专利名称：双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立的制作方法
技术领域：
本发明属于双歧杆菌基因工程中的应用，具体是涉及一种双歧杆菌功能基因无痕敲除方法。
背景技术：
基因敲除是利用DNA同源重组原理进行的一种修饰内源基因的方式，使外源DNA与受体细胞基因组DNA上的靶基因同源序列之间发生重组，将外源载体DNA定点整合入靶基因的预定位点上，或与靶基因某一 DNA片段置换，完成对基因组DNA靶基因的精确修饰和改造，造成靶基因的结构或组成的突变，导致基因功能丧失，且经修饰和改造的基因能够随基因组DNA的复制而稳定的复制。它具有定位性强、靶基因敲除后能随基因组DNA稳定遗传的特点，克服了诱变的随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造微生物遗传物质的方法。在工业微生物菌种改良中，通过靶基因的敲除改变微生物的代谢途径和代谢流，不仅能提高发酵产品的产量和产生新的代谢产物，还能改善发酵工业发酵途径和过程的人工调控性，是21世纪最有前景的微生物菌种改良手段。Cre-loxp体系在基因打靶技术中的应用可以说给基因靶位技术带来了一场革命。Cre重组酶是来源于pi噬菌体的重组酶家族的分子量38kd的一种活性蛋白。它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如=Loxp位点，引起重组。Loxp位点是Cre重组酶作用的特异性重组位点，由34 bp组成，即:ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，两个13 bp的反向重复顺序和8 bp的间隔区域构成。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状，甚至超螺旋(被Cre重组酶解螺旋成为线形结构)。Cre重组酶通过与DNA上Loxp位点的结合，发挥其重组作用。Cre/Loxp系统短小精悍、Cre酶作用专一，且不影响基因的正常表达与调控，这一特点使其在基因打靶操作中有着举足轻重的作用，目前该系统已成功用于多种真核细胞和细菌的基因敲除。双歧杆菌能维持宿主肠道的微生态平衡，提高人体对乳糖耐受性，具有降低血脂、抗肿瘤的作用，并能合成多种维生素，促进机体免疫功能。近年来，国内含双歧杆菌活菌的制剂及食品发展迅速，双歧杆菌产品已投入市场。在国外，含双歧杆菌的食品也十分流行，特别是在日本、欧洲和北美。然而双歧杆菌作为一种革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，对其进行基因操作一直是个难点，限制了双歧杆菌基因工程领域的研究进展。本发明通过双歧杆菌的转化，将打靶载体和穿梭表达载体分步导入双歧杆菌，并首次将Cre-loxp系统应用于革兰氏阳性菌双歧杆菌的基因工程中，成功地实现了双歧杆菌功能基因的无痕敲除，为研究其基因功能提供了手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种双歧杆菌功能基因无痕敲除方法；该方法首次将Cre-loxp系统应用于革兰氏阳性菌双歧杆菌的研究中，得到了双歧杆菌功能基因无痕缺失株等特点。本发明具体的技术方案如下:
一种双歧杆菌功能基因无痕缺失株的建立方法，包括以下步骤:
(1)将SEQID.N0.1通过&oR V位点和Pst I酶切连接到pUC57载体上，得到pUC57-LoxP 载体；
(2)以pER8质 粒为模板，通过引物SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3扩增，将扩增产物经过通ol和々7a I双切后与pUC57-LoXP载体连接，构建得到载体pUC-Spc ；
(3)以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5扩增，将扩增产物经过I和Spe I双切后与pUC-Spc载体连接，构建得到载体pUC-spc-serpinup800 ；
(4)以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7扩增，将扩增产物经过汝711和历it/III双切后与pUC-SpC-Serpinup■载体连接，构建得到打靶载体质粒 pUC-spc-serpinup+dOTn,即 UPD ；
(5)SEQ.1D.N0.8序列经&oRI和I双酶切连接至pDG7，构建穿梭表达载体pDG-Hup ；
(6)以含有Cre酶基因的pCr印A质粒为模板，通过引物SEQ.1D.N0.9和SEQ.1D.N0.10扩增Cre酶基因；扩增产物经过沿ol和Sal I双切后，与pDG-Hup连接，构建得到 pDG-Hup-Cre ；
