专利名称：小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记MAG7237及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于作物育种学领域，涉及小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记及其应用。
背景技术：
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，提供人类大约20%的能量。在小麦生产中许多生物与非生物逆境直接影响小麦的产量与品质。赤霉病就是其中最重要的一种生物逆境，严重影响小麦的品质和产量。抗病品种的选育和应用是控制赤霉病最经济有效的方法，抗病基因的发掘是抗病育种的前提和基础，而开发与抗病基因紧密连锁的分子标记更是应用抗病基因的关键。小麦对赤霉病的抗性主要有五种类型(Mesterhazyl995),其中抗侵染(Type I)和抗扩展(Type II) (Schroeder and Christensenl963)是最主要的两种类型。Type I 抗性主要反映小麦抵抗病原菌的初侵染，是小麦抵御赤霉菌危害的第一道屏障，在抗性反应中起着至关重要的作用。许多研究表明小麦对赤霉病的抗性是典型的数量性状，受多基因控制。迄今为止已经定位了 200多个抗赤霉病QTL，其中位于4B染色体上的抗赤霉病侵染QTL存在于多个抗性种质中，表达稳定且效应较强。Lin et al (2006)利用望水白X南大2419重组自交系群体在望水白的4B染色体上检测到一个抗侵染主效QTL，可解释15%左右的表型变异，且在各次实验中LOD值都在3以上。Xue et al.(2010a)利用近等基因系证实该QTL的效应。Xue et al.(2010b)利用重组自交系群体和近等基因系群体，通过筛选和鉴定重组体的方法将4B QTL精细定位到相距1.7cM的Xhbg226 - Xgwml49区间，位于小麦缺失系4BL5-0.86 - 1.00，并将其命名为Fhb4。且有研究表明该基因为显性基因。由于小麦赤霉病抗性具有典型的数量性状特征，受多基因控制，易受环境影响，早期世代很难对其进行选择。此外，许多抗赤霉病种质的农艺性状较差，地区适应性较强，利用传统育种方法培育抗性品种费时费力可能也得不到预期的结果。分子标记辅助选择育种与传统育种相比，可以在早期世代确定目标基因型，且选择不受基因表达及环境条件的影响，能够提高选择的准确性，从而加快育种进程(Collard and Mackill2008)。虽然目前已有研究利用分子标记辅助选择技术选育了 Fhb4的近等基因系，但是所选育的Fhb4近等基因系株高偏高，这在育种中是不利的选择(Xue et al.2010a)。因此与其更紧密连锁分子标记的开发有利于减少选择时的连锁累赘，提高对Fhb4的应用效率。此外，Fhb4虽然被精细定位，但是所在区间的遗传距离还是很大，有必要开发更紧密连锁的分子标记加快该基因的克隆研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供与小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4更加紧密连锁的分子标记。本发明的另一个目的是提供该小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记，用标记引物MAG5184-F:SEQ ID N0.1,MAG5184-R:SEQ ID N0.2扩增小麦品种基因组DNA，获得的扩增片段为241bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4连锁的的分子标记MAG5184，该标记为共显性标记，与Fhb4紧密连锁，利用Mapmaker Macintosh V3.0测得该标记与Fhb4基因的遗传距离为0.72cM ；或用标记引物MAG7237-F:SEQ ID N0.3, MAG7237-R:SEQ ID N0.4 扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为688bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4连锁的分子标记MAG7237，该该标记在抗赤霉病品种望水白和感赤霉病品种绵阳99-323中用HinfI酶切消化存在多态，该标记为共显性分子标记，与Fhb4紧密连锁,利用Mapmaker Macintosh V3.0测得该标记与Fhb4基因的遗传距离为0.34cM ；或用标记引物MAG2521-F:SEQ ID N0.5, MAG2521-R:SEQ ID N0.6 扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为161bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4连锁的分子标记MAG2521，该标记为共显性分子标记，与Fhb4紧密连锁,利用Mapmaker Macintosh V3.0测得该标记与Fhb4基因的遗传距离为0.92cM。所述的分子标记在小麦种质资源中抗赤霉`病侵染基因Fhb4的鉴定中的应用。小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记方法，用上述的任意一对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG5184的引物MAG5184-F和MAG5184-R能够扩增出241bp的扩增片段，或者用分子标记MAG7237的引物MAG7237-F和MAG7237-R扩增出688bp的扩增片段，或者用分子标记MAG2521的引物MAG2521-F和MAG2521-R能够扩增出161bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗赤霉病侵染基因Fhb4。本发明所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦中的应用。利用上述的分子标记筛选抗赤霉病小麦的方法为:用上述的任意一对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG5184的引物MAG5184-F和MAG5184-R能够扩增出241bp的扩增片段，或者用分子标记MAG7237的引物MAG7237-F和MAG7237-R扩增出688bp的扩增片段，或者用分子标记MAG2521的引物MAG2521-F和MAG2521-R能够扩增出161bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在抗赤霉病侵染基因Fhb4的抗赤霉病小麦。