专利名称：经过密码子优化的点突变丙酰辅酶a转移酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用，特别涉及一种根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化后的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用。
背景技术：
辅酶A转移酶可逆催化辅酶A转移反应，其将酯酰辅酶A的辅酶A部分转移到体系中的游离酸上。现阶段研究的辅酶A根据不同的反应机制分为三个家族，但都是辅酶A供体和游离的受体之间通过酶的转化过程。辅酶A转移酶可以催化乳酸转化为乳酰辅酶A，乳酰辅酶A是进一步生物合成聚 乳酸(PLA)和丙烯酸等重要中间产物，因此，辅酶A转移酶在工业上具有应用价值。乳酰辅酶A被发现是丙氨酸发酵通路中重要的中间产物，此通路在极少数的生物体中存在，其中包括丙酸梭菌(Clostridium propionicum),栖瘤胃拟杆菌(Bacteroidesruminicola)和同型丙酸梭菌(Clostridium homopropionicum)。丙酸辅酶A转移酶(propionyl-CoA transferase,Pct)可以催化丙酰辅酶A或者乙酰辅酶A作为辅酶A供体将D-乳酸转化为D-乳酰辅酶A。其结构是一个同源四聚体，每个亚基分子量约为67kDa，其对于D-乳酸比L-乳酸的亲和性更高。野生型的丙酰辅酶A转移酶在大肠杆菌宿主中并不能够过量表达，这就极大的限制了丙酰辅酶A转移酶的原核表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用。本发明所提供的经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因，是先在不改变丙酸辅酶A转移酶(propionyl-CoA transferase, Pct)蛋白氨基酸序列(见GenBank:AJ276553.1)的前提下，将其野生型编码基因(序列3，GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，再根据相关文献报道(Taek HoYang, Tae Wan Kim, Hye 0k Kang, Sang-Hyun Lee, Eun Jeong Lee, Sung-Chul Lim, Sun0k Oh, Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acidand its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105, 150-160.)，将对应于丙酸辅酶A转移酶蛋白氨基酸序列第193位Val的三个核苷酸改为大肠杆菌偏好(高频使用)的编码Ala的密码子，旨在减小蛋白表达过程中外源蛋白对宿主大肠杆菌的抑制作用。将优化后的该基因命名为Npct基因，具体为如下a) -c)中任一 DNA分子:a)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子；b)序列表中序列I所示的DNA分子；
c)与序列表中序列I至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。其中，序列I共由1575个核苷酸组成，整个序列为⑶S序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质(即为点突变丙酰辅酶A转移酶)。序列3也共由1575个核苷酸组成，整个序列为CDS序列，其编码的蛋白质(丙酰辅酶A转移酶)的氨基酸序列为将序列表中序列2的第193位的Ala改为Val后的序列。序列2共由524个氨基酸组成。含有所述DNA分子(Npct基因)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因(GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。在本发明中，所述重组表达载体中启动所述DNA分子(Npct基因)转录的启动子具体为T7启动子。所述重组表达载体具体为将所述DNA分子(Npct基因)插入到质粒pET22b的多克隆位点处得到的重 组质粒。在本发明的一个实施例中，所述多克隆位点为Nde I和Xho I。由所述DNA分子(Npct基因)转录所得的RNA分子也属于本发明的保护范围。所述DNA分子，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述RNA分子在辅酶A转移中的应用也属于本发明的保护范围。所述DNA分子，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述RNA分子，在存在辅酶A供体的前提下，将D-乳酸转化为D-乳酰辅酶A中的应用也属于本发明的保护范围。在上述应用，所述辅酶A供体可为丙酰辅酶A或/和乙酰辅酶A。在本发明的一个实施例中，所述辅酶A供体具体为乙酰辅酶A。所述DNA分子在提高大肠杆菌中丙酰辅酶A转移酶表达量中的应用也属于本发明的保护范围；所述丙酰辅酶A转移酶为序列表中序列2所示蛋白质。实验证明，在大肠杆菌中，本发明所提供的经过密码子优化的丙酰辅酶A转移酶基因(Npct基因)与优化前(序列3)相比，可表达更高量的丙酰辅酶A转移酶，且其酶活并未因密码子优化而受到影响。