(7)打靶载体的转化:在双歧杆菌原生质体中加入打靶载体质粒pUC-spc-serpinup+d_,融合转化；洗洚、复苏，复苏之后将菌液涂布在具有壮观霉素的再生培养基上培养2-3 d，得到J株；
(8)将Jserpin株制成原生质体感受态细胞,将穿梭表达载体pDG-Hup-Cre导入』serpin株，融合转化，将转化后菌落涂布在氨苄青霉素抗性的再生培养基上，筛选到不再携带壮观霉素抗性基因的双歧杆菌serpin基因无痕缺失株J serpin」spc株。步骤(7)和步骤(8)中所述的融合转化的条件为:加入到预热的含镁离子浓度为20 ±lmM/L、40±l% (v/v)PEG6000的溶液中，进行融合转化。步骤(7)中，所述双歧杆菌原生质体的制备为:将保藏的双歧杆菌转接到MRS平板上，37土1°C厌氧培养20-26 h ;从平板上挑一单菌落，接种于MRS液体培养基中，37±1°C厌氧培养20-26h ;以3±1%&八)的接种量转接于新鲜的1 液体培养基中，37±1 V厌氧培养20-26 h ;离心收集菌体，重悬；加变溶菌素至终浓度为4.5—5.5 mg/L, 36-38°C酶解25 - 35分钟；重悬于SMM溶液中，得到双歧杆菌原生质体。优选地，所述双歧杆菌为长双歧杆菌。本发明的另一目的是提供一种不携带壮观霉素抗性基因的双歧杆菌功能基因无痕缺失株。优选地，所述的双歧杆菌功能基因无痕缺失株，其是由上述的方法制备得到。
本发明的优点是:本方法分步将打靶载体和穿梭表达载体导入双歧杆菌，利用同源重组的原理，筛选获得了基因缺失株，导入穿梭表达载体后表达Cre重组酶，移除了抗性基因，从而实现了双歧杆菌功能基因的无痕敲除，利用这一方法进行基因敲除，最后得到的重组菌不携带任何抗性筛选标记，在其使用过程中可以避免抗生素的应用，为双歧杆菌的菌种改良提供了手段。
图1为打靶载体UPD的构建示意图。图2为重组载体pUC-Spc双酶切验证结果，M:1 K marker; 1: pUC-spc载体；2,3: pUC-spc载体分别用ZAo I, Apa I双酶切结果。图3 为重组载体 pUC-spc_serpinup■双酶切验证结果，M:1 K marker; I, 2:pUC-spc-serpinu_ 载体；3,4，:pUC-spc_serpinup8。。载体分别用及 oR I, 5)% I 双酶切结果。图4为打祀载体pUC-spc-serpinup+dOTn双酶切验证电泳结果，I K marker; 1:口11(:-8口(3-86印;[1115)+(1_载体分别用奴711，历it/ III双酶切结果；2: pUC-spc-serpinup+d_载体分别用Ao I, Hind III双酶切结果。图5为Cre-1oxP系统示意图。图6为重组质粒pDG-Hup-Cre结构示意图。图7为pDG-Hup酶切验证结果，pDG-HUP转化子双酶切验证1: Y Hind III 2:pDG7 双酶切 UasH I 与 I) 3: pDG-HUP 双酶切I 与 I) 4:pDG7 未酶切
5:pDG-HUP未酶切 6:pDG-HUP双酶切(汝711与&oR 1)7: pDG7双酶切(汝711与BcoR I ) 8:DL2000o
图8 为 pDG-Hup-Cre 酶切验证结果，从左至右 1:DL2000 ； 2:pDG-Hup-Cre ；3:pDG-Hup-Cre ；4: A Hind III。图9为pDG-Hup-Cre转化J serpin双歧杆菌平板结果。图10 为 PCR 验证阳性转化株图谱，1:500-15000 bp Wide range maker ；2 -.spc阳性对照；3/4.,spc引物PCR检测J serpin株；5.,spc引物PCR检测J serpin Zl spc株；
6-.serpin阳性对照7/8: serpin弓丨物PCR检测」serpin株；9 -.serpin弓丨物PCR检测Zl serpin Zl spc 株。图11为PCR验证及酶切验证pDG-Hup-Cre转化J serpin双歧杆菌电泳图谱。PCR验证电泳图谱(左)，酶切转化后双歧杆菌体内的重组质粒电泳图谱(右)。图12双歧杆菌基因组DNA电泳图，1/2:NCC2705原始株基因组；3/4:」serpin株基因组；5/6 -.Zl serpin」spc 株基因组；M:ffide range marker 500-15000 bp。图13为阳性转化子打点杂交验证图A: T-spc为探针，Al:空白，A2:Zl serpin Zl spc, A3 Zl serpin 株，A4 J serpin 株，A5 长双歧杆菌 NCC2705 基因组(阴性对照)，A6 spc+ (阳性对照),B:1serpin 为探针；B1:空白 B2:Zl serpin Zl spc 株，B3:J1SerjDi/ 株,B U1SerjDi/ 株,B5:长双歧杆菌NCC2705基因组(阳性对照)，B6: serpin—(阳性对照)。图14为Southern杂交分析图，A:以T-serpin为探针的Southern杂交图,B:以T_spc 为探针的 Southern 杂交图；Al:」serpin 取;A2 -.Zl serpin Zl spc I ;A3:NCC2705长双歧杆菌基因组；A0:阴性对照；B1 -.Zl serpin株；B2 -.Zl serpin Zl spc株；B3:长双歧杆菌NCC2705基因组；B0:阴性对照。图15启动子。
