专利名称：表达多肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种表达多肽的方法，更进一步地，涉及一种FMRP蛋白的表达方法。
背景技术：
脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力低下综合征，其发病率仅次于唐氏综合征，呈X连锁遗传。临床表现为不同程度的智力障碍、长脸、大耳、青春期后巨大睾丸等，由于临床表现差异大，仅凭临床表型难以作出正确诊断。FXS的发病率男性为1/4000，女性为1/6000。FXS患者在智障人群中所占比例为2.6% 8.7%，给家庭和社会带来沉重的心理和经济负担，并且目前尚无有效的治疗方法，因此，国内外都非常重视FXS的筛查，以早期检出患者，针对性地对患儿进行生活技能训练。有些国家(如以色列、芬兰)已在孕妇中进行常规筛查，防止患儿出生。我国人口基数大，病人绝对数目并不少，大规模对智力低下患者进行FXS筛查，做出早期诊断可以对患者进行尽早干预，以改善生活技能和提高生活自理能力。同时，对于筛查出患者的家庭进行完善的基因型检测，可以指导优生优育，防止智力低下 人口的出生，从而提高人口素质。FXS的诊断方法有细胞遗传学检查、聚合酶链反应技术(PCR)法、Southern印迹方法等，近年还开发出了免疫细胞化学方法-快速抗体检测法检测脆性X智力低下蛋白(FMRP)水平，比其他方法能更直接反映和解释FXS患者的临床表现。该方法方法可检出由于缺失、点突变导致FMRl基因不表达的患者，其敏感性100%，特异性97.5%，适用于群体筛查。根据全突变患者细胞内FMRP缺失的特点，运用特异性抗体测定FMRP的含量，检出FXS患者，该方法比细胞遗传学方法和基因检测方法能更直接反映和解释FXS患者的临床表现。虽然该法只能区别全突变与正常者，不能检出前突变患者，但是具有快速、简便等优点，此外可用于该法检测的样本种类多，包括外周血淋巴细胞、发根毛囊细胞、羊水或绒毛标本(细胞数3 100)、脐血等，适应于大样本检测及标本邮寄传递，临床应用前景广泛。表达、纯化得到高产量、高纯度的FMRP蛋白是FMRP的快速、高通量检测方法确立重要实验材料，同时也是制备FMRP单克隆抗体及开发FXS检测试剂盒的基础，然而，尚无方法能够表达、纯化得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。因此，目前对于FMRP蛋白表达方法的研究仍有待深入。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种多肽的表达方法，获得FMRP蛋白。为了实现上述目的，本发明提供了一种表达多肽的方法。根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其特征在于，所述方法包括:利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得所述第一昆虫Sf9细胞表达所述多肽，其中所述重组杆状病毒表达毒种包含编码所述多肽的核酸分子；以及裂解所述第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得所述多肽。由此，利用根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。根据本发明的一些实施例，上述表达多肽的方法还可以具有下列附加技术特征:根据本发明的一个实施例，所述重组杆状病毒表达毒种包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列。由此，可以进一步提闻表达所需多妝的效率。根据本发明的一个实施例，利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞是通过向包含所述第一昆虫Sf9细胞悬液中加入所述重组杆状病毒表达毒种，并共同培养预定时间而完成的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。根据本发明的一个实施例，共同培养96小时后，裂解所述第一昆虫Sf9细胞。由此，可以进一步提闻表达所需多妝的效率。根据本发明的一个实施例，所述第一昆虫Sf9细胞悬液的密度为2 X IO6个细胞/ml。由此，可以进一步提闻表达所需多妝的效率。根据本发明的一个实施例，所述共同培养是在28°C下进行的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。根据本发明的一个实施例，所述共同培养是在悬浮条件下进行的。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。根据本发明的一个实施例，所述共同培养是在170rpm的转速下进行悬浮培养的。由此，可以进一步提闻表达所需多妝的效率。