专利名称：一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定I型登革热病毒的方法。
背景技术：
登革热病毒(Dengue virus, DV)是一种黄病毒类RNA病毒，主要包括I 4型病毒(DV I 4)。登革热病毒主要通过埃及伊蚊Meofes和白纹伊蚊Meofesalbopictus)传播，登革热病毒的感染可以引起登革热(dengue fever, DF),严重的还可导致登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合征(Dengueshocksyndrome, DSS)等。DV广泛流行于全球的热带和亚热带地区,我国主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等省(自治区)。自1978年广东省佛山市暴发登革热以来，我国南方部分省区该病流行不断，200 6年广东省又发生了 DVl的流行，寻找一个合适的DVl鉴定方法可以为临床治疗提供很好的基础。目前登革热病毒的鉴定方法主要为PCR，ELISA、免疫胶体金等方法。登革热检测常用的ELISA、免疫胶体金方法耗时长，通常需要5 7 d血清中才能达到抗体能够检测水平，同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应，出现假阳性率较高，故血清学检测作为登革热病毒检测局限性较大；DV的分离可以很好的鉴定登革热病毒，但同样耗时长，敏感度又很低，也不可以作为早期检测登革热病毒的手段。近10多年发展起来的DV核酸检测技术，为登革热的早期诊断提供了可能，但PCR以及RT-PCR都需要昂贵的PCR仪作为基础，也在一定程度上限制了 PCR方法在鉴定登革热病毒上的发展。以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、灵敏度低、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定I型登革热病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于快速I型登革热病毒的特异性引物，及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定I型登革热病毒的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下:
用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组，其特征在于，包括:
内引物 1:5，_ CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG -3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3，(SEQ ID N0.3)；
外引物 2:5’-CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’ (SEQ ID N0.4)。
环引物1:5，- CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ (SEQ ID N0.5)
环引物 2:5，- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ (SEQ ID N0.6)
一种用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其含有上述的RT-LAMP特异性引物组。优选的，所述用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分:
(1)上述RT-LAMP特异性引物组；(2)逆转录酶；(3) DNA聚合酶；(4) RT-LAMP反应液；(5)显色剂；(6)阳性对照和阴性对照。所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6 8:1:3 4。所述逆转录酶为逆转录酶；所述DNA聚合酶为DNA聚合酶。所述RT-LAMP 反应液含有:10mM dNTPUO X ThermoPol 反应缓冲液、150mM MgSO4,5mM甜菜喊，四者的体积比为6 8:4 5:2 3:8 10。所述显示剂为SYBR GREEN I。所述阳性对照为含有I型登革热病毒NSl基因片段(SEQ ID N0.7)的质粒，阴性对照为DEPC水。一种快速鉴定登革热病毒I型的方法，具体包括如下步骤:
(1)提取模板RNA；
(2)环介导等温基因扩增反应:25μ I反应体系含有:内引物1、2各7 9pmol/^L，夕卜引物1、2各I 2 pmol/^L，环引物1、2各3 5 pmol/^L，反应液12 13μ ，DNA聚合酶7 9U，待检RNA f lOOng，逆转录酶I 2U，用灭菌去离子水补齐到25μ ，然后加入18 22μ 的密封液，将上述反应管于6(T65°C反应6(T90min ；
(3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ 显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热I型病毒，橙色则为非登革热I型病毒。优选的，环介导等温基因扩增反应的25 μ I反应体系含有:内引物1、2各Spmol/KL，外引物1、2各I pmol/^L，环引物1、2各4 pmol/^L，反应液12.5μ ，DNA聚合酶8U，待检RNA l 100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μ 。本发明的有益效果在于:本发明针对I型登革热病毒NSl区域特异性设计了 6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性。本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别I型登革热病毒，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。
图1为本发明RT-LAMP试剂盒的阴性与阳性对照品的检测结果(一:阴性对照，+:阳性对照);
图2为本发明对登革热1型病毒以及对非登革热1型病毒的扩增结果(一:阴性样品，+:阳性样品，1:非1型登革热病毒样本，2:1型登革热病毒样品)；