具体实施例方式实施例1:双歧杆菌打靶载体及穿梭表达载体的构建:
1.鉴于LoxP位点序列的特点，直接将两个方向相同的LoxP位点合成于pUC57载体上，序列(共108 bp)从V位点和At I位点插入，之后将从两个LoxP位点的中间和两端分别插入壮观霉素抗性基因spc和上下游的同源臂序列。此步构建载体pUC57-LoxP。合成的两个LoxP位点序列为:
5，-CGGACTAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGAACGATCGGTTGGGCCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTCC-3^ (SEQ ID.N0.1)，内切酶依次为 Spe I, Xho
I,Apa I, Bgl 11 o·
2.以 pER8 质粒为模板，设计引物 P-Spc-F:5，-CCGCTCGAGTGGTCCAGAACCTTGACCG-3’ (.Xhol )，(SEQ.1D.N0.2)
P-Spc-R:5’ -CCCGGGCCCTTATTTGCCGACTACCTTGGTG-3’ (Apa I)，，(SEQ.1D.N0.3)扩增壮观霉素抗性基因，扩增体系(40 ML:包括pER8质粒稀释模板4ML，2XTaq mix 20ML，1011] 引物对4虬，(1(11120 12ML )，PCR扩增条件为95 °C 10分钟，再经95 °C 50秒、600C 40秒、72 V I分钟的30次循环，72 °C 10分钟，PCR产物经过沿o I和如a I双切后与pUC57-LoxP载体连接，构建载体pUC-Spc。图1为打靶载体构建过程示意图，图2为pUC-Spc双酶切验证结果。3.设计引物 SerDin-UD800-F:5’ -CCGGAATTCAACCAGCACGTCAGGCC-3’ (.EcoR I),(SEQ.1D.N0.4).Serpin-up800-R:5’ -CGGACTAGTGGTTGGCCCCTTTGCTTG-3’(.Spel),(SEQ.1D.N0.5)以长双歧杆菌NCC2705的基因组作为模版，扩增上游800 bp片段，扩增体系(40 ML:包括NCC2705的基因组稀释模板4ML，2XTaq mix 20ML，IOii M引物对4ML，ddH20 12ML )，PCR 扩增条件为 95 V 10 分钟，再经 95 V 30 秒、57°C 40 秒、720C I分钟的30次循环，72°C 10分钟，PCR产物经过I和Spe I双切后与pUC-Spc连接，成功构建载体pUC-spc-serpinup8(l(l。图3为pUC-spc-serpinu_双酶切验证结果。4.设计引物 Serpin-down800-F:5’ -GGAAGATCTTACTTTCCTGGCAGTCCGTC-3’(^711) (SEQ.1D.N0.6)
Serpin-down800-R:5，-CCCAAGCTTCGTACACATACCAGGCGCG-3，(.HincI III)，(SEQ.1D.N0.7)以长双歧杆菌NCC2705的基因组作为模版，扩增serpin下游800 bp基因片段，扩增体系40 ML:包括长双歧杆菌NCC2705的基因组稀释模板4ML，2XTaq mix 20ML，1011] 引物对4虬，(1(11120 12ML，PCR 扩增条件为 95 °C 10 分钟，再经 95 °C 30 秒、56°C 40秒、72 V I分钟的30次循环，72°C 10分钟，PCR产物经过汝"/II和历双切后与pUC-spc-serpinup800 连接，成功构建载体 pUC-spc-serpinup+d()wn 即 UPD。图 4 为打祀载体pUC-spc-serpinup+d_即UPD双酶切验证电泳结果。5.以含有双歧杆菌内源性复制子的重组质粒pDG7为骨架，合成Hup基因起始密码子及其上游的200 bp (包含Hu启动子序列)，并在其序列后加上多克隆位点(MCS)，于其两端分别加上酶切位点&0RI和I，双酶切连接至pDG7，成功构建穿梭表达载体pDG-Hup。图7为pDG-Hup酶切验证结果。合成启动子序列(共283 bp)(如图15)
6.设计弓丨物 Cre-F:5，-CCGCTCGAGATGTCCAAITTACTGACCGTACACC-3’ Xhol, (SEQ.1D.N0.9)
