专利名称：抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法
技术领域：
本发明涉及植物抗病基因的植物基因工程以及分子标记辅助育种领域，具体涉及抗纹枯病基因的抗病基因同源序列及其分子标记，及其专用引物在水稻抗纹枯病中的应用。
背景技术：
水稻纹枯病是由枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)侵染而引发的一种真菌病害，世界各个稻区都有不同程度的发生。该病害可在水稻整个生育期都可发病，一般造成水稻减产10 30%，严重时可达50%。近年来，由于高产品种的推广，种植密度的提高，氮肥施用量的增加，水稻纹枯病的危害日益严重，已成为我国南方稻区的第一大病害。由于使用抗病品种防治纹枯病被认为最经济、最有效和对环境最友好的方式，因而对水稻纹枯病抗性基因研究成为热点，目前已定位的纹枯病抗性数量位点(Quantitative TraitLoci, QTL)约有90多个。不过，由于纹枯病抗性属于数量性状,而且纹枯病抗性QTLs的定位多是利用非基因功能的分子标记，例如微卫星标记(SSR)，因此这些分子标记在抗纹枯病育种上利用价值不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗纹枯病基因位点分子标记，通过检测这些与抗纹枯病关联的分子标记，可以预测水稻植株的纹枯病抗性，加快抗纹枯病水稻新品种的选育速度，简化选育手段。本发明实施例是这样实 现的，抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，该获取方法包括:引物及其序列、水稻抗纹枯病关联RGA引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注释号、编
码的蛋白质，具体为:
权利要求
1.抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，其特征在于，该获取方法包括:引物及其序列、水稻抗纹枯病关联RGA引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注释号、编码的蛋白质。
2.如权利要求1所述的抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，其特征在于，引物及其序列、水稻抗纹枯病关联RGA引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注释号、编码的蛋白质具体为:
3.如权利要求2所述的抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，其特征在于，抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法如下: RGA引物设计，根据检索到的全基因组抗病同源序列，利用引物设计软件PrimerPremier6设计了水稻全基因组RGA引物； 178份全球核心种质RGA基因型鉴定，用CTAB法提取137份全球核心种质的DNA，用1.中设计的备选RGA标记178份全球核心种质进行RGA基因型分析，PCR反应在NBIVeriti9600扩增仪上进行，扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，并记录带型；178份全球核心种质抗纹枯病表型，利用纹枯病病菌微管快速鉴定技术，对178份核心种质接种鉴定；抗性对照品种为Jasmine85,感病对照品种为Lemont ;每个品种选3株,设三次重复；当感病品种Lemont的发病指数达90%时，记录每个品种的发病情况； 分子性状关联分析，利用单分子标记分析方法进行分子性状关联分析，取P < 0.001,获得 RGA4、RGA218、RGA320、RGA378、RGA470、RGA50 和 RGA468 与纹枯病抗性相关联； 关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对，利用关联RGA标记对纹枯病抗感种质进行克隆测序。
4.如权利要求3所述的抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，其特征在于，关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对，利用关联RGA标记对纹枯病抗感种质进行克隆测序具体过程如下: 抗病同源序列克隆PCR扩增体系50 μ 1:1 μ I DNA, 10Xbuffer5 μ 1，IOmMdNTP2 μ 1，10 μ M引物各3 μ 1，高保真Taq酶0.5，超纯水35.5 μ I ； PCR 反应程序:94°C 5min;95°C 20s, 57°C 45s, 72°C lmin,共 35 个循环；然后 72°C延长7min ;最后4 C保存； PCR产物在1%琼脂糖电泳分离，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。再将用将目的片段构建到宝生物工程有限公司生产的PMD19T质粒载体，然后将构建好的载体转化到感受态大肠杆菌DH5ci中，最后送样测序。
5.如权利要求2所述的抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，其特征在于，序列比对分 析 序列RGA742共588bp，通过在线软件对抗感种质的PCR片段比对发现两者存在9个碱基缺失；编码一个144个氨基酸的P-1oopNTPase超级家族；通过比对，RGA74-2与L0C_0s01g52550 在 30253614bp 之间 95% 的同源； 序列RGA2183共807bp，编码一个119个氨基酸，通过DNAMAN6.0对抗感种质的PCR片段比对发现两者在蛋白质序列中存在I个氨基酸突变；通过比对，RGA2183与L0C_0s09gll020有三处共37个碱基缺失，在2871062bp之间89%的同源； 序列RGA3202共978bp，编码一个259个氨基酸；通过比对，RGA3202与L0C_0s07g09900在30173916bp之间99%的同源； 序列RGA3783共873bp，编码一个202个氨基酸。通过DNAMAN6.0对抗感种质的PCR片段比对发现两者在蛋白质序列中存在3个氨基酸突变；通过比对，RGA3783与L0C_0sl2g30070在20802758bp之间99%的同源； 序列RGA4703共1383bp，编码一个290个氨基酸。通过DNAMAN6.0对抗感种质的PCR片段比对发现两者在蛋白质序列中存在两个氨基酸突变；通过比对，RGA4703与L0C_0sl2g03750 在 26503630bp 之间 99% 的同源； 序列RGA50-2共1654bp，编码一个415个氨基酸的NBS蛋白家族。通过DNAMAN6.0对抗感种质的PCR片段比对发现两者在蛋白质序列中存在7个氨基酸插入/缺失突变；通过比对，RGA502 与 L0C_0sl2gl7490 在 16733326bp 之间 99% 的同源； 序列RGA4682共1189bp，通过DNAMAN6.0对抗感种质的PCR片段比对发现两者在碱基序列上存在插入/缺失突变；通过比对，RGA4682与L0C_0sl2g32680在16322535bp之间98%的同源。
全文摘要
本发明公开了水稻抗纹枯病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法，对全基因组抗病同源序列设计RGA引物,获得水稻种质的RGA基因型，通过纹枯病病菌微管鉴定技术178份核心种质的抗纹枯病表型，结合RGA基因型和抗纹枯病表型进行分子性状关联分析以及对PCR产物克隆测序，获得与抗纹枯病关联的抗病基因同源序列及其分子标记。本发明通过遗传转化和杂交，将其导入普通栽培水稻品种，能够提高水稻对纹枯病的抗性；本发明获得的抗纹枯病基因的相关联的分子标记，可检测抗纹枯病基因的有无，实现对抗病植株的间接选择，避免了接种纹枯病病菌鉴定受气候、地理位置等不确定因素的影响，可以用于早代选择，缩短抗纹枯病育种年限，提高育种效率。
文档编号C12N15/11GK103146690SQ201310046578
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者任鄄胜, 曾礼华, 任光俊, 高方远, 陆贤军, 吴贤婷 申请人:四川省农业科学院作物研究所