专利名称：一种启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子及其应用。
背景技术：
当今毛纺织品朝着轻薄、柔软的高档次方向发展，使得毛纺织工业对细毛羊的综合品质要求越来越高。近20多年来，澳洲羊毛细度发生了很大变化，目前有1/3以上的羊毛属于超细羊毛，且这一趋势还在继续发展中。为适应市场需求，我国从20世纪80年代开始对中国美利奴超细毛羊进行选育。但至今我国培育的超细毛羊毛细度尚达不到国际标准，且在产量上尚不能批次生产，供求缺口很大。在培育转基因超细毛美利奴绵羊的研究中，急需获得皮肤毛囊组织特异性表达启动子指导目标基因表达，从而分析和评价不同目标基因对毛囊生长发育的调控机制。此基础研究工作，为培育优良超细毛美利奴绵羊品种、增加羊毛产量、改善羊毛品质提供了科学依据。HGTP (高甘氨酸-酪氨酸蛋白)，属于KAP (角蛋白相关蛋白)家族的重要成员之一，相对富含甘氨酸-酪氨酸(35% 60%)。根据氨基酸残基和溶解性分为I型(KAP7和KAP8，氨基酸含量为50%)和II型(KAP6亚家族，氨基酸含量77%)。KAP6.1基因属于KAP6亚家族中的一员。HGTP在毛囊的表达具有严格的时空表达特异性，但是在不同物种间存在差异。美利奴绵羊毛囊组织的原位杂交实验表明，绵羊KAP6基因表达仅限于毛囊球增殖区域上部约200 μ m处，该层为正在分化的毛干角质化细胞，且发现KAP6.1基因仅在毛囊正皮质区表达，KAP6.1基因表达的这种高度特异性和不对称性说明其在毛囊正副皮质细胞中的比例和分布对羊毛的弯曲有重要作用。通过对美利奴羊突变个体研究表明，突变后羊毛纤维变粗、弯曲减少，KAP6.1基因、KAP7基因和KAP8基因表达严重下调，且在突变体毛囊细胞中只有副皮质细胞，这说明KAP6.1和KAP 8直接影响了羊毛的细度和弯曲。KAP6.1基因表达的时空特异性是由其5’侧翼区的基序调控的，关于该基因的序列报道，包括编码区和5’侧翼区1042bp的序列，如序列表的序列I自5’末端第488至1529位核苷酸所示。
发明内容
本发明的目的是提供一种启动子及其应用。本发明提供的启动子，获自敖汉细毛羊，为如下I)或2)或3)所述的DNA分子:I)序列表的序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。所述严格条件为在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。含有所述启动子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组质粒，具体可为将所述启动子导入pGL3-Basic载体得到的重组质粒。本发明还保护所述DNA分子作为启动子的应用。本发明还保护所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用。用所述DNA分子启动目的基因表达的实现方法具体可为:将自上游至下游依次包括所述DNA分子和所述目的基因的表达盒导入表达载体，得到重组表达载体，然后将所述重组表达载体导入宿主细胞并培养宿主细胞。所述目的基因可为促进羊毛生长、改善羊毛品质的相关功能基因。所述目的基因可为编码萤火虫荧光素酶的基因。所述重组表达载体可为将所述启动子导入pGL3-Basic载体得到的重组质粒。所述宿主细胞可为绵羊皮肤组织原代细胞。本发明公开了一种启动子，与现有启动子相比具有更高的启动目的基因表达的活性，可以满足目的基因在绵羊皮肤组织中的表达要求，满足目的基因在毛囊组织中高效特异性表达的要求。本发明不仅能用于毛发细度、弯曲和毛囊发育中基因表达调控机制的研究，而且对转基因超细毛美利奴绵羊的培育也起到了促进作用。
图1为重组质粒甲构建过程中的琼脂糖凝胶电泳图。图2为重组质粒乙构建过程中的琼脂糖凝胶电泳图。图3为各组处理后，细胞的萤火虫荧光素酶的相对活性结果。
具体实施例方式以下的实施例便·于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。敖汉细毛羊:购买自内蒙赤峰市敖汉旗种羊场。pRL-TK质粒(该质粒具有编码海肾突光素酶的基因):购买自promoga公司(产品目录号:E2241)。pGL3_Basic载体(该质粒具有编码萤火虫突光素酶的基因):购买自promoga公司(产品目录号:E1751)。promegaDual-Glo Luciferase Assay System:购买自 Promega 公司(产品目录号:E1910)。实施例1、启动子的发现在KAP6.1基因及其已知启动子序列的基础上，发现将已知启动子序列向5’侧翼区延长481bp得到的新启动子具有更高的启动目的基因表达的活性。将序列表的序列I自5’末端第488至1529位核苷酸所示的启动子命名为启动子甲(已知启动子)。将序列表的序列I自5’末端第7至1529位核苷酸所示的启动子命名为启动子乙(本发明提供的启动子)。实施例2、启动子的功能验证Fl:5，-ctagctagcCTGCAGTTCATGGGGTCAC-3’ ；F2:5’ -ctagctagcTCCGTTTTACTAAGAAGCATTTT-3’ ；R: 5 ’ -ccgctcgagGGTGTTGCTTGTTGAGGTTG-3，。
