穿膜型的带有荧光标签的talen-r11蛋白及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白及其制备方法和应用，旨在提供一种可以敲除细胞内源基因，达到基因治疗的目的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其技术要点：所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端都带有穿膜肽R11，即为EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11的蛋白；该TALEN-R11蛋白可以敲除细胞内源性基因，从而得到内源性基因被敲除的细胞；属于生物【技术领域】。
【专利说明】穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种TALEN-R11蛋白，具体涉及一种穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白，本发明还涉及该TALEN-R11蛋白的制备方法和应用；属于生物【技术领域】，
【背景技术】
[0002]细胞穿透肽多数为长度小于30个氨基酸的多肽分子，已经发现其可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间或细胞内的运输，且不受细胞类型的限制，在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有很大的研究价值。
[0003]基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗和药物靶点筛选，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。
[0004]近年来兴起的类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease, TALEN)技术是一种薪新的分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其祀位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。目前TALE技术主要应用是用TALEN技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out。它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。
[0005]目前，利用ShRNA库做药物靶点筛选已经很普遍。而且其只限于质粒或者修饰后的核苷酸的形式来转染细胞。其效率比低，脱靶效应严重。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明的提供一种可以特异性敲除细胞内源基因，达到基因治疗的目的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白，本发明还提供该TALEN-RlI蛋白的制备方法以及敲除细胞内源基因的方法。
[0007]为解决前一技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的:该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-Rl I蛋白，其所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端分别带有穿膜肽RlI，即为EGFP-TALEN-R11和 DesRed-TALEN-Rll 的蛋白。
[0008]上述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白，所述的EGFP-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID N0.1所示。
[0009]上述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白，所述的EGFP-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID N0.2所示。
[0010] 本发明提供的另外一技术方案是这样的:该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白的制备方法，依次包括下述方法:
[0011]I)载体的构建
[0012]a) EGFP-TALEN-R11原核表达载体的构建:
[0013]用核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的引物TALE_GFP_F:NdeI58和核苷酸序列如SEQID N0.4所示的引物GFP_R，扩展质粒pTALEN_v2的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的引物TALE_R2 =BamHI扩展TALE-ccdB_Chl片段；两个片段融合后，克隆到原核表达载体PET-16b的NdeI和BamHI位点，得pET16b-EGFP_TALEN-Rll原核表达载体；
[0014]b) DesRed-TALEN-RlI原核表达载体的构建:
[0015]用核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示的引物TALE-DesRed_F:NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的引物DesRed_R扩展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的引物TALE_R2 =BamHI去扩展TALE-ccdB_Chl片段，回收PCR片段；
[0016]两个DNA片段融合，克隆到原核表达载体PET_16b的NdeI和BamHI位点，得核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示pET16b-DesRed_TALEN-Rll原核表达载体
[0017]2)EGFP-TALEN-R11 蛋白和 DesRed-TALEN-RlI 蛋白的表达与纯化
[0018]步骤I制备的pET16b-EGFP-TALEN-Rl原核表达载体与步骤2)制备的pET16b-DesRed-TALEN-Rll原核表达载体同时转化到大肠杆菌BL21中诱导，分别收集所得到的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-Rll蛋白菌体，离心获得上清液，进行Ni柱亲和层析，待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，之后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的EGFP-TALEN-R11 蛋白与 DesRed-TALEN-Rll 蛋白。