Cre-R:5’ -CGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG-3’ Sal I, (SEQ.1D.N0.10) 以PCrepA质粒(含有Cre酶基因)为模板，扩增Cre酶基因。扩增体系40 ML:包括pCr印A质粒稀释模板4ML，2 XPfu mix 20ML，1011] 引物对4虬，ddH20 12ML，PCR扩增条件为95 V 10分钟，再经95 V 30秒、62°C 40秒、72 V I分钟的30次循环，72 °C 10分钟，PCR产物经过通oI和Sal I双切后，与pDG-Hup连接，成功构建pDG-Hup-Cre。图5为Cre-1oxP系统示意图，图6为重组质粒pDG-Hup-Cre图谱。
实施例2:长双歧杆菌原生质体的制备和转化:
1.打靶载体的转化:将长双歧杆菌NCC2705从_70°C保藏的甘油管转接到MRS平板上(MRS琼脂培养基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，Tween-80 I g，K2HPO4 2 g，CH3COONa 3H20 5 g,枸橼酸三铵 2 g, MgSO4.7H20 0.2 g, MnSO4.H2O 0.05 g，Agar 15 g,葡萄糖20 g，加蒸懼水至1000 mL,调pH 6.2- 6.4,121。(!'高压灭菌15 min。MRS肉汤培养基:成分同上不加agar)，37°C厌氧培养24 h。从平板上挑一单菌落，接种于5 mL MRS液体培养基中，37 1:厌氧培养24 h;然后以3%(V/V)的接种量转接于新鲜的25 mL MRS液体培养基中，37 1:厌氧培养24 h ;离心收集菌体，重悬；加变溶菌素至终浓度为4.5—5.5mg/L，36-38°C酶解25 — 35分钟；重悬于SMM (Hepes (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)0.02 M/L、氯化镁I mM/L、棉子糖0.5 M/L)溶液中，得到双歧杆菌原生质体。500 ML长双歧杆菌的原生质体中加入50 ML预冷的打祀载体质粒pUC-spc-serpinup+d_ (质粒DNA量〈5 Mg),加入预热的40%卜八)？￡66000溶液1.5 mL (含镁离子浓度20 mM/L)融合转化。转化后加ASMMP (液体再生培养基: SMM=3:1)溶液洗涤2遍。加入I mLSMMP复苏I h。复苏之后将菌液涂布在壮观霉素(终浓度100 Pg/mL)再生固体培养基(胰胨5.0 g，酵母提取物5.0g，半胱胺酸盐酸盐 0.4 g,葡萄糖 5.0 g, KH2PO4 2.5 g, CH3COONa 10.0 g, CaCl2 2H20 5.0g, MgCl2 6H20 5.0 g, agar 15.0 g，棉子糖 0.2 -0.3M/L，调 pH 6.5，115 °C 高压灭菌 20min)上培养2_3 d ;得到J serpin株；
2.挑取Jserpin菌落，活化至100 l^g/mL壮观霉素抗性的MRS液体培养基中。提取J1Serpi/ 株双歧杆菌基因组DNA，作为模板，设计引物serpin-F:5’ - ACC AAT CGC TGCTAA GTT CG -3’ (SEQ.1D.N0.11) , R: 5’ -GAA CCG GTG TCG ATC ATC TT-3’ (SEQ.1D.N0.12)扩增serpin基因，扩增体系(10 ML:包括转化子的基因组稀释模板lML，2XTaqmix 5ML，10 y M引物对1ML，ddH20 3乩)，PCR扩增条件为95 °C 10分钟，再经95 °C 30秒、60°C40秒、72 V I分钟的30次循环，72°C 10分钟，检测在重组前后基因信号的变化；以引物spc-F/R (SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3)扩增577c基因，扩增体系同实施例1中2步的扩增体系和反应程序，检测重组后spc基因信号。验证为阳性的』serpin株，活化至100 ^g/mL壮观霉素抗性的MRS液体培养基中。3.将J SerjDi/ 株制成原生质体感受态细胞,将穿梭表达载体pDG-Hup-Cre导入」serpin株,加入预热的40% (v/v) PEG6000溶液1.5 mL (含镁离子浓度20 mM/L)融合转化。将转化后菌落涂布在25呢/mL氨苄青霉素抗性的再生固体培养基(胰胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，半胱胺酸盐酸盐0.4 g，葡萄糖5.0 g，KH2PO4 2.5 g，CH3COONa 10.0 g，CaCl2 2H20 5.0 g，MgCl2 6H20 5.0 g，agar 15.0 g，棉子糖 0.2 -0.3M/L，调 pH 6.5,115"€高压灭菌20 min)上,得到可能的J1SerjDi/ J 5/7C株。4.挑取J serpin』spc菌落,活化至25 Mg/mL氨节青霉素抗性MRS液体培养基中。提取J serpin株双歧杆菌基因组DNA，作为模板，以引物spc-F/R (SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3)扩增5/7C基因，扩增体系同实施例1中2步的扩增体系和反应程序，检测重组后spc基因信号。不再携带壮观霉素抗性基因的菌株为阳性J serpin」spc株。筛选得到的J serpin』spc株活化至不带抗性的MRS培养基上传代培养，进一步验证。
