081]人骨膜蛋白重组蛋白质的表达细胞株P0STN781/st293T和P0STN630/st293T通过293细胞用的无血清培养基CD293(Invitrogen、9 4 7 f ^ ^ 口 y'—文' ''J ^ >株式会社)各 IL 来培养。从培养上清中，使用 TALON Purification Kit (Clontech、K1253-1)回收重组蛋白质P0STN781和P0STN630，用PBS透析。用SDS-PAGE和蛋白质印迹来确认纯化蛋白质。使用蛋白检测试剂盒II(BioRad、500-0002JA、八4才？ 9 ^卜'' 9术9卜1J 一文株式会社)确定蛋白质浓度。
[0082](5)针对人骨膜蛋白重组蛋白质的单克隆抗体的制作
[0083]将如⑷中说明的那样纯化的人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN781和P0STN630与等量的完全弗氏佐剂(F5881、V V ^ r IV Y 千y' ^ >株式会社)混合而乳化，对每I只BALB/c小鼠(4周龄、雌性)每隔3~7天致敏5~20 μ g，致敏6次。在最终免疫的3天后从小鼠摘出淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞P3U1 (P3-X63Ag8Ul)进行细胞融合。
[0084]细胞融合按照常规方法如下进行。全部培养基中的胎牛血清通过在56°C保温30分钟保温的处理而灭能。P3U1用添加了青霉素、链霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。摘出的小鼠淋巴细胞与P3U1以1:10~1:2的比例混合而离心。一边对沉淀的细胞缓缓添加50%聚乙二醇4000(1.09727.0100、^ ^ 株式会社)一边平稳地混合后，离心。沉淀的融合细胞用含 15% FBS 的 HAT 培养基(RPMI1640、HAT_supplement (Invitrogen、11067-030、3 A y吁9 ) u j—文j \ ^ >株式会社)、青霉素和链霉素)适宜稀释，以每孔200 μ L接种于96孔微板。融合细胞在CO2孵育箱(5% C02、37°C )中培养，在刚刚形成集落之后，取样培养上清，进行筛选。筛选中，选择通过免疫中使用的针对以P0STN781或P0STN630涂布的96孔板的ELISA法而显示阳性的孔的融合细胞集落。用含15%胎牛血清的 HT 培养基(RPMI1640、HT-supplement(Invitrogen、21060-017)、青霉素和链霉素)扩大培养后，通过有限稀释法进行克隆化。这样，以人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN781为免疫原得到了杂交瘤克隆为 13 个(抗体号:# 3-4-5、# 3-6-1、# 3-9-2、# 3-10-2、# 3-11-4、#3-20-3、# 3-27-1、# 3-28-3、# 3-29-1、# 3-30-1、# 3-31-3、# 3-33-3、# 3-34-1)。以人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN630为免疫原得到了杂交瘤克隆13个(# 6_1_2、# 6_3_1、
#6-9-1、 # 6-10-2、 # 6-13-2、 # 6-14-3、 # 6-16-3、 # 6-19-1、 # 6-20-1、 # 6-23-5、
#6-43-1、# 6-45-1、# 6-88-1)。
[0085](6)抗人骨膜蛋白单克隆抗体的反应性
[0086](5)中所得的抗人骨膜蛋白单克隆抗体对人骨膜蛋白的反应性如下验证。从各杂交瘤克隆的培养上清中，通过使用蛋白A-Sepharose的一般亲和性纯化法来纯化单克隆抗体。所得的纯化抗体分别以5 μ g/mL为最大浓度进行连续稀释，人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN781或P0STN630对各自的免疫原的反应强度通过ELISA法确认。
[0087]图2A是使用以500ng/mL的P0STN781涂布的微板研究以人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN781为免疫原的单克隆抗体的反应性的结果的图。图2B是使用以500ng/mL的P0STN630涂布的微板研究使用人骨膜蛋白重组蛋白质P0STN630作为免疫原的单克隆抗体的反应性的结果的图。如图2A和B所示，确认了全部单克隆抗体克隆与作为免疫原的重组蛋白质之间浓度依赖性地发生反应。另一方面，对具有与所述人骨膜蛋白重组蛋白质相同的myc标签和his标签的、其他来源于人的重组蛋白质，也同样地通过ELISA法研究了反应性，结果不反应。因此，确认了(5)中得到的单克隆抗体均不是识别标签序列的寡肽的抗体。另外，以P0STN781为免疫原得到的13个单克隆抗体全部与P0STN630反应。因此，可以得到如下结论:本实施例中得到的全部抗人骨膜蛋白单克隆抗体，识别包含到4个成束蛋白结构域的人骨膜蛋白蛋白质的全部同种型所共有的630个氨基酸(序列号2)的多肽。[0088](7)夹心ELISA法的构建
[0089]由于作为夹心ELISA法的检测侧抗体使用，因而将本实施例中得到的全部单克隆抗体进行生物素标记。即，在抗体溶液中对每Img抗体混合16.7 μ L的IOmM EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo、7 f ^、>株式会社)，在室温孵育I小时后，用PBS透析，除去未标记的生物素。从26个单克隆抗体克隆中，如下通过使用全部26 X 26的组合来确定适合夹心ELISA法的捕捉和检测的抗体克隆的组合。首先，将在0.1M NaHC03、0.1M Na2COjP