根据本发明的一个实施例，每15毫升2 X IO6个细胞/ml的第一昆虫Sf9细胞悬液中加入1.6ml所述重组杆状病毒表达毒种，其中，所述重组杆状病毒表达毒种是通过下列步骤获得的:利用编码所述多肽的杆状病毒质粒转染第二昆虫Sf9细胞，在转染72小时后，裂解所述第二昆虫Sf9细胞，以便获得病毒原种Pl ;在六孔板的每孔加入I X IO6个细胞/ml的第三昆虫Sf9细胞悬液2ml，孵育lh，镜下观察确定细胞贴壁，向每孔中各加入200 μ I病毒原种P1，28°C培养，感染48-72小时后，每孔收集约2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，以便获得P2病毒；在25cm2培养瓶中加入I X IO6个细胞/ml的第四昆虫Sf9细胞悬液8ml，孵育lh，再向所述25cm2培养瓶中加入80 μ I Ρ2病毒，28°C培养，感染72小时后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得P3病毒；以及在75cm2培养瓶中加入IXlO6个细胞/ml的第五昆虫Sf9细胞悬液20ml，孵育lh，再向所述75cm2培养瓶中加入300 μ I Ρ3病毒，28°C培养，感染72h后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得150ml所述重组杆状病毒表达毒种。由此，可以进一步提闻表达所需多妝的效率。根据本发明的一个实施例，所述编码所述多肽的杆状病毒质粒包含SEQ ID N0:2所示的核酸序列。由此，可以进一步提高表达所需多肽的效率。根据本发明的实施例的表达多肽的方法可以实现下列优点至少之一:1、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白，例如重组FMRP IS010的产量约为6.34mg/L,纯度大于90% ；2、根据本发明实施例的表达多肽的方法，以病毒毒种的体积代替病毒滴度进行病毒与细胞数量比值的优化，省 去了病毒滴度测定，直接进入优化环节，有利于节省实验成本、缩短实验周期；
3、根据本发明实施例的表达多肽的方法，在对蛋白表达条件进行优化时，利用Quantityone软件对Western-blotting结果进行相对定量分析，比较蛋白表达量的差异，可以有效地排除人为主观因素干扰，实现全自动定量。在定量时，首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据，能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比；4、根据本发明实施例的表达多肽的方法,采用BCA(bicinchoninic acid 二喹啉甲酸)法对经过N1-NTA纯化的得到的重组蛋白进行浓度测定，检测准确，操作更简便，还具有反应产物稳定、灵敏度高(0.5μ g BSA微量测定)、浓度测定的线性范围广(25 μ g 2500μ g/ml BSA微量测定)、蛋白间测定变异小、对去污剂有较高的耐受性等优点，特别适合于微量测定；5、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以为FMRP的快速、高通量检测方法的确立提供重要实验材料，同时也为制备FMRP单克隆抗体、开发FXS检测试剂盒奠定以及FMRP相关靶mRNA的确认及其发挥翻译调控作用机理的研究奠定了基础。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的供体载体pFastBacl图谱及多克隆位点序列。图2是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的蓝白斑筛选大肠杆菌DHlOBac阳性转座克隆的结果，图 中，A为培养20h，B为培养48h。图3是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的PCR鉴定重组bacmid的结果，图中，A 为 ISOlO-bacmid, B 为 Gus-bacmid。图4是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的Gus对照基因表达分析结果，图中，I为正常Sf9细胞对照组，2为重组Gus-bacmid转染Sf9细胞组。图5是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的贴壁及悬浮状态下感染重组杆状病毒的Sf9细胞。图6是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的Quantityone软件分析16组正交实验的Western-blotting结果。图7是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的正交助手软件分析正交实验结果的效应曲线图。图8是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的10%SDS-PAGE分析重组FMRPISOIO-His在Sf9细胞中的表达的结果，图中，M为蛋白质Marker，C为Sf9细胞对照，I 5为15ml2 X IO6个细胞/ml的Sf9细胞，其被分别感染0.5ml、I.0ml、I.5ml、2.0ml、
