专利名称：用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
技术领域：
本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的检测，尤其是涉及一种用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物及其设计方法。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是牛的急性发热性呼吸道传染病。1950年首先发现于美国西部的肉牛群，后来出现于奶牛群，1956年分离出病毒，经鉴定为牛的疱疹病毒，在临床上易和牛流行热、牛流感、恶性卡他热及牛粘膜病综合症相混淆。IBR临床特征是发热、上呼吸道粘膜发炎、水肿、出血，甚至出现坏死斑点。母牛感染后发生传染性阴户阴道炎(IVP)。也可诱生出牛传染性龟头包皮炎，眼结膜炎、角膜结膜炎、流产、乳房炎等。本病病原是含有巨大双链DNA，可的牛肾单层细胞、乳兔肾马肾及Hela细胞生长，并使其病变。本病传播很快，通过空气(飞沫)接触感染，死亡率达到10%、脑炎型高达50%。IBR在世界各地均有发生，我国许多地区也有报道有IBR阳性牛的检出，一旦牛群发生此病很难根除。赤羽病病毒(Akabane disease virus)分布于澳大利亚、日本、以色列、非洲等地；以蚊、库蜢为传播媒介；主要感染牛、绵羊、山羊。怀孕母牛感染后无临床症状；胎儿通过胎盘感染后，表现为脑脊髓炎、多发性肌炎，严重者死亡、流产，耐过者发生先天性关节弯曲、积水性无脑(小脑形成大空 斑)。孕期的牛、绵羊、山羊对AKAV最易感，马、水牛、骆驼也可感染，人和猪的易感性较低。1990年，证实该病在我国存在。1998年农业部动物检疫所的李其平等第一次在上海地区分离到3株阿卡班病毒。AK给畜牧业造成了严重的经济损失，是我国动物疾病防控和国际动物贸易中的重点检疫对象。随着我国国民生活水平的不断提高及我国规模化养殖业的发展，对肉牛及奶牛的需求量正呈指数增长，急需大量优质、高产肉牛及奶牛，随之促使近年来进口种牛数量骤增。然而，感染牛病愈后、终生带毒的隐性牛及野生动物如山羊、羚羊、糜鹿、角马、水貂及雪貂都是贮藏本病病毒的场所，它们不表现临床症状，却散布病毒，是牛病长期存在，很难根除的根本原因。并且一些疾病，如牛传染性鼻气管炎等的潜伏感染的特性和目前没有有效的疫苗推广使用，除了通过禁止接种、扑杀血清阳性牛还没有更好的方法来根除此类传染病。迫切需要建立早期快速、准确的牛病诊断方法，以预防和清除该类传染病，保护我国畜牧业的健康快速发展。两种病毒的实验室诊断包括病毒分离、蛋白检测和核酸检测，而其中核酸检测以周期短、特异性强等特点而成为病毒检测的一个重点发展方向。多重PCR技术的应用，可大大减少检测成本，可大大减少工作量，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病的多重PCR势在必行。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。一个反应常有25 35个循环，一个循环包含3个步骤，首先使模板DNA双链在94 95°C变性为单链，然后在较低温度下，使引物与模板结合，接着在引物的引导及Taq酶的作用下，于72°C合成模板DNA互补链。可看作生物体外的特殊DNA复制。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂盒操作过程与一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改造，于一个PCR反应体系中加多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序列。多重 PCR 最先是在 1988 年就被 Chamberlain (Chamberlain JS.Deletion screeningof the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Research，1988，16:11141-11156)所提出，在这短短 22 个年头之内，它已经在DNA检测的多个领域得到成功的应用。具体包括检测基因突变、缺失等多态，定量PCR，反转录PCR。Henegariu在1997年设计出了多重PCR步步优化协议，指导怎样多重PCR的反应体系。但是多重PCR最大的问题还是存在于引物的设计上。和一般PCR相比较，多重PCR在同一 PCR反应管内同时扩增出多个病原的基因片段，一次完成多个模板的扩增。多重PCR的系统性主要体现在它能够根据需求一次性扩增出所有的相关基因，将大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。多重PCR检测技术在一次反应中就能同时扩增一个模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。以其快速、高效，特异性好、灵敏度高的特点，在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用；但多重PCR在提高食品微生物检测灵敏度、去除食品抑制因子的干扰，提高卫生标准及加强技术人员水平上仍有许多问题需要解决。多重PCR改进技术简化了食品微生物检测过程、缩短检测时间、降低检测成本同时提高了食品微生物检测的灵敏度；但是多重PCR的改进技术也存在一定问题。