实施例3:双歧杆菌serpin基因缺失株的验证:
1.以 J serpin Zl spc 株基因组 DNA 为模板，以引物 serpin-F/R (SEQ.1D.N0.11 和SEQ.1D.N0.12)扩增serpin基因(扩增体系和反应程序同实施例2中步骤2)，检测在重组过程中serpin基因信号的变化；以引物SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3扩增5/7C基因，检测穿梭表达载体转化前后5/7C基因信号。图10为分步转化后的PCR验证结果，经基因缺失片段PCR扩增和1%琼脂糖凝胶电泳，显示J1Serpi/ 株能扩增出1000 bp，表明转化子基因组中含有5/7C基因'Zl serpin株未能扩增1400 bp的片段，表明打靶片段与染色体上的同源片段发生了同源重组，基因被5/7C基因置换了，构建了 s印in缺失株；然而」serpin」spc株未能扩增到serpin基因，也失去了 spc基因的信号,这说明在穿梭表达载体的帮助下，Cre重组酶将两个方向相同的LoxP位点之间的抗性基因spc片段删除了。2.认」serpin」spc株的基因组DNA为模板，以引物Cre-F/R扩增ere基因，PCR验证pDG-Hup-Cre阳性转化子(扩增体系同实施例1中6步实施步骤)，并提取重组质粒酶切验证。图9为转化 平板照片，图10为阳性转化子PCR验证图，图11为pDG-Hup-Cre转化PCR验证及酶切验证图。结果表明，穿梭表达载体pDG-Hup-Cre成功地导入了双歧杆菌。3.图12为玻璃珠法提取长双歧杆菌基因组DNA，电泳结果显示。电泳条带集中在15000 bp ,提取的基因组效果较好,可以用于进一步的打点杂交或Southern杂交检测。以壮观霉素spc地高辛标记片段T-spc为探针，serpin标记片段T-serpin为探针分别进行打点杂交验证。图13表明J株和Zl serpin」spc株对serpin基因均显现为阴性,J serpin株对spc壮观霉素基因显为阳性,而J serpin Zl spc株对spc壮观霉素基因显现为阴性，结果显示，Cre重组酶成功地将5/7C基因从双歧杆菌重组菌株的基因组上移除了。4.将筛选出来的J株和JJ 5/7C株进行Southern杂交验证。图14表明当用T-serpin探针进行杂交，阳性对照A3呈现单一条带，A1/A2均无条带，即」serpin株和J serpin Zl spc株中已无serpin基因信号；当用T_spc探针进行杂交时，BI Zl serpin株呈现单一条带，B3即双歧杆菌原始株未呈现条带，即JserjDi/ 株转化子基因组中引入了外源的壮观霉素抗性基因，B2未出现条带，说明株基因组上的5/7C抗性基因被Cre重组酶重组移除了，成功地实现了双歧杆菌的无痕敲除。
以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作 的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。序列表
<110>南昌大学
〈120〉双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立〈160〉 12
<170> PatentIn version 3.1
〈210〉 I〈211〉 108〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 I
cggactagta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatctcgaga50
acgatcggtt gggccca taa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat100
agatctcc108
〈210〉 2〈211〉 28〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 2
ccgctcgagt ggtccagaac cttgaccg28
〈210〉 3〈211〉 31〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 3
cccgggccct tatttgccga ctaccttggt g31