2.5ml重组杆状病毒。图9是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的Western-blotting检测FMRPI SO I O-Hi s的纯化产物的结果，图中，I为抗His单克隆抗体检测结果，II为抗FMRP单克隆抗体检测结果，I为清洗缓冲液，2 8分别为含100、150、200、250、500、1000和2000mM咪唑的洗脱缓冲液。图10是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的10%SDS_PAGE检测FMRPISOIO-His的纯化产物的结果，图中，M为蛋白质Marker，I为清洗缓冲液，2 8分别为含100、150、200、250、500、1000和2000mM咪唑的洗脱缓冲液。图11是根据本发明一个实施例的表达多肽的方法的BSA蛋白含量测定标准曲线。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的 ，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“厚度”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。本发明提出了一种表达多肽的方法。根据本发明的实施例，该多肽具有如下SEQID NO:1所示的氨基酸序列:MEELVVEVRGSNGAFYKAFVKDVHEDSITVAFENNWQPDRQIPFHDVRFPPPVGYNKDINESDEVEVYSRANEKEPCCWWLAKVRMIKGEFYVIEYAACDATYNEIVTIERLRSVNPNKPATKDTFHKIKLDVPEDLRQMCAKEAAHKDFKKAVGAFSVTYDPENYQLVILSINEVTSKRAHMLIDMHFRSLRTKLSLIMRNEEASKQLESSRQLASRFHEQFIVREDLMGLAIGTHGANIQQARKVPGVTAIDLDEDTCTFHIYGEDQDAVKKARSFLEFAEDVIQVPRNLVGKVIGKNGKLIQEIVDKSGVVRVRIEAENEKNVPQEEEIMPPNSLPSNNSRVGPNAPEEKKHLDIKENSTHFSQPNSTKVQRGMVPFVFVGTKDSIANATVLLDYHLNYLKELILKHQMLLKQNLTTETNSVIGH(SEQ ID NO:1)根据本发明的实施例，表达多肽方法包括:利用重组杆状病毒表达毒种感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得第一昆虫Sf9细胞能够表达多肽，其中，重组杆状病毒表达毒种包含编码多肽的核酸分子；以及裂解第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得多肽。由此，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。利用重组病毒感染昆虫细胞表达异源蛋白时，一般采用恒定的MOI值(multiplicity of infection,感染复数)感染处于对数生长期的细胞,MOI的含义是指感染时病毒与细胞数量的比值，常用的测定病毒滴度的方法有蚀斑检测法、终点稀释法、实时定量PCR、免疫染色法、流式细胞术等。蚀斑检测法重复性不好、耗时长，得到最终结果通常需要三周，终点稀释法测定病毒滴度比较准确，但也要耗时两周，而且对细胞状态的要求也较高，实时定量PCR和免疫染色法检测病毒滴度耗时短、结果稳定性好，但价格昂贵且使用的次数有限，而流式细胞术检测并计数病毒则需要配备专门的流式细胞仪。总之，对于病毒滴度的测定还是比较复杂的，本发明的发明人在研究中惊奇地发现，以病毒毒种的体积代替病毒滴度进行病毒与细胞数量比值的优化，能够省去病毒滴度测定，直接进入优化环节，具有节省实验成本和缩短实验周期的优点，此技术方案的特征和优点将在以下部分做进一步地描述。
根据本发明的实施例，重组杆状病毒表达毒种包含如下SEQ ID N0:2所示的
核酸序列:acttccggtggagggccgcc tctgagcgggcggcgggccgacggcgagcgcgggcggcgg
cggtgacggaggcgccgctgccagggggcg tgcggcagcgcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgg
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表达量最闻。根据本发明的实施例，共同培养是在28 °C下进行的。这是因为，该培养温度是培养昆虫Sf9细胞生长的最适温度。根据本发明的实施例，共同培养是在悬浮条件下进行的。这是因为，细胞悬浮培养可获得同步分裂的、增殖迅速的大量细胞，可满足大规模的工业化生产。 根据本发明的实施例，共同培养是在170rpm的转速下进行悬浮培养的。这是因为，发明人发现，在170rpm转速下，可对昆虫Sf9细胞细胞团施加一种缓和的压力，使细胞团破碎成小细胞团和单细胞，并且在培养基中保持均匀的分布，并且该转速可促进培养基和容器内空气之间的气体交换。 根据本发明的实施例，每15毫升2 X IO6个细胞/ml的第一昆虫Sf9细胞悬液中加入1.6ml所述重组杆状病毒表达毒种，其中，重组杆状病毒表达毒种是通过下列步骤获得的:利用编码多肽的杆状病毒质粒转染第二昆虫Sf9细胞，在转染72小时后，裂解第二昆虫Sf9细胞，以便获得病毒原种Pl ;在六孔板的每孔加入I X IO6个细胞/ml的第三昆虫Sf9细胞悬液2ml，孵育lh，镜下观察确定细胞贴壁，向每孔中各加入200 μ I病毒原种P1，28°C培养，感染48-72小时后，每孔收集约2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，以便获得P2病毒；在25cm2培养瓶中加入I X IO6个细胞/ml的第四昆虫Sf9细胞悬液8ml，孵育lh，再向所述25cm2培养瓶中加入80 μ 1P2病毒，28°C培养，感染72小时后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎 片收上清，以便获得P3病毒；以及在75cm2培养瓶中加入IXlO6个细胞/ml的第五昆虫Sf9细胞悬液20ml，孵育lh，再向所述75cm2培养瓶中加入300 μ 1Ρ3病毒，28°C培养，感染72h后，将含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得150ml重组杆状病毒表达毒种。