未来的研究主要集中在改进样品前处理技术、去除食品抑制因子干扰，其次是多重PCR与其它技术的整合应用，如多重PCR与变性梯度凝胶电泳、基因芯片、荧光探针定量技术、免疫磁珠吸附等技术结合应用，进一步提高食品微生 物检测的灵敏度、可重复性，实现大批量食品检测、复杂样品基质中的多种微生物的有效检测、食品微生物检测的标准化，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。PCR是一种模拟体内DNA复制过程的技术，由于具有快速、特异和敏感等特点，近年来在猪病诊断上得到广泛应用。多重PCR是一种特殊PCR形式，比单一 PCR反应更快捷、更节约，其最突出的特点，即一次PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的使用价值。多重PCR技术的应用，可大大减少检测成本，可大大减少工作量，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR势在必行。这对于早期诊断这2种疾病具有非常重要的意义，对于加强口岸检疫、控制和消灭这两种疾病和都将发挥巨大的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物及其设计方法，本发明可快速检测进出口种牛中的牛传染性鼻气管炎和赤羽病。所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物，其中，牛传染性鼻气管炎病毒引物对应的PCR扩增片段大小为311bp，赤羽病毒引物对应的PCR扩增片段大小为392bp，具体引物序列如下:IBRV Fl:-TGACGGTAGCCTGGGACTGG-3’IBRV Rl:5，-CCGGAAGGCCACGACAAA-3’AKAV Fl:5’ -AGGGTATGTGGCATTTATCA-3’AKAV Rl:5，-CCAGAAACATCTCAGCACC-3’其中，IBRV为牛传染性鼻气管炎病毒的英文缩写，AKAV为赤羽病毒的英文缩写；IBRV Fl和IBRV Rl为根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因设计的上游引物Fl和下游引物Rl ;AKAV Fl和AKAV Rl为根据赤羽病毒S基因设计的上游引物Fl和下游引物Rl0所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，包括以下步骤:步骤1，利用引物设计软件设计同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20 24个，引物组合的熔解温度Tm值为52 62 °C，引物组合的GC%为40% 60% ；步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较，选取GC含量高的判断为竞争状态优势引物，进行步骤5 ;否则判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4;步骤4，再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为:重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；步骤5，利用PCR方法对竞争状态优弓I物进行扩增。在步骤I中，所述引物设计软件为Primer Premier5.0,所述多重PCR引物组合的熔解温度Tm值为52 62°C。在步骤2中，所述对引物组合中的引物进行筛选的具体方法可为:对所用的引物进行PCR扩增，筛选扩增效果最好的引物组合；所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为20 24。在步骤5中，所述PCR方法的变性温度可为94°C，退火温度可为60°C，延伸温度可为 72C。本发明的有益效果如下:
采用本发明建立的多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的的方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点，只需一个PCR反应就可同时检测出牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒，通过应用该方法对牛鼻拭子25份、牛血清25份样品的检测，同时与常规方法检测进行比较。多重PCR方法检测出3份牛传染性鼻气管炎病毒阳性，与病毒分离鉴定结果完全吻合。本发明可大大加快牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的检测。
采用本发明多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的方法，具有简单、灵敏、快速、特异等优点，在食品卫生安全、公共卫生安全及口岸卫生检疫中都有重要意义。可应用于出入境进口牛两种病毒的快速检测，以预防和清除该类传染病，保护我国畜牧业的健康快速发展。本发明在同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病的应用中具有简单、灵敏、快速、特异的优点。
图1为多重PCR反应退火温度优化。在图1中，M:100bpADNA Marker ;1 6:53。。、55。。、57。。、59。。、61。。、63。。。图2 为多重PCR镁离子优化。在图 2 Φ,M =IOObpADNA Marker ;1 5:0.5，、1.0、
