专利名称：人源性神经营养素－6基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经营养素(neurotrophin，NT)及其应用，特别涉及人源性神经营养素-6(neurotrophin-6，NT-6)及其应用。
背景技术：
神经营养素(neurotrophin，NT)是一类由神经组织或其靶组织产生的小分子蛋白质。1992年，Berkemerier等报道，在人的19号染色体上有一个新基因，与NT-5(neurotrophin-5)基因的开放阅读框有75％的同源性，他们称之为NT-6(neurotrophin-6)基因(见Berkemerier LR，Ozcelik T，Fyancke U，et al.Humanchromosome 19 contains the neurotrophin-5 gene locus and three related genesthat may encode novel acidic neurotrophins.J Somat Cell Mol，1992，18233-245)。1994年，Gotz等在对硬骨鱼的神经生长因子(NGF)基因进行克隆时，偶然得到一段新的基因片段，该基因不同于当时任何一个已经报道的NT家族成员的基因，他们也将其称为NT-6基因(见Gotz R，Koster R，Winkler C，et al.Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family.Nature，1994，372266-269)。对Gotz等和Berkemerier等报道的结果进行比较可见，硬骨鱼NT-6基因与人NT-6基因在碱基序列方面有很大差别。2002年，张承武等人在中华医学遗传学杂志上发表了“人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达”的论文，主要介绍了从流产胎儿大脑皮层提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应扩增得到人的NT-6基因cDNA片段，经酶切回收后克隆进pBK-CMV质粒，构建NT-6的表达载体，通过诱导，使NT-6基因在大肠杆菌中表达，含该基因的大肠杆菌在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的情况下，表达了特异性的蛋白质等内容(见中华医学遗传学杂志2002年12月第19卷第6期，P475-478)。该论文指出，其所得到的人源性NT-6基因与Berkemerier等所报道人的NT-6碱基序列相比，两者之间有一定差异。该论文虽然公开了一种人源性NT-6基因cDNA的制备方法、纯化步骤和鉴定方法，并认为NT-6“应具有促进神经细胞的生长、分化以及保护并修复受损伤的神经元等功能”，但尚未公开其所制备的人源性NT-6基因的碱基序列，也未提供生物学试验来证实其所得到的人源性NT-6基因的功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人源性NT-6基因的碱基序列，并证明此种人源性NT-6基因的用途，以便开发出一类新的药品。
本发明所述的人源性NT-6基因，采用逆转录多聚酶链反应方法，由流产胎儿脑组织的RNA中获取，然后将其克隆进原核表达载体，观察人源性NT-6在大肠杆菌中的表达情况，并对人源性NT-6 cDNA和由其编码的氨基酸序列进行分析。所得到的人源性NT-6 cDNA，经TaKaRa和上海基康两家公司进行测序鉴定，两者所得测序结果完全一致，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
本发明通过实验证明，上述人源性NT-6 cDNA中编码成熟肽片段的原核表达产物对神经元具有营养作用，还可以对抗由于轴突损伤引起的神经元溃变。因此，可制备含有上述人源性NT-6基因的药品，以治疗神经系统损伤性病变类疾病。
本发明为制备治疗神经系统损伤性病变的药品提供了一种新方法。
图1是培养12天后，对照组(A)和实验组(B)海马NSE阳性神经元照片图；图2是面神经切断侧面神经核尼氏染色照片图，A正常对照组，B空白对照组，CNT-6实验组，D生理盐水对照组(×200)；图3是正常对照组和NT-6实验组动物面神经切断对侧和同侧面神经核尼氏染色照片图(×200)；图4是面神经切断侧面神经核ChAT免疫组化染色照片图，A正常对照组，B空白对照组，CNT-6实验组，D生理盐水对照组(×200)；图5是正常对照组和NT-6实验组动物面神经切断对侧和同侧面神经核ChAT免疫组化染色照片图，(×200)。
具体实施例方式
实施例1人源性NT-6基因的获得、纯化与鉴定1 材料1.1 菌株和质粒 大肠杆菌JM109及pBK-CMV质粒由本校分子生物学开放实验室保存。
1.2 总RNA 由流产胎儿脑组织提取。