〈210〉 4〈211〉 26〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 权利要求
1.一种双歧杆菌功能基因无痕缺失株的建立方法，其特征是，包括以下步骤: (1)将SEQ ID.N0.1通过EcoR V位点和Pst I酶切连接到pUC57载体上，得到pUC57-LoxP 载体； (2)以pER8质粒为模板，通过引物SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3扩增壮观霉素抗性基因spc，将扩增产物经过Xho I和Apa I双切后与pUC57-LoXP载体连接，构建得到载体pUC-Spc ； (3)以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5扩增，将扩增产物经过EcoR I和Spe I双切后与pUC-Spc载体连接，构建得到载体pUC-spc-serpinup800 ；(4)以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7扩增，将扩增产物经过Bgl II和Hind III双切后与pUC-SpC-Serpinup8(l(l载体连接，构建得到打靶载体质粒 pUC-spc-serpinup+d_,即 UPD ； (5)SEQ.1D.N0.8序列经EcoR I和Sal I双酶切连接至pDG7，构建穿梭表达载体pDG-Hup ； (6)以含有Cre酶基因的pCr印A质粒为模板，通过引物SEQ.1D.N0.9和SEQ.1D.N0.10扩增Cre酶基因；扩增产物经过Xho I和Sal I双切后，与pDG_Hup连接，构建得到 pDG-Hup-Cre ； (7)打祀载体的转化:将打祀载体质粒pUC-spc-serpinup+d_加入到双歧杆菌原生质体中，融合转化；洗涤、复苏，复苏之后将菌液涂布在具有壮观霉素的再生培养基上培养2-3 d,得到 Zl serpin 株; (8)将Zl serpin株制成原生质体感受态细胞,将穿梭表达载体pDG_Hup_Cre导入^ serpin株，融合转化，将转化后菌落涂布在氨苄青霉素抗性的再生培养基上，筛选到不再携带壮观霉素抗性基因的双歧杆菌serpin基因无痕缺失株Zl serpin Zl spc株。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(7)和步骤(8)中所述的融合转化的条件为:加入到预热的含镁离子浓度为20 ±lmM/L、40±l% (v/v)PEG6000的溶液中，进行融合转化。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征是，步骤(7)中，所述双歧杆菌原生质体的制备为:将保藏的双歧杆菌转接到MRS平板上，37± I°C厌氧培养20-26 h ;从平板上挑一单菌落，接种于MRS液体培养基中，37 ±1°C厌氧培养20-26h ;以3±1% (v/v)的接种量转接于新鲜的MRS液体培养基中，37± I 1:厌氧培养20-26 h ;离心收集菌体，重悬；加变溶菌素至终浓度为4.5—5.5 mg/L，36-38°C酶解25 — 35分钟；重悬于SMM溶液中，得到双歧杆菌原生质体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的建立方法，其特征是，所述双歧杆菌为长双歧杆菌。
5.一种不携带壮观霉素抗性基因的双歧杆菌功能基因无痕缺失株。
6.根据权利要求5所述的所述双歧杆菌功能基因无痕缺失株，其是由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。
全文摘要
一种双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立，该建立方法包括构建serpin基因自杀型打靶载体UPD；以pDG7为骨架，装载上双歧杆菌的启动子，构建双歧杆菌-大肠杆菌的穿梭表达载体pDG-Hup；在pDG-Hup基础上构建Cre酶基因的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pDG-hup-cre；将打靶载体转化入双歧杆菌，通过同源重组得到双歧杆菌serpin基因缺失株；利用位点特异性重组酶体系Cre-loxp系统，将双歧杆菌基因组中引入的壮观霉素spc基因移除，实现了双歧杆菌抗性基因的无痕敲除。本发明利用同源重组的原理获得双歧杆菌功能基因的缺失株，可应用于双歧杆菌功能基因的敲除，改良菌种。
文档编号C12N1/21GK103146739SQ20131007088
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者万翠香, 魏华, 夏慧玲, 许恒毅, 章昭琳 申请人:南昌大学