1.5、2.0、2.5 μ L0图3为多重PCR反应引物浓度优化。在图3中，M =IOObpADNA Marker ;1 9为不同引物浓度引物组合。图4多重PCR体系灵敏度试验。在图4中，M:100bp λ DNA Marker, I 6为分别为稀释质粒浓度10_2-10_7，7为阴性对照；图中392bp条带为AKAV，311bp条带为IBRV。图5多重PCR引物特异性试验。在图5中，M:100bp λ DNA Marker ;1，牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒；2，牛传染性鼻气管炎病毒；3，赤羽病毒；4，腺病毒；5，伪狂犬病病毒；6，伪牛痘病毒；7，牛病毒性腹泻病毒；8，牛水泡性口炎病毒；9，口蹄疫病毒；10，牛白血病病毒。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但附图和具体实施例不应理解为是对本发明进行的限定。所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，包括以下步骤:a)利用Primer Premier5.0引物设计软件设计同时扩增牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重引物组合。b)筛选多重引物组合中PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物。c)筛选多重引物组合中PCR检测赤羽病毒的引物。d)筛选多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的引物组合。e)多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒方法最佳反应条件的测定。在步骤a)中，所涉及的引物为参照GenBank上发表(IBRV gB为GenBankAJ004801.1，AKAV S为GenBank AB426280.1)的牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的基因序列，应用Primer Premier5.0设计的同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的特异性引物组合。在步骤b)、c)和d)中，经过筛选，得出牛传染性鼻气管炎病毒引物对应的PCR扩增片段大小为311bp，赤羽病毒引物对应的PCR扩增片段大小为392bp ;具体引物序列如下:
IBRV Fl:-TGACGGTAGCCTGGGACTGG-3’ ；IBRV Rl:5，-CCGGAAGGCCACGACAAA-3，；AKAV Fl:5’ -AGGGTATGTGGCATTTATCA-3’ ；AKAV Rl:5，-CCAGAAACATCTCAGCACC-3，。在步骤e)中，多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒方法最佳反应条件的测定，分别利用2对引物进行2种病毒多重PCR方法最佳退火温度、引物浓度、Mg2+浓度、模板浓度等的测定；多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒方法的反应体系为 25μ L，具体如下:10XPCR Buffer2.5μ L,25mmol/L MgCl2L 5 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L，20 μ mol/L的两种病毒的上下游引物混合物量依次为:牛传染性鼻气管炎病毒1.4μ L ;赤羽病毒1.4μ L ；5u/y L Taq酶0.125 μ L, ddH206.075 μ L，两种种病毒的 DNA 模板或 cDNA 模板各 5 μ L。扩增条件为 94°C 5min ；95°C 45s，59°C 45s，72°C 45s35 循环；72°C IOmin。1、病毒模板提取、反转录方法及质粒的构建构建好牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的质粒，用来作为模板进行反应条件的优化。模板的提取参照天根公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书(Cat.#DP315)进行，参照宝生物反转录试剂盒(TaKaRa Code:D2680A),使用AKAV Rl将AKAV的RNA反转录为cDNA。2、多重PCR —步法技术同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒方法的建立将牛传染性鼻气管炎病毒的质粒模板和赤羽病毒的质粒模板，进行PCR扩增。反应体系为 25 μ L，具体如下 :10XPCR Buffer2.5μ L,25mmol/L MgCl2L 5 μ L，IOmmol/L dNTP2yL，20ymol/L的两种病毒的上下游引物混合物量依次为:牛传染性鼻气管炎病毒 1.4μ L ;赤羽病毒 1.4μ L ；5u/y L Taq 酶 0.125 μ L, ddH206.075 μ L，两种种病毒的 DNA模板或 cDNA 模板各 5μ L。扩增条件为 94°C 5min ；95°C 45s, 59 °C 45s, 72 °C 45s35 循环；72°C IOmin0取PCR扩增产物7 μ L进行琼脂糖(2%)电泳检测扩增结果。3、多重PCR—步法最佳反应条件的摸索分别利用2对引物进行2种病毒多重PCR方法最佳退火温度、引物浓度、Mg2+浓度的测定。结果测得多重PCR—步法，退火温度以59°C最佳，见图1 ;多重PCR —步法镁离子浓度为在25 μ L的反应体系中，设计25mmol/L Mg2+梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5yL通过比较，最终选择1.5 μ L为最佳添加量，见图2 ；引物组合的添加量优化见表1，最终确定各引物组分浓度如下:牛传染性鼻气管炎病毒上下游引物添加量各为0.7μ L ;赤羽病毒上下游引物添加量各为0.7μ L，，见图3 ;表I多重PCR引物浓度组合