1.3 试剂和酶X-gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside，IPTG)、DNA标记、限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNA抽提试剂盒、RT-PCR一步法试剂盒、胶回收试剂盒均由TaKaRa公司提供，其余常用试剂为进口及国产优级分析纯。
2 方法
2.1 引物的设计及其合成 根据Genbank中Berkemerier等所报道NT-6基因序列设计，并由TaKaRa公司合成引物。引物包含限制性内切酶BamH 1的酶切位点G↓GATCC和EcoR 1的酶切位点G↓AATTC。
引物碱基序列P1GCACGGATCCCAAGTCCTTTATATGGAGTCCC；P2CAACGAATTCACCAGTTCCTGGGTATAAGTC。
2.2 NT-6基因片段的获得和纯化 用RNA抽提试剂盒由流产胎儿大脑皮层提取总RNA，通过RTPCR扩增获取NT-6基因的cDNA片段，用胶回收法进行纯化。实验方法见试剂盒说明书。
2.3PBK-CMV质粒的制备 培养带有PBK-CMV质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒。方法见卢圣栋著《现代分子生物学实验技术》第2版，北京中国协和医科大学出版社，1999，P111-112，277-283。
2.4重组质粒的构建和转化 将获得的人NT-6基因片段和PBK-CMV质粒分别经EcoR 1和BamH 1酶切后用胶回收法进行纯化；酶切片段在T4DNA连接酶作用下，在12C水浴中经16小时重组。重组质粒转入用冰冷CaCl2致敏的感受态细菌JM-109，将转化后的细菌JM-109涂在含有IPTG、X-gal及卡那霉素的固体培养基上，待细菌长出后，选出白色菌落在含有卡那霉素的LB培养基中培养。方法见卢圣栋著《现代分子生物学实验技术》第2版，北京中国协和医科大学出版社，1999，P111-112，277-283。
2.5 重组质粒的鉴定 将阳性克隆进一步培养放大，提取质粒并经EcoR 1和BamH1酶切，琼脂糖电泳进行初步分析，然后由TaKaRa公司和上海基康公司对重组载体进行测序鉴定，所得碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
实施例2人源性NT-6肽片段的制备将实施例1制备的重组质粒在原核细胞中表达，具体操作如下分别将含有重组质粒PBK-NT6和未经重组的PBK-CMV质粒的单菌落接种到2ml LB培养基中(含终浓度为50ng/ml卡那霉素)，37℃振摇过夜；各取0.1ml培养基转种到10ml LB培养基中，37℃振摇3～4小时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导3小时，4℃ 10000r/min离心1分钟收集细菌。在收集的细菌中加入100μl凝胶加样缓冲液振荡均匀，沸水浴10分钟，12000r/min离心10分钟，取上清行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度15％，积层胶浓度5％)；用0.1％考马斯亮蓝(R250)染色，直至蓝色条带清晰可见，脱色液(40％甲醇、10％醋酸)脱色，照相后真空干燥仪将凝胶制成干胶保存。方法参考黄晓明、胡向阳、高翼之的论文(人睫状神经营养因子基因在大肠杆菌中的表达，中华医学遗传学杂志，1997，1569-71)。
实施例3人源性NT-6对体外培养海马神经元存活的促进作用1 海马神经元的培养无菌条件下取出乳鼠海马组织，剪碎后置于0.125％的胰酶中37℃消化10分钟，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化后，吸管反复吹打制成细胞悬液，200目不锈钢筛网过滤，调节细胞浓度为5×105个/ml后，移入四个内置经多聚赖氨酸处理的盖玻片6孔板中，放置于5％CO2的培养箱中进行培养。次日加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷3μg/ml，抑制非神经元细胞的分裂，两天后更换新鲜培养液。更换培养基时，将四个6孔板培养的神经元分为A、B两组，每组各用两个培养板。其中A组的培养液为含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺的DMEM培养基；B组的培养液为在A组基础上加入终浓度100ng/ml的人源性NT-6成熟肽片段。A组为对照组，B组为实验组。每三天换液一次，每次更新一半培养液。培养过程中，分别于第3、6、9、12、15和18天，每组各取两张细胞爬片，进行NSE免疫组化染色。
2 海马神经元的免疫组化染色细胞爬片经0.01mol/L PBS漂洗后，于4％多聚甲醛室温固定15分钟；PBS漂洗5分钟×3次，加新鲜配制的0.3％过氧化氢，室温反应30分钟，以耗竭内源性过氧化物酶；PBS漂洗5分钟×3次，正常血清室温封闭处理30分钟后，滴加1∶200兔抗鼠NSE，4℃反应过夜，PBS漂洗5分钟×3次；加入生物素化羊抗兔IgG 37℃放置20分钟，PBS漂洗5分钟×3次；滴加SABC37℃放置20分钟，PBS漂洗5分钟×3次；DAB室温显色，镜下观察控制反应时间，PBS漂洗两次终止反应；晾干后脱水、透明、封片。