[0019]本发明还提供该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。
[0020]本发明所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法是将EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-Rll原核表达载体与细胞孵育以敲除内源性基因。
[0021]进一步的，上述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法，所述的孵化是用培养基对EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-Rll蛋白进行不同浓度稀释，再分别与C57BL/6J小鼠ES细胞在37°C孵育I小时，然后用完全培养基更换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-Rll蛋白，再分别进行37°C或者30°C的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，此过程重复两次。
[0022]与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点: [0023]本发明的穿透型EGFP-TALEN-R1和DesRed-TALEN-Rll蛋白表达系统，通过克隆针对任意基因的TALE模块到这两个载体里面，可以特异性敲除细胞内源基因，达到基因治疗的目的，以及基因敲除模式动物和在药物筛选方面的应用。【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实验例I中测序验证验证图。
【具体实施方式】
[0025]为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。
[0026]实施例1
[0027]该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端都带有穿膜肽Rll,即为碱基编码如SEQ ID N0.1所示的EGFP-TALEN-R11和碱基编码如SEQ ID N0.2所示的 DesRed-TALEN-Rll 的蛋白。
[0028]该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白的制备方法，依次包括下述方法:
[0029]I)载体的构建
[0030]a)EGFP-TALEN-Rll原核表达载体的构建:
[0031 ] 用核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的引物TALE_GFP_F:NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的引物GFP_R，扩展质粒pTALEN_v2 (从Addgene上购买质粒pTALEN_v2(Plasmid#32191))的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的引物TALE_R2 =BamHI扩展TALE-ccdB-Chl片段；两个片段融合后，克隆到原核表达载体PET-16b的NdeI和BamHI位点，得pET16b_EGFP_TALEN-Rll原核表达载体；
[0032] b) DesRed-TALEN-RlI原核表达载体的构建:
[0033]用核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示的引物TALE_DesRed_F:NdeI58和核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的引物DesRed_R扩展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的引物TALE_R2 =BamHI去扩展TALE-ccdB-Chl片段，回收PCR片段；
[0034]两个DNA片段融合，克隆到原核表达载体PET-16b的Nde I和BamHI位点，SP得pET16b-DesRed-TALEN-Rl I 原核表达载体；
[0035]2)EGFP-TALEN-R11 蛋白和 DesRed-TALEN-RlI 蛋白的表达与纯化
[0036]将带有重组质粒pET16b-EGFP-TALEN-Rl、pET16b-DesRed_TALEN-Rll 的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，经IPTG16°C过夜诱导，分别收集所得到的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-Rll蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清，进行Ni柱亲和层析。待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液(20mMTris-HCl，500mMNaCl，5% (v/v)甘油，60mM 咪唑，pH8.0)洗涤，之后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 5% (v/v)甘油，500mM咪唑，pH8.0)。利用TO-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE的检测。所得即为纯化的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-Rll 蛋白。
[0037]3、EGFP-TALEN_R11蛋白和DesRed-TALEN-Rll蛋白的细胞穿透能力检测
[0038]分别将1.5uM EGFP-TALEN-R11 蛋白与 DesRed-TALEN-Rl 蛋白与 C57BL/6J 小鼠 ES细胞细胞37°C孵育2小时之后用lmg/ml肝素溶液洗涤细胞并收集细胞样品进行RT-PCR检测EGFP和DesRecL结果说明EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-Rl蛋白具有细胞穿透性质。
[0039]该穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白的应用，所述的细胞内源性基因可以敲除细胞内源性Gpr52基因。
[0040]实验例I
[0041 ] 首先找到细胞内源性基因Gpr52的靶位点如SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的序列；然后设计结合这个靶位点的蛋白EGFP-TALEN-R1 l_Gpr52_L Gpr52和DesRed-TALEN-Rl l_Gpr52_R 表达质粒。
[0042]针对这两个靶位点的TALEs序列通过Golden gate的方法克隆到EGFP-TALEN-R11原核表达载体和DesRed-TALEN-Rll原核表达载体上。并原核表达这两个蛋白，并用Ni柱做纯化。
