专利名称：一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用分子标记同时检测绵羊羊毛细度和卷曲度的方法。
背景技术：
细毛羊在我国畜牧产业中占有重要地位，细毛羊的主要产品是羊毛。细羊毛作为重要的纺织原料，有较高的经济价值。细毛羊的生产不仅关系到产区的经济发展和社会稳定，而且关系到我国毛纺行业的发展以及进出口贸易平衡。随着国内外对羊毛需求的增加，高品质细毛羊的培育已成为羊毛业生产以及绵羊育种领域中亟待解决的问题。中国美利奴羊(新疆军垦型)培育从1972年开始，先后培育出六个品系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、毛用多胎品系和U品系。截止2002年已向全国23个省、自治区推广优质羊12万只，为我国细毛羊事业的发展和改良工作做出了重大贡献。但是，如何进一步提供羊毛细度，培育超细毛种羊，以及快速扩大种群规模仍然是一个重要问题。羊毛细度是一种高遗传力的性状，遗传力达0.59。分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性别、环境的干扰，实现早期、快速、准确的选择优质细毛羊，组建并扩大优质细毛羊种群。因此，寻找羊毛细度相关基因及分子标记，应用现代分子育种新技术快速培育超细毛羊、快速扩大优质细毛羊种质规模势在必行。MTR基因编码合成甲硫氨酸合成酶，这个酶可以催化同型半胱氨酸(Hcy)合成甲硫氨酸，同时也能够使5-甲基四氢叶酸转化为四氢叶酸，因此该基因与机体内叶酸的循环代谢密切相关。人类遗传病研究表明，MTR基因突变与甲基谷氨酸G型缺失症密切相关，这是一种常染色体隐性遗传病，常引起智力低下、大细胞性贫血以及同型半胱氨酸尿症等相关疾病。然而，关于M TR基因在畜禽的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法。一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法按以下步骤进行:一、根据绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点设计一对引物MTRFl和MTRRl，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶MspI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；二、使用浓度为2% 3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准:①电泳呈现两条带，大小为269bp和209bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点未突变时，PCR扩增产物可以被MspI酶完全切开，将其命名为GG基因型；②电泳呈现一条带，大小为478bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点突变时，PCR扩增产物不能被MspI酶切，将其命名为AA基因型；③电泳呈现三条带，大小为478bp、269bp和209bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被MspI酶完全切开，将其命名为GA基因型；三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型:Y =μ+G+L+A+GXL+GXA+LXA+e，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应,GXL为基因型和品系的互作效应,GXA为基因型和年龄的互作效应，LXA为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应，然后利用JMP4.0统计软件将基因型与连续性性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点G/A单碱基突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛细度和卷曲度的显著相关，P值分别为0.0002和0.0351 ;再进行多重比较，3种基因型中具有AA、GA基因型群体的羊毛细度显著低于GG基因型群体；具有AA基因型群体的羊毛卷曲度显著高于GG基因型群体；四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而实现同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记辅助育种，即完成同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法；其中步骤一中MTRFl 的核苷酸序列为:5' -TGGAGAACCAAACACTGTCCTGAGA-3 '；MTRRl 的核苷酸序列为:5' -CTTACACCTTATCGTGAACACCTATGC-3'；步骤二中MspI酶所识别的碱基序列为CCGG ；步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点:①、711只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、超细毛品系173只、毛用多胎品系135只、A品系146只、B品系100只、U品系32只、肉用多胎品系125只、均为母羊、年龄为I 12岁。本发明采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离的方法检测绵羊MTR基因内含子区一个位点的单点突变。由于G9542341A位点能够被内切酶MspI所识别，针对该位点设计的引物MTRF1/MTRR1可以方便的扩增出包含该位点的DNA片段，使用2% _3%琼脂糖凝胶电泳可以很容易地对三种基因型进行判定。本发明通过对MTR基因G9542341A位点的不同基因型进行检测，该位点位于MTR基因第27内含子区，采用MTRFl和MTRRl表示的引物对G9542341A位点附近的序列进行扩
士豳
>曰ο本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的标记基因型对绵羊羊毛细度和卷曲度进行选择时，将使绵羊羊毛的细度和卷曲度取得很大的遗传进展。羊毛细度和卷曲度都是重要的品质性状和经济性状，同时卷曲度与细度呈负相关，毛卷曲度越大(多)，毛越细(直径越小)，毛柔软度越好，纺织性能越高，两种性状都对羊毛价格起到决定作用。利用本发明可以对羊毛细度和卷曲度两个性状同时进行选择，不仅为绵羊羊毛的品质性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，也为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法。本发明可以有效的应用于超细毛绵羊的分子辅助育种领域，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速绵羊的育种进程。
图1为实施例中酶切产物进行电泳分离的电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一:本实施方式一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法按以下步骤进行:一、根据绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点设计一对引物MTRFl和MTRRl，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶MspI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；二、使用浓度为2% 3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准:①电泳呈现两条带，大小为269bp和209bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点未突变时，PCR扩增产物可以被MspI酶完全切开，将其命名为GG基因型；②电泳呈现一条带，大小为478bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点突变时，PCR扩增产物不能被MspI酶切，将其命名为AA基因型；③电泳呈现三条带，大小为478bp、269bp和209bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被MspI酶完全切开，将其命名为GA基因型；三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型:Y =μ+G+L+A+GXL+GXA+LXA+e，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应,GXL为基因型和品系的互作效应,GXA为基因型和年龄的互作效应，LXA为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应，然后利用JMP4.0统计软件将基因型与连续性性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点G/A单碱基突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛细度和卷曲度的显著相关，P值分别0.0002和0.0351 ;再进行多重比较，3种基因型中具有AA、GA基因型群体的羊毛细度显著低于GG基因型群体；具有AA基因型群体的羊毛卷曲度显著高于GG基因型群体；四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而实现同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记辅助育种，即完成同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法；其中步骤一中MTRFI 的核苷酸序列为:5 ' -TGGAGAACCAAACACTGTCCTGAGA-3 '；MTRRl 的核苷酸序列为:5' -CTTACACCTTATCGTGAACACCTATGC-3'；步骤二中MspI酶所识别的碱基序列为CCGG ；
步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点:①、711只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、超细毛品系173只、毛用多胎品系135只、A品系146只、B品系100只、U品系32只、肉用多胎品系125只、均为母羊、年龄为1 12岁。本实施方式中羊毛细度是指羊毛的平均纤维直径，卷曲度是指沿羊毛长度方向上每厘米的卷曲程度。本实施方式中PCR扩增产物中的绵羊基因组序列如SEQ ID N0.3所示。本实施方式中涉及引物合成由上海英骏生物有限公司完成。
本实施方式在具体操作中涉及使用的试剂盒均按说明书操作。
具体实施方式
二:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中PCR扩增的反应体系为10 μ L反应体系，由下列成分组成:
权利要求
1.一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法，其特征在于它按以下步骤进行: 一、根据绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点设计一对引物MTRFl和MTRR1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶MspI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物； 二、使用浓度为2% 3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准:①电泳呈现两条带，大小为269bp和209bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点未突变时，PCR扩增产物可以被MspI酶完全切开，将其命名为GG基因型；②电泳呈现一条带，大小为478bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点突变时，PCR扩增产物不能被MspI酶切，将其命名为AA基因型；③电泳呈现三条带，大小为478bp、269bp和209bp，则绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被MspI酶完全切开，将其命名为GA基因型； 三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型:Y=μ+G+L+A+GXL+GXA+LXA+e，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应,GXL为基因型和品系的互作效应,GXA为基因型和年龄的互作效应，LXA为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应，然后利用JMP4.0统计软件将基因型与连续性性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊MTR基因第27内含子区G9542341A位点G/A单碱基突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛细度和卷曲度性状显著相关，P值分别为0.0002和0.0351 ;再进行多重比较，3种基因型中具有AA、GA基因型群体的羊毛细度显著低于GG基因型群体；具有AA基因型群体的羊毛卷曲度显著高于GG基因型群体； 四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而实现同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记辅助育种，即完成同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法；其中步骤一中 MTRFl 的核苷酸序列为:5' -TGGAGAACCAAACACTGTCCTGAGA-3' ；MTRR1的核苷酸序列为:5' -CTTACACCTTATCGTGAACACCTATGC-3'； 步骤二中MspI酶所识别的碱基序列为CCGG ； 步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点:①、711只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、超细毛品系173只、毛用多胎品系135只、A品系146只、B品系100只、U品系32只、肉用多胎品系125只、均为母羊、年龄为I 12岁。
2.根据权利要求1所述的一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为10 μ L反应体系，由下列成分组成:成分用量 50ng4U绵羊基因组DNAΙΟμΜ 引物 MTRFl0.2μLΙΟμΜ 引物 MTRRl0.2pLIO X扩增缓冲液Ιμ ·2.5inM dNTP Mixture0.8μ!^5U/μL Easy-TaqΟ. μ 去离子水6.7.liL PCR扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，65°C退火25s，72°C延伸30s，共33个循环，再72°C延伸7min,4°C保温。
3.根据权利要求1所述的一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法，其特征在于步骤一中酶切的体系如下:成分用量IOxT Buffer 缓冲液Ιμ ·0.1%BSAΙμ PCR产物3μ1 内切酶ΜψΙ0,5μ1去离子水4.5μ1 酶切条件为:37°C酶切l_2h或过夜。
全文摘要
一种能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度的分子标记方法，它涉及分子标记方法。方法一、设计引物对提取绵羊基因组DNA进行扩增，然后酶切，得酶切产物；二、酶切产物电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定；三、进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，结果为3种基因型中具有AA、GA基因型群体的羊毛细度显著低于GG基因型群体；具有AA基因型群体的羊毛卷曲度显著高于GG基因型个体；四、将实验群体分为三种类型，即完成。本发明能同时预示和鉴定绵羊羊毛细度和卷曲度，为绵羊羊毛的品质性状改良、标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，可有效的应用于超细毛绵羊的分子辅助育种领域。
文档编号C12Q1/68GK103146830SQ201310078378
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者王宁, 荣恩光, 于磊, 杨华, 李辉, 王守志, 王志鹏 申请人:东北农业大学