一、重组质粒甲的构建1、提取敖汉细毛羊的基因组DNA。2、以步骤I提取的基因组DNA为模板，用Fl和R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(M为2kb marker, 1、2、3为PCR扩增产物)。PCR 反应条件:95°C，5min ;95°C 30s、60°C 30s、72°C 1.5min，35 个循环；72°C延伸7min。3、用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切pGL3_Basic载体，回收约4805bp的载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下:在pGL3_Basic载体的NheI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列I自5’末端第488至1529位核苷酸所示的双链DNA分子。二、重组质粒乙的构建1、提取敖汉细毛羊的基因组DNA。2、以步骤I提取的基因组DNA为模板，用F2和R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂 糖凝胶电泳图见图2(M为2kb marker, 1、2、3为PCR扩增产物)。3、用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切pGL3_Basic载体，回收约4805bp的载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下:在pGL3_Basic载体的NheI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列I自5’末端第7至1529位核苷酸所示的双链DNA分子。三、启动子的功能验证用于培养绵羊皮肤组织原代细胞的培养基为含20% (体积比)胎牛血清(购买自invitrogen公司，货号为:16000-044)、lg/100mL非必须氨基酸(购买自invitrogen公司，目录号:11140-050)、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基(购买自invitrogen公司，目录号:C11995)。绵羊皮肤组织原代细胞的培养条件:5%C02，37°C恒温培养，I 2d传代一次。1、取50日龄的敖汉细毛羊胎羊的皮肤组织，贴壁法培养获得绵羊皮肤组织原代细胞。2、将绵羊皮肤组织原代细胞铺入6孔细胞培养板中，5 X IO5个细胞/孔，贴壁培养24h后(细胞汇合度达到80%或90%)进行转染，转染采用Invitrogen Lipofectamine2000脂质体进行并按说明书进行操作(每孔细胞中加入10 μ I Lipofectamine2000),分组处理如下:第一组:每孔共转染4 μ g重组质粒甲和0.08 μ g pRL-TK质粒；第二组:每孔共转染4 μ g重组质粒乙和0.08 μ g pRL-TK质粒；第三组:每孔共转染4 μ g pGL3-Basic载体和0.08 μ g pRL-TK质粒；
第四组:不进行任何处理。以上每组设置六个复孔。转染48小时后收集每孔中的细胞,采用promega Dual-Glo Luciferase AssaySystem并按说明书进行荧光素酶活性检测，利用TACAN F200仪器检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶与底物反应的发光值。萤火虫荧光素酶发光值与海肾荧光素酶发光值的比值为萤火虫荧光素酶的相对活性。各组处理后，细胞的萤火虫荧光素酶的相对活性结果见图3。结果表明:第三组处理后的细胞和第四组处理后的细胞均没有检测到萤火虫荧光素酶发光；第一组处理后的细胞和第二组处理后的细胞均能检测到萤火虫荧光素酶发光，且第二组处理后的细胞的萤火虫荧光素酶发光强度高于第一组处理后的细胞，即启动子乙启动下游基因表达的能力高于启动子甲。`
权利要求
1.一种DNA分子，为如下I)或2)或3):1)序列表的序列I所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
3.权利要求1所述DNA分子作为启动子的应用。
4.权利要求1所 述DNA分子在启动目的基因表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种启动子及其应用。本发明提供的启动子，获自敖汉细毛羊，为如下1)或2)或3)所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明公开了一种启动子，与现有启动子相比具有更高的启动目的基因表达的活性，可以满足目的基因在绵羊皮肤组织中的表达要求，满足目的基因在毛囊组织中高效特异性表达的要求。本发明不仅能用于毛发细度、弯曲和毛囊发育中基因表达调控机制的研究，而且对转基因超细毛美利奴绵羊的培育也起到了促进作用。
文档编号C12N1/15GK103243099SQ201310170810
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月10日 优先权日2013年5月10日
发明者邓学梅, 杨祖, 崔凯 申请人:中国农业大学