[0043] 用无FBS的DMEM培养基对EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-RlI蛋白进行稀释，使其终浓度分别为I μ Μ、2 μ Μ、3 μ M，再分别与C57BL/6J小鼠ES细胞在37°C孵育I小时，然后用含10% FBS的DMEM完全培养基跟换细胞培养液以去除EGFP_TALEN-Rll_Gpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-Rll-Gpr52_R蛋白，再分别进行37°C或者30°C的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，处理完毕后再进行第二轮的蛋白处理，具体为后续培养24小时的 C57BL/6J 小鼠 ES 细胞再与不同浓度(I μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ)的 EGFP_TALEN-Rll_Gpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-Rll-Gpr52_R蛋白37°C孵育I小时用含10% FBS的DMEM完全培养基跟换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-RllGpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-Rll_Gpr52_R蛋白，再分别进行37°C或者30°C的后续培养24小时。经过三轮的处理后，提取细胞的基因组。利用针对该基因SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物扩增含有打靶位点的片段，并作测序验证(见说明书附图1)，测序结果显示:缺失8个碱基(gaatgtgt)，该结果说明EGFP-TALEN-RllGpr52_L蛋白和DesRed-TALEN-Rll_Gpr52_R蛋白能够成功敲除细胞内源性基因Gpr52。
【权利要求】
1.一种穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白，其特征在于，所述的TALEN蛋白的L链和R链的N端分别带有荧光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L链和R链的C端分别带有穿膜肽 Rll,即为 EGFP-TALEN-R11 和 DesRed-TALEN-Rll 蛋白。
2.根据权利要求所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其特征在于，所述的EGFP-TALEN-R11的碱基编码如SEQ ID N0.1所示。
3.根据权利要求所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白，其特征在于，所述的DesRed-TALEN-Rll的碱基编码如SEQ ID N0.2所示。
4.权利要求1所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白的制备方法，其特征在于，依次包括下述方法: 1)载体的构建 a)EGFP-TALEN-Rll原核表达载体的构建: 用核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的引物TALE-GFP_F:NdeI58和核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示的引物GFP_R，扩展质粒pTALEN_v2的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的引物TALE_R2 =BamHI扩展TALE-ccdB_Chl片段；两个片段融合后，克隆到原核表达载体PET-16b载体的NdeI和BamHI位点，得pET16b-EGFP_TALEN-Rll原核表达载体； b)DesRed-TALEN-Rl I原核表达载体的构建: 用核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示的引物TALE-DesRed_F:NdeI58和核苷酸序列如SEQID N0.9所示的引物DesRed_R扩展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的引物TALE_R2 =BamHI去扩展TALE-ccdB_Chl片段，回收PCR片段； 两个DNA片段融合，克隆到原核表达载体PET-16b载体的NdeI和BamHI位点，得核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示pET16b-DesRed_TALEN-Rll原核表达载体 2)EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-Rll蛋白的表达与纯化 步骤I制备的pET16b-EGFP-TALEN-Rl原核表达载体与步骤2)制备的pET16b-DesRed-TALEN-Rll原核表达载体同时转化到大肠杆菌BL21中诱导，分别收集所得到的EGFP-TALEN-R11蛋白与DesRed-TALEN-Rll蛋白菌体，离心获得上清液，进行Ni柱亲和层析，待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，之后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的EGFP-TALEN-R11 蛋白与 DesRed-TALEN-Rll 蛋白。
5.权利要求1所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。
6.权利要求5所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-R11蛋白敲除细胞内源基因的方法是将EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-Rll原核表达载体与细胞孵育以敲除内源性基因。
7.根据权利要求6所述的穿膜型的带有荧光标签的TALEN-RlI蛋白敲除细胞内源基因的方法 ，其特征在于，所述的孵化是用培养基对EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-Rll蛋白进行不同浓度稀释，再分别与C57BL/6J小鼠ES细胞在37°C孵育1小时，然后用完全培养基更换细胞培养液以去除EGFP-TALEN-R11蛋白和DesRed-TALEN-Rll蛋白，再分别进行37°C或者30°C 的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，此过程重复两次。
【文档编号】C12N15/01GK104004726SQ201410269990
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】覃启红, 黄龙 申请人:覃启红, 黄龙