图 3 为实施例 3 的特异性验证结果(1:DEPC，2:HSV，3:EBV，4:JEV，5:YFV，6:DENV1，7:DENV2,8:DENV3,9:DENV4)；
图4为实施例4的灵敏度实验结果(a:普通PCR扩增结果，b: Real-time PCR扩增结果，c:本发明RT-LAMP扩增的电泳结果，d:本发明RT-LAMP扩增的Real-time结果，e:本发明RT-LAMP扩增的显色结果:1:DEPC，2 7:含有登革热病毒NSl基因1.0,1.0XlO1,1.0X102、1.0X103、1.0X104、1.0XlO5 拷贝 /μ L0)
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒的建立
用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分:(I)特异性引物组；
(2)逆转录酶;(3) DNA聚合酶；(4) RT-LAMP反应液；(5)显色剂；(6)阳性对照和阴性对照。(1)特异性引物的设计:
根据I型登革热病毒(GenBank登录号为:EU848545.1) NSl区域的的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下:
内引物 1:5，_ CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2: CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5 ’ - TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3，(SEQ ID N0.3)
外引物 2:5’ -CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’ (SEQ ID N0.4)
环引物 1:5’ - CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ (SEQ ID N0.5)
环引物 2:5，- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ (SEQ ID N0.6)；
(2)逆转录酶为逆转录酶；
(3)0嫩聚合酶为^^DNA聚合酶；
(4)RT-LAMP反应液含有:10mM dNTP、10 X ThermoPol 反应缓冲液、150mM MgSO4,5mM 甜菜碱，四者的体积比为8:5:3:10。(5)显示剂为 SYBR GREEN I。(6)阳性对照为含有I型登革热病毒NSl基因片段(SEQ ID N0.7)的PET_32a质粒，其制备方法为:以I型登革热病毒(GenBank登录号为:EU848545.1)为模板，用引物对F: AGAGGTGATGAGATCCAGATGCSEQ ID N0.8),R:TGCMGTCCATCCCCCAGCTCCTCCCSEQ ID N0.9)进行PCR扩增，得到433bp的扩增产物，经测序即为NSl基因片段(SEQ ID N0.7)，回收该扩增片段，利用常规方法连接到PET-32a质粒中。阴性对照为DEPC水。阳性对照和阴性对照的扩增结果见图1.实施例2利用实施例1的试剂盒快速鉴定I型登革热病毒
步骤如下:
(1)提取模板RNA:采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA ；
(2)环介导等温基因扩增反应:25μI反应体系含有:内引物1、2各8pmol/^L，外引物1、2 各 I pmol/^L，环引物 1、2 各 4 pmol/^L，RT-LAMP 反应液 12.5μ ，DNA 聚合酶 8U，待检RNA Γ 00ηδ,逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μ ，然后加入20μ 的密封液，将上述反应管于63 65°C反应6(T90min ；
(3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ 显色剂IXSYBRGreen I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热I型病毒，橙色则为非登革热I型病毒(如图2)。实施例3特异性实验利用实施例2的方法分别对2种孢疹病毒(HSV、EBV)、乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)U型登革热病毒(DENV1)、2型登革热病毒(DENV2)、3型登革热病毒(DENV3)、4型登革热病毒(DENV4)进行检测，DEPC水为阴性对照。检测结果见图3。仅I型登革热病毒管为绿色，其余管为橙色。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将I型登革热病毒和2、3、4型登革热病毒以及其他非相关病毒区分开来(图3)。实施例4常规PCR、Real-time PCR检测方法与本发明检测灵敏度的比较
取构建好的含有I型登革热病毒NSl基因片段(SEQ ID N0.7)的PET_32a质粒，测定其浓度并计算NSl基因的拷贝数，按照10浓度梯度稀释，选取1.0X 10° 1.0X IO5拷贝/μ L进行实验。分别用本发明的鉴定方法和常规PCR方法以及Real-time PCR方法进行鉴定。1、本发明的LAMP-PCR检测方法
采用实施例2的方法分别对各个浓度的样品进行检测，实验结果见图4-c、d、e:
1.0X 105、1.0X 104、1.0X 103、1.0X 102、1.0X 101 拷贝/μ I 的PCR管均为绿色，表示有扩增反应；I个拷贝以及阴性对照的的PCR管为橙色，表明无扩增反应。LAMP通过显色、电泳、荧光曲线等3种方法显示了实验结果，均出现一致的结果。2、常规PCR检测
(I)PCR 引物:
F: AGAGGTGATGAGATCCAGATG (SEQ ID N0.8)；