3 海马神经元计数及统计学处理倒置相差显微镜(×200)下计数NSE阳性细胞，每个细胞爬片观察25个视野。对每组爬片所观察到的结果用均数±标准差(X±SD)表示，采用SPSS分析软件，通过配对T检验，对A、B两组结果进行统计比较，P＜0.05为有显著性差异。
4 结果经倒置相差显微镜下计数，在培养时间相同的情况下，加NT-6成熟肽片段实验组与对照组相比，神经元形态无明显差异；培养第3天，两组神经元存活数目无明显差异，但以后各时间点实验组存活的神经元数目显著多于对照组(P＜0.05)。结果见表1、图1。
表1.对照组和实验组NSE阳性神经元数目Time 3d 6d 9d 12d 15d 18dA32.67±4.13 27.25±2.87 22.76±2.64 18.33±2.19 14.25±1.87 10.76±1.54B32.48±4.32 30.66±3.11* 26.92±2.49* 23.58±2.08* 21.69±1.66* 16.82±1.43*A对照组；BNT-6组。*P＜0.05
5 结论人源性NT-6可以促进体外培养神经细胞的存活。
实施例4人源性NT-6对受损伤神经元的保护功能1 动物模型的制备、取材和切片1.1 动物模型的制备健康成年SD大鼠32只，雌雄不拘，随机分成四组，每组8只。A组为正常对照组，不做任何处理；B组为空白对照组，复合麻醉剂速眠新注射液(0.5ml/kg)腹腔注射麻醉，在无菌条件下，由右侧耳后出颅腔处切断面神经，然后缝合创口；C组为实验组，在右侧面神经支配肌肉中取5个点，每点注射NT-6成熟肽片段(1μg/ul)20μl，每天一次，连续注射三天后，按B组处理动物；D组为生理盐水对照组，用生理盐水取代NT-6成熟肽片段，其余处理同C组。
1.2 取材和切片动物饲养两周后，腹腔注射过量氨基甲酸乙酯处死，开胸经左心室插管，先后用生理盐水和4.0％多聚甲醛溶液各250ml灌流固定脑组织，取脑干置于4.0％多聚甲醛溶液中后固定一周，20％蔗糖磷酸缓冲液过夜，至脑干下沉。恒温冰冻切片机连续冠状切片，片厚40μm；每5张切片取两张，分为两套，分别行尼氏染色和免疫组化染色。
2 组织切片的染色2.1 尼氏染色取一套切片行尼氏染色。将切片裱至经多聚赖氨酸防脱片处理的载玻片上，37℃放置24小时干燥；置于80％酒精37℃过夜；蒸馏水反复冲洗；将切片置于1％硫瑾中，37℃ 6小时；取出切片梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
2.2 ChAT免疫组化染色另一套切片用0.01M PBS漂洗5分钟×3次；0.3％Triton-100 37℃湿盒中孵育30分钟，PBS漂洗5分钟×3次；滴加兔抗鼠ChAT单克隆抗体(1∶400)，37℃ 2小时，PBS漂洗5分钟×3次；加入生物素化羊抗兔IgG 37℃放置20分钟，PBS漂洗5分钟×3次，滴加SABC37℃放置20分钟，PBS漂洗5分钟×3次；DAB室温显色，镜下观察控制反应时间，用PBS漂洗两次终止反应；裱片，晾干后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
3 染色结果的测定及统计学处理利用MISA-1000图象分析系统测定每张切片的面神经核尼氏染色的平均强度值。各组织切片的面神经核尼氏染色强度值的结果以均数±标准差(X±SD)表示，采用SPSS分析软件，通过单因素方差分析对四组结果进行统计学比较，P＜0.05为有显著差异。
利用BI-2000图象分析系统计数每张切片面神经核内ChAT阳性细胞，各个组所得结果以均数±标准差(X±SD)表示，采用SPSS分析软件，通过单因素方差分析对四组结果进行统计比较，P＜0.05为有显著差异。
对尼氏染色和免疫组化染色的统计结果进行相关性分析。
4 结果4.1 尼氏染色实验结果各组动物面神经核尼氏染色强度值统计分析结果如表2所示。与空白对照组(B)、生理盐水组(D)相比，NT-6实验组(C)动物右侧(即切断面神经侧)面神经核尼氏染色的强度值显著增加(P＜0.01)(图2)；与正常对照组(A)相比，NT-6实验组(C)面神经核尼氏染色的强度值显著降低(P＜0.01)(图2)。与对侧相比，NT-6实验组(C)面神经核尼氏染色的强度值均显著下降(P＜0.01)，A组无显著性差异(P＞0.05)，B、D组染色的强度值均显著下降(P＜0.01)(图3)。A、B、C、D各组对侧面神经核尼氏染色的强度值无显著性差别(P＞0.05)。