根据本发明的实施例，编码多肽的杆状病毒质粒包含前面所述的SEQ ID NO:2所示的核酸序列。根据本发明的实施例的表达多肽的方法可以实现下列优点至少之一:1、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白，例如重组FMRP IS010的产量约为6.34mg/L,纯度大于90% ；2、根据本发明实施例的表达多肽的方法，以病毒毒种的体积代替病毒滴度进行病毒与细胞数量比值的优化，省去了病毒滴度测定，直接进入优化环节，有利于节省实验成本、缩短实验周期；3、根据本发明实施例的表达多肽的方法，在对蛋白表达条件进行优化时，利用Quantityone软件对Western-blotting结果进行相对定量分析，比较蛋白表达量的差异，可以有效地排除人为主观因素干扰，实现全自动定量。在定量时，首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据，能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比；4、根据本发明实施例的表达多肽的方法,采用BCA(bicinchoninic acid 二喹啉甲酸)法对经过N1-NTA纯化的得到的重组蛋白进行浓度测定，检测准确，操作更简便，还具有反应产物稳定、灵敏度高(OAyg BSA微量测定)、浓度测定的线性范围广(25yg 2500 μ g/ml BSA微量测定)、蛋白间测定变异小、对去污剂有较高的耐受性等优点，特别适合于微量测定；5、根据本发明实施例的表达多肽的方法，可以为FMRP的快速、高通量检测方法的确立提供重要实验材料，同时也为制备FMRP单克隆抗体、开发FXS检测试剂盒奠定以及FMRP相关靶mRNA的确认及其发挥翻译调控作用机理的研究奠定了基础。下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
实施例11.材料细胞株:Sf9昆虫细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。真核供体质粒:pFastBacl购自 Invitrogen。菌株:大肠杆菌T0P10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，大肠杆菌DHlOBac感受态细胞购自Invitrogen公司。弓丨物: Invitrogen公司合成,序列(5，至3’)如下所示:Middle-Forward:TTGACATGCACTTTCGGA(SEQ ID NO:3)，pUC/Ml3-Forward:CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG(SEQ ID NO:4)，pUC/Ml3-Reverse:AGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ ID NO:5)，Forward:CCGGAATTCATGGAGGAGCTGGTGGTG(SEQ ID NO:6)，ISOlO-Reverse:CGCGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGATGACCAATCACTGA(SEQ ID N0:7),其中，引物Forward的5’末端引入限制性内切酶EcoR I识别位点，标记为单划线的部分，黑体加粗标记部分为起始密码子；引物ISOlO-Reverse的5’末端引入限制性内切酶Sal I识别位点，标记为单划线的部分，黑体加粗标记部分为终止密码子，双下划线标记部分为6个His标签。2.方法2.1Sf9昆虫细胞培养2.1.1贴壁培养I)吸取单细胞层上的培养液和悬浮的细胞，弃掉。2)加入4ml的室温全培养基(含10%FBS的Grace’s培养基或者SF900 II培养基)，用吸管或移液器重悬细胞，不宜采用酶消化法。在倒置显微镜下观察细胞，确定细胞全部离壁。3)进行细胞活力计数(用trypan染色法),每个培养瓶中接种约I 2X IO6个细胞。在27.5°C 28.5°C条件下培养，盖子稍松以保证氧气的交换，或者用盖子上有透气滤膜的培养瓶。4)在2-4天后，细胞汇合度达到80% 100%时进行传代，每瓶细胞传3_4瓶。对于有些长的慢的细胞，去上清，在单层细胞的另一边轻轻加入新鲜的培养液。2.1.2悬浮培养I)当贴壁生长良好时，取2-3瓶长满细胞的75cm2培养瓶，以SF900II培养基将细胞吹成细胞悬液，若之前以含10%FBS的Grace’ s培养基进行贴壁培养，则需提前1_2代更换为SF900 II培养基，使细胞适应新的培养基。2)转入IOOml培养瓶中进行试悬浮培养，28 V、170rpm悬浮培养。