图1为重组表达载体pET22b_Npct的酶切图谱。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道I为未经酶切的质粒对照；泳道2为使用Nde I和Xho I双酶切的重组质粒。图2为经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后的丙酰辅酶A转移酶蛋白，以及纯化后经脱盐柱脱盐后的蛋白进行SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道I为经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后的蛋白；泳道2为纯化后经脱盐柱脱盐后的蛋白。图3为纯化脱盐后的丙酰辅酶A转移酶作用乳酸和乙酰辅酶A后的HPLC检测图谱。其中，a)为对照组(不添加酶)，b)为实验组(添加酶)。图4为实验组在保留时间按略小于15min的位置上出现的产物峰(D_乳酰辅酶A)的质谱检测图。图5为优化前后丙酰辅酶A转移酶基因在大肠杆菌中蛋白表达量的测定结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道I为优化前未经IPTG诱导的组I ;泳道2为优化前经IPTG诱导的组2 ;泳道3为优化后未经IPTG诱导的组3 ;泳道4为优化后经IPTG诱导的组4。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pET22b载体:Novagen公司产品，产品目录号为69744-3。在pET22b载体的Xho I识别位点后紧连着6个His的编码基因及终止密码子。乙酰辅酶A三锂盐:Sigma-Aldrich(St Louis, MO，USA)公司产品，产品目录号为A2181。D-乳酸钠=Sigma-Aldrich (St Louis, MO，USA)公司产品，产品目录号为 71716。实施例1、点突变丙酰辅酶A转移酶基因的密码子优化及全基因合成首先，根据丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中的野生型丙酰辅酶A转移酶(propionyl-CoA transferase)基因 pet 的 CDS 全序列(GenBank:AJ276553.1 的第485-2059位，如序列表中序列3所示)，经过设计和反复验证得到适合于在大肠杆菌中表达的优化型丙酰辅酶A转移酶基因序列，即将野生型丙酰辅酶A转移酶基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子优化序列，从而提高丙酰辅酶A转移酶在大肠杆菌培养环境中的表达水平。接着，根据相关文献报道(TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye 0k Kang, Sang-HyunLee，Eun Jeong Lee, Sung-Chul Limj Sun 0k 0h，Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acid and its copolymers using evolved propionateCoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010，105，I50-160.)，将以上所得的优化型丙酰辅酶A转移酶基因序列中对应于丙酰辅酶A转移酶蛋白氨基酸序列第193位Val的三个核苷酸改为大肠杆菌偏好(高频使用)的编码Ala的密码子，旨在减小蛋白表达过程中外源蛋白对宿主大肠杆菌的抑制作用(参考文献“TaekHo Yang，Tae Wan KimjHye 0k Kang, Sang-Hyun Lee, Eun Jeong Lee, Sung-Chul Limj Sun0k 0h，Ae-Jin Song,Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acidand its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010，105，150-160.” 中有报道)。根据上述方法，最 终获得按大肠杆菌偏好设计的优化型点突变丙酰辅酶A转移酶编码基因，命名为Npct基因，其基因序列为序列表中序列1，共由1575个核苷酸组成。所述Npct基因编码的蛋白为序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白(即点突变丙酰辅酶A转移酶)，与序列3所示野生型丙酰辅酶A转移酶基因(pet基因)编码的蛋白相比，其中第193 位的 Val 突变为 Ala (V193A)。实施例2、丙酰辅酶A转移酶的原核表达一、原核重组表达载体pET22b_Npct的构建以实施例1得到的优化后的丙酰辅酶A转移酶编码基因(Npct基因，序列I)为模板，以NPCTF-PET和NPCTR-PET为引物，进行PCR扩增，将扩增产物用限制性内切酶Nde I和Xho I (TAKARA)进行双酶切，同样将pET22b载体也同样进行双酶切，二者回收后的产物用DNA纯化试剂盒(OMEGA)进行纯化，用T4连接酶(TAKARA) 16°C，过夜连接。连接后产物转入大肠杆菌DH5ci感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)中，涂板筛选。NPCTF-PET: 5，-AGACATATGCGCAAAGTTCCGATTATCA-3，(下划线部分为 Nde I 的识别位点，第7-28位为序列I的第1-22位)NPCTR-PET: 5，-AGACTCGAGGCTTTTCATTTCTTTCAGG-3，(下划线部分为 Xho I 的识别位点，其后的序列为序列I的第1554-1572位的反向互补序列)挑取阳性单克隆，摇菌，进行菌落PCR (所用引物为NPCTF-PET和NPCTR-PET)。将菌落PCR鉴定阳性的菌液提取质粒，用Nde I和Xho I进行双酶切。酶切图谱如图1所示。将经过酶切鉴定得到大小约为5313bp和1577bp两个目的条带的重组质粒送样测序。将经测序表明在pET22b载体的多克隆位点Nde I和Xho I之间插入了序列表中序列I所示的DNA片段的重组载体命名为pET22b-Npct。在重组表达载体pET22b_Npct中，启动所述Npct基因转录的启动子为T7启动子。二、丙酰辅酶A转移酶的原核表达及纯化1、丙酰辅酶A转移酶的原核诱导表达将步骤一得到的重组表达载体pET22b_Npct转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)中，37°C 160rpm培养过夜，得到种子液。将种子液以体积分数1%的接种量接入LB培养液中，诱导培养中，37°C 180rpm培养至OD6tltol在0.6左右时加入终浓度为ImM的IPTG，诱导4h，回收菌液。2、丙酰辅酶A转移酶的纯化结合液:500mM氯化钠，IOmM咪唑，20mM Tris-HCl,pH7.8。以上各浓度均为相应组