0.15% Proclinl50(SUPELC0、'> 夕''K >j ” 千 y' ^ >株式会社)的溶液中以 10 μ g/mL的浓度稀释后的26个抗体克隆，分别在96孔微板的各孔中添加各50μ L，在4°C静置过夜或室温静置2小时，将抗体固定化于所述微板的孔底面。除去所述溶液后，分注封闭缓冲液(添加了 1% BSA(Proliant) ,0.15% Proclinl50 和 5%蔗糖的 PBS)各 150yL(4°C静置过夜或室温静置2小时)。除去所述封闭缓冲液后，分注用添加了 1% BSA、0.1% Tween20、
0.15% Proclinl50 和 50 μ g/mL MAK-33 (口 '> Λ i r J % r λ ” I 株式会社)的PBS稀释成10ng/mL、lng/mL或Ong/mL的浓度的P0STN781蛋白质50 μ L，室温静置I小时。除去所述P0STN781蛋白质溶液后，用PBS-0.05 % Tween20洗涤3次。分注5 μ g/mL的浓度的用生物素标记的26个抗体克隆，在室温静置I小时。将所述生物素标记抗体克隆的溶液除去后，分注用PBS-0.05% Tween20洗涤3次。分注用1% BSA、0.135M NaCU0.1%p-Hydroxyphenylace、0.15% Proclinl50> 10mg/L 溴酌.蓝和 20mM HEPES 稀释至 20000 倍的链霉亲和素_polyHRP40 (SDT, 7 f - 株式会社)各50 μ L，在室温静置I小时。除去所述链霉亲和素_polyHRP40溶液后，用PBS-0.05% Tween20洗涤3次。分注TMB-US (Moss、^7 ? /sm才株式会社)各50 μ L，室温静置30分钟使其显色后，分注50 μ L的0.18Μ H2SO4使显色停止。用分光吸光度计测定吸光度Α450/Α620。选择P0STN781蛋白质10ng/mL的孔与0ng/mL的孔之间的吸光度的差为2.0以上、且抗原Ing/mL的孔与0ng/mL的孔之间吸光度的差为1.0以上的抗体组合。选择的单克隆抗体的组合如表1。
`[0090]表1
【权利要求】
1.间皮瘤的检查方法，其特征在于，包括受试者的血液和胸水中的至少任I种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。
2.根据权利要求1所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
4.根据权利要求1?3的任一项所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤，使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
5.根据权利要求4所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤。
6.根据权利要求4所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述间皮瘤是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。
7.根据权利要求1?6的任一项所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述血液样品是受试者的血浆或血清的样品。
8.用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
9.根据权利要求8所述的用 于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
11.根据权利要求10所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，包含:固定化了能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体中的一种的固体支持体、和针对所述2种抗体中的另一种的特异性结合配偶体。
12.根据权利要求8?11的任一项所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，所述间皮瘤的诊断，是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
13.根据权利要求8?11的任一项所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，所述间皮瘤的诊断，是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
14.根据权利要求12或13所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
15.根据权利要求14所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。
【文档编号】C12N15/09GK103842823SQ201280045049
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2011年9月15日
【发明者】柳泽圣, 高桥隆, 横井香平, 长谷川好规, 小野健一郎, 八木香澄, 增田瞳, 竹内俊幸 申请人:国立大学法人名古屋大学, 株式会社医学生物学研究所, 株式会社昂考米克斯