所述的分子标记的引物在克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4中的应用。上述小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记是通过以下方法获得的:(一)望水白Fhb4近等基因系NMAS007与其轮回亲本绵阳99_323F2:3群体的创建与Fhb4区段重组体的筛选:(DNMAS007 (早)与小麦品种绵阳99-323 (c )进行杂交得到杂种FliF1自交产生F2群体；(2)利用Fhb4的边界标记筛选匕群体中在该区段发生重组的杂合单株，利用相同标记在其F3代筛选在该区段发生重组的纯合单株。
(二)重组体抗病表型的鉴定(3)重组体开花前十天左右在田间撒播感病麦粒接种，一周后重复一次。接种15天后调查病小穗率评价其抗侵染性；(三)分子标记分析(4)用SDS法提取抗病亲本NMAS007、感病亲本绵阳99_323及F2群体各单株的DNA ;用 27 对 SSR 引物(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index, shtml)和来自于望水白BAC克隆59对分子标记弓I物对NMAS007，绵阳99-323，中国春以及中国春缺失系4BL_5( Endoand Gilll996)进行多态性分析和特异性分析；(5)选择在亲本间扩增出多态、且能缺失定位到4BL5-0.86 - 1.0Obin的分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的基因型资料，并且利用这些标记检测杂合重组体后代F3家系各单株的基因型；其中，PCR反应体系为 12.5μ 1，其中 IOXbufferl.25μ l，25mM MgCl20.75 μ I,
2.5mMdNTPsly I,左右引物各 0.2 μ M，Taq 酶(5ιι/μ I) 0.I μ 1，模板 DNAlOng,加水至12.5μ I ；PCR扩增程序为94°C预变性3min后，94°C变性30sec，60°C退火lmin，72°C延伸lmin,循环35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。(四)分子标记获得(6)根据连锁交换规律，结合F2代群体各单株基因型资料与杂合重组体F3家系的田间抗病表型，利用软 件Mapmaker Macintosh V3.0构建望水白Fhb4的遗传连锁图，获得了与Fhb4最为紧密连锁的分子标记MAG5184、MAG7237和MAG2521。有益效果:本发明在国际上首次获得了与Fhb4紧密连锁的分子标记MAG5184、MAG7237和MAG2521。可以加速抗病基因Fhb4在小麦抗病育种中的应用，关且还可以用于Fhb4基因的克隆。1、获得了与Fhb4紧密连锁的分子标记MAG5184、MAG7237和MAG2521。在已知的分子标记中与Fhb4连锁最为紧密的是MAG7237，遗传距离仅为0.34cM,能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其它抗病基因的聚合。2、鉴定方便。这三个分子标记都为共显性标记，具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记MAG7237检测Fhb4基因，可以确定Fhb4的存在与否以及存在状态，并预测小麦的赤霉病抗性，进而快速筛选携有Fhb4的植株并用于抗病品种的选育。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对品种的影响。3、提高抗病品种的选择鉴定效率，节约成本。在传统的抗赤霉病育种过程中，需要将携带有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，对后代群体单株进行抗病性鉴定，并且需要多年多点的表型鉴定；并且抗病表型鉴定易受环境的影响，表型鉴定结果有一定的误差。因此抗病品种的选育不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测与抗赤霉病侵染基因Fhb4紧密连锁的分子标记，可以将表型鉴定的工作大大减少，并且在苗期就可鉴定出携有抗病基因Fhb4的单株，从而淘汰非目标植株。因此，利用通过检测与抗赤霉病侵染基因Fhb4紧密连锁的分子标记MAG7237，不仅节约育种成本，而且大大提高抗病品种的选择效率。4、减少连锁累赘。由于小麦的赤霉病抗性往往和一些不良的农艺性状有一定的相关。早期借助分子标记选育的携带有Fhb4的抗赤霉病株系总表现较高的株高，这可能由于QTL初步定位的区间比较大，致使选择导入的区间比较大，造成了一些连锁累赘。利用与抗赤霉病侵染基因Fhb4紧密连锁的分子标记可以减少选择时的连锁累赘，提高选择效率。5、可用于克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4研究。图位克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4的前提在于获得与Fhb4紧密连锁的分子标记。MAG5184和MAG7237在所有已知分子标记中与Fhb4连锁最为紧密。为克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4提供基础。
图1459个纯合重组体病小穗率的分布图。图2MAG5184、MAG7237和MAG2521与小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的遗传连锁图，右边为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离。图3MAG5184扩增带型。M为PUC19/MspI，左侧是分子量标记条带大小(bp)。1为绵阳 99-323，2为NMAS007，3、5、8、10、11、16、18、19为感病基因型单株，6、7、22、23、24、26为抗病基因型单株，4、9、12、13、14、15、17、20、21、25为杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条带。图4MAG7237扩增带型。M为D2000，左侧是分子量标记条带大小(bp)。1为NMAS007，2 为绵阳 99-323，3、6、8、9、11、12、16为感病基因型单株，5、17、18、19、20、22、23为抗病基因型单株，4、7、10、13、14、15、21、24、25、26为杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条带。图5MAG2521扩增带型。M为PUC19/MspI，左侧是分子量标记条带大小(bp)。1为NMAS007，2为绵阳99-323，2、3、4、5、10、11、14为感病基因型单株，其余为杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条带。