R:TGCAAGTCCATCCCCCAGCTCCTCC (SEQ ID N0.9)。(2) PCR反应:PCR反应体系为25μ 体系，10XPCR Buffer (PCR反应缓冲液，Promega公司)2.5μ , IOmM dNTPs (Promega公司)0.5μ ，上、下游引物分别为实验室内部保存引物，各1ML, Taq酶(5U/PL , Promega公司)0.5μ ,模板DNA 2μ ,用灭菌去离子水补至25μ 。反应程序为95°C预变性5min，95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，72°C延伸7min。PCR产物取ΙΟμ 与2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压下30min，通过凝胶成像分析仪观察结果，预期目的条带为385bp。常规PCR方法的灵敏度为1.0X 101、I个拷贝/ μ I的显示为阴性，即无扩增。实验结果见图4-a。3、Real-time PCR 检测(I) Real-time PCR 引物:
F: AGAGGTGATGAGATCCAGATG (SEQ ID N0.8)；
R:TGCAAGTCCATCCCCCAGCTCCTCC (SEQ ID N0.9)。(2) Real-time PCR 反应:反应体系为 ΙΟμ 体系，2X SYBR Green II buffer5μ I,上下游引物为实验室内部保存引物,各0.4μ ，模板DNA μ ，用灭菌去离子水补至25μ 。反应程序为95°C预变性5min，95°C变性30s，55°C退火20s，72°C延伸20s，72°C延伸7min。通过荧光曲线判断实验结果。实验结果见图4-b。常Real-time PCR方法的灵敏度为1.0XlOlU个拷贝/μ I的没有出现扩增峰，即无扩增。实施例5本发明对临床登革热病毒I型患者的检验
利用实施例2的方法对多个已经确定为登革热病毒I型患者病人血样进行处理检验，处理多个病人样本，其中只有2个重复管出现了阴性，其余均为阳性，正确率可以达到97%以上。
权利要求
1.用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组，其特征在于，包括:内引物 1:5，_ CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG -3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3，(SEQ ID N0.3)；外引物 2:5’-CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’ (SEQ ID N0.4)。
2.环引物1:5，- CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ (SEQ ID N0.5)环引物 2:5，- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ (SEQ ID N0.6) 一种用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述 的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括以下成分:(I)权利要求1所述的引物组；(2)逆转录酶；(3) DNA聚合酶；(4)RT-LAMP反应液；(5)显色剂；(6)阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6 8:1:3 4。
5.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为逆转录酶；所述DNA聚合酶为DNA聚合酶。
6.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述 RT-LAMP 反应液含有:10mM dNTP、10 X ThermoPol 反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM 甜菜喊，四者的体积比为6 8:4 5:2 3:8 10。
7.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述显示剂为SYBR GREEN I。
8.根据权利要求3所述的用于快速鉴定I型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有I型登革热病毒NSl基因片段(SEQ ID N0.7)的质粒，阴性对照为DEPC 水。
9.一种快速鉴定登革热病毒I型的方法，其特征在于，采用权利要求2 8所述的试剂盒，加入模板RNA，在60 65°C，等温扩增60 90分钟，具体包括如下步骤: (1)提取模板RNA; (2)环介导等温基因扩增反应:25μI反应体系含有:内引物1、2各7 9pmol/^L，夕卜引物1、2各I 2 pmol/^L，环引物1、2各3 5 pmol/^L，反应液12 13μ ，DNA聚合酶7 9U，待检RNA f lOOng，逆转录酶I 2U，用灭菌去离子水补齐到25μ ，然后加入18 22μ 的密封液，将上述反应管于6(T65°C反应6(T90min ； (3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ 显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热I型病毒，橙色则为非登革热I型病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，环介导等温基因扩增反应的25μ I反应体系含有:内引物1、2各8pmol/^L，外引物1、2各I pmol/^L，环引物1、2各4 pmol/^L，反应液12.5PL，DNA聚合酶8U，待检RNA I lOOng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μ 。
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶、对照和显色剂。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品RNA模板进行扩增，加入显色剂观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
文档编号C12Q1/70GK103173568SQ201310106020
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者黄曦, 胡胜锋, 李淼, 钟兰兰 申请人:中山大学