分在结合液中的终浓度。0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液:将如下A液和B液按照体积比2:3的比例混合。A液(0.1mol/L KH2PO4):称取ΚΗ2Ρ0413.6g,溶于蒸懼水中，最后补加蒸懼水至IOOOml0B 液(0.lmol/L Na2HPO4):称取 Na2HP04.12H2035.8g，加蒸馏水溶解，最后加水至IOOOml。将步骤I中回收的菌液在4V IOOOOrpm离心IOmin,弃掉上清,将菌体沉淀于超低温冰箱冷冻12小时以上，用结合液将菌体重悬，用浓度为10mg/mL溶菌酶(Amresco公司产品，产品目录号为0663)在冰上处理半小时，超声波(100W破5s停5s，共IOmin)破碎，12，OOOrpm离心,取上清，即得粗酶液。
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用His标签蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号CW0894)对所述粗酶液进行纯化，操作参照试剂盒说明书进行。纯化中所用的平衡液、洗脱液等均是His标签蛋白纯化试剂盒中自带的。接着，用GE Healthcare公司的脱盐柱将上述用His标签蛋白纯化试剂盒纯化后蛋白进行更换缓冲液，将原有含有咪唑的溶液(试剂盒自带洗脱液)换成0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液。脱盐后，进行丙酰辅酶A转移酶蛋白浓度测定，采用的是Bradford蛋白质定量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为PA102。具体操作参照产品说明书进行。将脱盐后的蛋白分装好放入超低温冰箱(_80°C)保存，用之前放在冰上溶解。将经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后的丙酰辅酶A转移酶蛋白，以及纯化后经脱盐柱脱盐后的蛋白取相同体积进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳图谱如图2所示(目的蛋白大小约为60kDa)，可见经脱盐柱后目的蛋白得到了高度浓缩。实施例3、实施例2得到的丙酰辅酶A转移酶的酶活测定一、酶催化反应的进行丙酰辅酶A转移酶(Pct)将乙酰辅酶A的辅酶A转移给乳酸生成乳酰辅酶A和乙
酸，的反应式如下:
权利要求
1.DNA分子，为如下a) -c)中任一: a)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子； b)序列表中序列I所不的DNA分子； c)与序列表中序列I至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述DNA分子转录的启动子为T7启动子。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体为将所述DNA分子插入到质粒pET22b的多克隆位点处得到的重组质粒。
6.由权利要求1所述DNA分子转录所得的RNA分子。
7.权利要求1所述的DNA分子，或权利要求2-5中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或权利要求6所述的RNA分子在辅酶A转移中的应用。
8.权利要求1所述的DNA分子，或权利要求2-5中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或权利要求6所述的RNA分子，在存在辅酶A供体的前提下，将D-乳酸转化为D-乳酰辅酶A中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述辅酶A供体为丙酰辅酶A或/和乙酰辅酶A。
10.权利要求1所述DNA分子在提高大肠杆菌中丙酰辅酶A转移酶表达量中的应用；所述丙酰辅酶A转移酶为序列表中序列2所示蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因及其应用。本发明所提供经过密码子优化的点突变丙酰辅酶A转移酶基因为如下a)-c)中任一DNA分子a)编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；b)序列表中序列1所示的DNA分子；c)与序列表中序列1至少具有98%的同一性，且编码序列2所示蛋白质的DNA分子。实验证明，在大肠杆菌中，本发明所提供的经过密码子优化的丙酰辅酶A转移酶基因与优化前相比，可表达更高量的丙酰辅酶A转移酶，且其酶活并未因密码子优化而受到任何影响。
文档编号C12P19/32GK103173472SQ20131010453
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者管祥辰, 于波, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所