悬浮培养接种密度不应小于0.5X IO6个细胞/ml，细胞密度为6.0X IO6个细胞/ml时可进行传代。3)传代时将适量细胞悬液吸出，补充新培养基即可。2.2 供体载体 FMRlISOlO-pFast 的构建2.2.1引物退火温度优化以克隆载体ISOlO-pEASY为模板，Forward、ISOlO-Reverse为引物进行PCR反应；两组引物扩增后可分在FMR1IS010的5’末端引入限制性内切酶EcoR I识别位点和起始密码子，在3’末端引入限制性内切酶Sal I识别位点、终止密码子及6个His的标签。2.2.2目的基因FMR1IS010及供体载体pFastBacl的双酶切通过琼脂糖凝胶电泳回收目的基因FMR1IS010，以限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，形成两个不同的粘性末端，以便克隆进入供体载体PFastBacl。按如下表I分别配制插入片段及供体载体的双酶切反应混合物，37°C酶切4h后琼脂糖凝胶电泳纯化回收酶切产物。表I酶切反应体系
权利要求
1.一种表达多肽的方法，所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其特征在于，所述方法包括: 利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得所述第一昆虫Sf9细胞表达所述多肽，其中，所述重组杆状病毒表达毒种包含编码所述多肽的核酸分子；以及 裂解所述第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得所述多肽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组杆状病毒表达毒种包含SEQIDNO:2所示的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞是通过向包含所述第一昆虫Sf9细胞悬液中加入所述重组杆状病毒表达毒种，并共同培养预定时间而完成的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，共同培养96小时后，裂解所述第一昆虫Sf9细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一昆虫Sf9细胞悬液的密度为2X IO6个细胞/ml。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述共同培养是在28°C下进行的。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述共同培养是在悬浮条件下进行的。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述共同培养是在170rpm的转速下进行悬浮培养的。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每15毫升2X IO6个细胞/ml的第一昆虫Sf9细胞悬液中加入1.6ml所述重组杆状病毒表达毒种， 其中，所述重组杆状病毒表达毒种是通过下列步骤获得的: 利用编码所述多肽的杆状病毒质粒转染第二昆虫Sf9细胞，在转染72小时后，裂解所述第二昆虫Sf9细胞，以便获得病毒原种Pl ； 在六孔板的每孔加入I X IO6个细胞/ml的第三昆虫Sf9细胞悬液2ml，孵育lh，镜下观察确定细胞贴壁，向每孔中各加入200 μ I所述病毒原种P1，28°C培养，感染48-72小时后，每孔收集约2ml含病毒的上清培养基，500g离心5min，弃碎片收上清，以便获得P2病毒； 在25cm2培养瓶中加入I X IO6个细胞/ml的第四昆虫Sf9细胞悬液8ml，孵育lh，再向所述25cm2培养瓶中加入80 μ I所述Ρ2病毒，28°C培养，感染72小时后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得P3病毒；以及 在75cm2培养瓶中加入I X IO6个细胞/ml的第五昆虫Sf9细胞悬液20ml，孵育lh，再向所述75cm2培养瓶中加入300 μ I所述Ρ3病毒，28°C培养，感染72h后，将所述含有病毒的培养基在500g下离心5min，弃碎片收上清，以便获得150ml所述重组杆状病毒表达毒种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述编码所述多肽的杆状病毒质粒包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种表达多肽的方法。其中，多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，表达多肽的方法包括利用重组杆状病毒表达毒种，感染第一昆虫Sf9细胞，以便使得第一昆虫Sf9细胞表达多肽，其中重组杆状病毒表达毒种包含编码多肽的核酸分子；以及裂解第一昆虫Sf9细胞，并纯化获得多肽。利用本发明的表达多肽的方法，可以有效地表达多肽，进一步可以得到高产量、高纯度的FMRP蛋白。
文档编号C12N15/866GK103215309SQ20131010516
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者郭永, 邹检平, 李芳芳, 张瑶楠 申请人:国家人口计生委科学技术研究所