权利要求
1.用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物，其特征在于其中，牛传染性鼻气管炎病毒引物对应的PCR扩增片段大小为311bp，赤羽病毒引物对应的PCR扩增片段大小为392bp，具体引物序列如下:IBRV Fl:-TGACGGTAGCCTGGGACTGG-3’IBRV Rl:5’ -CCGGAAGGCCACGACAAA-3’AKAV Fl:5’ -AGGGTATGTGGCATTTATCA-3’AKAV Rl:5’ -CCAGAAACATCTCAGCACC-3’ 其中，IBRV为牛传染性鼻气管炎病毒的英文缩写，AKAV为赤羽病毒的英文缩写； IBRV Fl和IBRV Rl为根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因设计的上游引物Fl和下游引物Rl ；AKAV Fl和AKAV Rl为根据赤羽病毒S基因设计的上游引物Fl和下游引物Rl0
2.用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤1，利用引物设计软件设计同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20 24个，引物组合的熔解温度Tm值为52 62 °C，引物组合的GC%为40% 60% ； 步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物； 步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的60%和碱基数进行比较，选取GC含量高的 判断为竞争状态优势引物，进行步骤5 ;否则判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4; 步骤4，再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为:重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断； 步骤5，利用PCR方法对竞争状态优引物进行扩增。
3.如权利要求2所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤I中，所述引物设计软件为Primer Premier5.0。
4.如权利要求2所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤I中，所述多重PCR引物组合的熔解温度Tm值为52 62。。。
5.如权利要求2所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述对引物组合中的引物进行筛选的具体方法为:对所用的引物进行PCR扩增，筛选扩增效果最好的引物组合。
6.如权利要求2所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为20 24。
7.如权利要求2所述用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤5中，所述PCR方法的变性温度为94°C，退火温度为60°C，延伸温度为72°C。
全文摘要
用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重PCR引物及其设计方法，涉及牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的检测。多重PCR引物中的牛传染性鼻气管炎病毒引物对应的PCR扩增片段大小为311bp，赤羽病毒引物对应的PCR扩增片段大小为392bp。1)设计多重PCR引物组合；2)对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；3)判断所保留引物的竞争优劣状态，将所保留引物的GC%和碱基数进行比较，选取GC含量高的判断为竞争状态优势引物，进行步骤5)；否则进行步骤4)；4)再次筛选竞争状态劣的引物，具体为重复步骤2)，对所保留的引物按步骤3)再次判断；5)对竞争状态优引物进行扩增。
文档编号C12Q1/68GK103160615SQ20131007188
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者孔繁德, 徐淑菲, 陈圣军, 张吉红, 唐泰山, 陈信忠, 龚艳清, 郭书林, 杨俊萍 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心