表2.切断面神经侧及对侧面神经核尼氏染色强度值Group AB CDContralateral109.58±8.36103.66±6.93 106.22±6.46104.42±7.58##ipsilateral 108.21±7.7737.66±4.41**54.35±6.6**34.34±3.32**A正常对照组，B空白对照组，CNT-6实验组，D生理盐水对照组**P＜0.01在组内与对侧相比，##P＜0.01各组间切断面神经侧相比4.2 ChAT免疫组化染色结果面神经核内ChAT阳性神经元数目统计比较结果如表3所示。与空白对照组(B)和生理盐水组(D)相比，NT-6实验组(C)动物右侧(即面神经切断侧)面神经核内ChAT阳性神经元数目显著增加(P＜0.01)(图4)；与A组相比，C组面神经核内ChAT阳性神经元数目显著下降(P＜0.01)(图5)。与对侧相比，C组同侧面神经核内ChAT阳性神经元数目显著下降(P＜0.01)，A组无显著性差异(P＞0.05)(图5)，B、D组同侧面神经核内ChAT阳性神经元数目显著下降(P＜0.01)。各组间对侧的ChAT阳性神经元数目无显著性差别(P＞0.05)。
表3.各组切断面神经侧及对侧面神经核内ChAT阳性神经元数目Group A B C DContralateral95.46±8.9292.88±9.5693.28±8.3690.07±9.11##Ipsilateral 94.08±10.631.14±5.29** 51.50±6.23** 27.64±5.05**A正常对照组，B空白对照组，CNT-6实验组，D生理盐水对照组
**P＜0.01在组内与对侧相比，##P＜0.01各组间切断面神经侧相比对NT-6实验组及正常对照组的面神经核尼氏染色结果与面神经核内ChAT阳性神经元数进行相关分析，两者相关系数为0.89。
5 结论人源性NT-6可以对抗由于神经轴突损伤引起的面运动神经元逆行溃变，增加面运动神经元的存活数量。
序列表<110>四川大学<120>人源性神经营养素-6基因及其应用<160>1<210>1<211>829<212>DNA<213>人属(Homo)<400>1ACCAGTTCCT GGGTATAAGT CTCAGGCCCG GCCAGTCCGG CTGAGGAGTG1 50TGCAGACACA GGCAGTGCCA ATTTGAATCC ATCACCAGTC CACACAGCCC51 100TGGGCATCAG CGGTCAATGC CCGCACATAG GACTGCTTGG CCTTGCACTC101 150AGACACCCAG TGCCCCCCGG TCCACACCCT GCGGCAGCCC CTCCACCTAC151 200CCCTGGGCCA CCTTCTTCAG AGTTATTGGC CTCGAAGCAG GTGACAAAGA201 250AGTGTTGGCA GAGGGAACTG CCGCCAGCTG CAGGCACCTC GCCCAACACC251 300TCCACCTCCA GCACACCCGA GTCCACAGCG GTCCGGGGGT CTGTCACCCA301 350GCCAGTGACT GCATCACACA CGGCCAGCCT CACCCTGATG ACTCGCCAGT351 400GAAGTATTGC TCACCCCTCG CTGGCTGCGG TTGGCCCGGG CGCCTGCTGA401 450
CTCCCGAAAG GCCCCAGTCT CCAGCAGGAA GACCAGAGGG GGCCCGGCAG451 500CGGCACCCCT AGGCAGGACC ACTCGGGGGA AAAGAAGGTC CCACTTTGGA501 550TCAGGAAAAG GCGACAATGT CGAGGGTGGG GTTAGGACCC CATTGACACA551 600CTGGAGAGGA AGAAAATGAG GGGGATGTAG AGGGAGTCTG GGGGAGCGGG601 650AGCATCTCTC AGAGCACCTC TCAGAGCACA TGGAGACAGG GAAAAGGAGG651 700CTGGGATTAG AGAAGAGGAT AAACACTTCA GTGGGGTCAG AAGTTGGGAA701 750CCCCAGGGGA GGCCTGCCTA CCAGGATTAT GGGGAAGCCC TTGCTCTAGA751 800AGTTTGGGGG ACTCCATATA AAGGACTTG801 829
权利要求
1.一种人源性神经营养素-6基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。
2.权利要求1所述人源性神经营养素-6基因在制备治疗神经系统损伤性病变药中的应用。
全文摘要
本发明提供一种新的神经营养素——人源性神经营养素－6(neurotrophin－6，NT－6)基因的碱基序列，并证明此种人源性NT－6基因的用途。本发明所述人源性NT－6基因，采用逆转录多聚酶链反应方法，由流产胎儿脑组织的RNA中获取。实验证明，上述人源性NT－6 cDNA中编码成熟肽片段的原核表达产物对神经元具有营养作用，还可以对抗由于轴突损伤引起的神经元溃变。因此，可制备含有上述人源性NT－6基因的药品，以治疗神经系统损伤性病变类疾病。
文档编号A61P25/00GK1563069SQ200410022209
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者郑煜, 张承武, 蔡青松, 翟朝阳, 胡火珍 申请人:四川大学