具体实施例方式实施例1小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记是通过以下方法获得的:(一)望水白Fhb4近等基因系NMAS007与其轮回亲本绵阳99_323F2:3群体的创建与Fhb4区段重组体的筛选:(DNMAS007 (早)与小麦品种绵阳99-323 (J)进行杂交得到杂种F1, F1自交产生包含有4303个单株的F2群体；(2)利用 Fhb4 的边界标记 Xhbg226 和 Xgwml49 (Torada et al.2006 ；Roder etal.1998)在F2群体中筛到187个在该区段发生重组的杂合单株，利用相同标记在其F3代筛选得到459个在该区段发生重组的纯合单株。(二)重组体抗病表型的鉴定重组体开花前十天左右在田间撒播感病麦粒对这些纯合重组体接种，一周后重复一次。接种15天后调查病小穗率。鉴定结果表明:这些重组体抗性分离明显(图1)，携带有Fhb4基因的株系与感病亲本相比，抗性有显著提高(表I)。
(三)多态性分子标记的筛选及重组体基因型分析 (I)首先利用其他图谱中位于Fhb4区段的27个SSR标记(http: //wheat,pw.usda.gov/GG2/index, shtml)和望水白BAC克隆序列开发的59个分子标记对Fhb4近等基因系和绵阳99-323进行多态性筛选，最终得到2个在亲本间有多态的SSR标记和I个在亲本间有多态的STS标记，即MAG5184、MAG2521和MAG7237这三个分子标记。PCR 反应体系为 12.5 μ I，其中 10 X buffer 1.25 μ I, 25mM MgCl20.75 μ 1,2.5mMdNTPsly 1，左右引物各 0.2μΜ，Taq 酶(5ιι/μ 1)0.1 μ 1，模板 DNAlOng，加水至 12.5μ I ；PCR扩增程序为94°C预变性3min后，94°C变性30sec，60°C退火lmin，72°C延伸lmin,循环35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。(3)利用在亲本间有多态的分子标记MAG5184、MAG7237和MAG2521分析所有纯合重组体，这些重组体可以分成4种重组类型(表I)。(四)分子标记的获得根据连锁交换规律，结合F2 代群体各单株基因型资料与杂合重组体F3家系的田间抗病表型(表I)，利用软件Mapmaker Macintosh V3.0构建了望水白Fhb4的遗传连锁图(图
2)，获得了与Fhb4紧密连锁的分子标记MAG5184、MAG7237和MAG2521，它们分别距Fhb4基因 0.72cM、0.34cM、0.92cM。MAG5184、MAG7237 和 MAG2521 分子标记引物扩增带型见图 3、图4和图5。表1NMAS007 -绵阳99_323F2:3群体中纯合重组体的基因型和表型
权利要求
1.小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记MAG7237，其特征在于: 用标记引物 MAG7237-F:SEQ ID N0.3, MAG7237-R:SEQ ID N0.4 扩增小麦品种 DNA，获得的扩增片段为688bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4连锁的分子标记MAG7237，该标记为共显性分子标记，与Fhb4紧密连锁,利用Mapmaker Macintosh V3.0测得该标记与Fhb4基因的遗传距离为0.34cM。
2.权利要求1所述的分子标记在小麦种质资源中抗赤霉病侵染基因Fhb4的鉴定中的应用。
3.小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记方法，其特征在于用权利要求1所述的标记引物MAG7237-F/MAG7237-R PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果扩增出688bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗赤霉病侵染基因Fhb4。
4.权利要求1所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于利用权利要求1所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦的方法为:用权利要求1所述的分子标记MAG7237的引物MAG7237-F和MAG7237-R扩增出688bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在抗赤霉病侵染基因Fhb4的抗赤霉病小麦。
6.权利要求1所述的分子标记的引物在克隆抗赤霉病侵染基因Fhb4中的应用。
全文摘要
本发明属于作物育种学领域，公开了小麦抗赤霉病侵染基因Fhb4的分子标记MAG7237及其应用。所述的分子标记MAG7237，与Fhb4基因的遗传距离为0.34cM。本发明在国际上首次获得了与Fhb4最为紧密连锁的分子标记。该分子标记为共显性标记，具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记MAG7237检测Fhb4基因，可以确定Fhb4的存在与否以及存在状态，并预测小麦的赤霉病抗性，进而快速筛选携有Fhb4的植株并用于抗病品种的选育。
文档编号C12N15/10GK103146699SQ20131010314
公开日2013年6月12日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者马正强, 薛树林, 李国强 申请人:南京农业大学