一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法
【专利摘要】本发明提供了一种重组大肠杆菌工程菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株通过生物法从乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸的方法。本发明通过以葡萄糖或甘油等为碳源，在适当的宿主细胞(例如，大肠杆菌)中共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)，利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。其中乙酰辅酶A最终是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得。
【专利说明】一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及聚3-羟基丙酸的生物合成。具体地，本发明提供了一种重组大肠杆菌工程菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株从乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸的方法。
【背景技术】
[0002]聚3-羟基丙酸(poly (3-hydroxypropionate), P3HP)是一种非常有发展前景的可生物降解塑料，具有优异的生物材料性质和机械性能，比如具有高机械强度和拉伸强度(> 400MPa)、高断裂伸长量(> 300% )、生物降解性、生物兼容性、不溶于水、无毒、压电性、热塑性等。相对于其它两种研究较多的可生物降解塑料聚3-羟基丁酸(PHB)和聚乳酸(PLA)来说，P3HP具有更优越的性能:它比PLA具有更好的稳定性不会水解，又由于碳链骨架中没有甲基而比PHB更易被微生物降解。作为新型功能材料，P3HP可广泛应用于地膜、矫形外科、个人卫生用品、药物控释、包装等领域。
[0003]目前已知的生物并不能合成天然P3HP。P3HP的化学合成方法中以β-丙内酯开环聚合方法最为成熟。由于β_丙内酯为致癌物质且价格昂贵，限制了该方法的应用。与化学合成法相比，生物合成Ρ3ΗΡ具有操作简单、条件温和、绿色环保等优点。然而，Ρ3ΗΡ的生物合成目前多需添加3-羟基丙酸、I，5-戊二醇、I，7-庚二醇等相关碳源，这些相关碳源价格昂贵，使Ρ3ΗΡ的生产成本过高，无法应用于工业化生产。生物法利用非相关碳源合成Ρ3ΗΡ的研究刚刚起步，仅有一篇文献报道Andreessen等利用工程大肠杆菌以甘油为碳源生产P3HP (Andreessen et al.2010)，且需要两步培养法，发酵工艺较为复杂。
【发明内容】
[0004]为解决上述现有技术中存在的问题，本发明主要通过在大肠杆菌中建立起利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的生物合成途径，从而在重组大肠杆菌工程菌中实现了大量生物合成聚3-羟基丙酸的目的。
[0005]因此，在第一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株，所述菌株包含:
[0006](1)编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子、与乙酰辅酶A羧化酶基因具有70%以上同源性且编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或与乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性但编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子；
[0007](2)编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的核酸分子、与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性且编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子或与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性但编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子；
[0008](3)编码丙酰辅酶A合成酶的核酸分子、与丙酰辅酶A合成酶基因具有70%以上同源性且编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或与丙酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性但编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；和[0009](4)编码聚羟基脂肪酸合成酶的核酸分子、与聚羟基脂肪酸合成酶基因具有70%以上同源性且编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或与聚羟基脂肪酸合成酶基因没有明显的同源性但编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。
[0010]其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc选自:
[0011]1)埃希氏菌属大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因acc，
[0012]2)来源于其他细菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，例如，沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶
基因，
[0013]3)和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因同源性超过70%且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0014]4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0015]其中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr选自:
[0016]I)绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，
[0017]2)来源于其他细菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，
[0018]3)和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因同源性超过70%且编码具有与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0019]4)来源于其它生物体，和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因没有明显的同源性，但编码与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0020]其中所述丙酰辅酶A合成酶基因prpE选自:
[0021]I)埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因prpE,
[0022]2)来源于其他细菌的丙酰辅酶A合成酶基因，例如，沙门氏菌的丙酰辅酶A合成酶基因，
[0023]3)和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因同源性超过70 %且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的PrpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0024]4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的PrpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0025]其中所述乙酰辅酶A羧化酶、丙二酸单酰辅酶A还原酶和丙酰辅酶A合成酶这三种酶活性的共同提高增加聚3-羟基丙酸的前体物质3-羟基丙酰辅酶A的量。
[0026]其中所述聚羟基脂肪酸合成酶基因phaCl选自:
[0027]I)产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因phaCl，
[0028]2)和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaCl基因同源性超过70%且编码具有与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0029]3)来源于其它生物体，和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaCl基因没有明显的同源性，但编码与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0030]在本发明的一个更优选的方面，所述重组大肠杆菌菌株为保藏编号为CGMCCN0.6615的菌株P3HP01，该菌株于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，邮编:100101)。
[0031]在第二个方面，本发明提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤:
[0032](I)制备包含聚羟基脂肪酸合成酶基因phaCl、丙酰辅酶A合成酶基因prpE和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr的重组质粒A ；
[0033](2)制备包含乙酰辅酶A羧化酶基因acc的重组质粒B ；
[0034](3)将上述质粒A和B共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得同时包含聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶四种酶活性的重组大肠杆菌菌株。
[0035]在这一方面中，本领域技术人员应该理解，在根据本发明的第一方面确定了聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶四种基因的核苷酸序列后，可以利用常规分子重组克隆技术将上述四种基因的核苷酸序列与适当的表达控制元件可操作性连接或彼此之间可操作性连接，然后克隆到适宜的大肠杆菌细胞中，并且筛选得到同时包含聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶这四种酶活性的重组大肠杆菌菌株。此外，上述四种酶的核苷酸序列如果不是来源于大肠杆菌，则可以针对大肠杆菌进行密码子优化，这也是在本领域技术人员的能力范围之内的。
[0036]在第三个方面，本发明提供了生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，具体是一种从乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法通过将本发明第一方面所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含适当的表达诱导剂的培养基中进行培养，所述重组大肠杆菌菌株利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。
[0037]在所述生物法合成聚3-羟基丙酸的方法中，乙酰辅酶A最终是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得，由此建立可持续发展的聚3-羟基丙酸合成工艺路线。与Andreessen等以甘油为碳源相比，乙酰辅酶A作为糖代谢的中间体，原料来源更广泛，成本更低；此外，从乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的过程中，还原力平衡。本发明生产工艺简单，成本低廉，具有广阔的应用前景。
[0038]本发明主要通过基因工程手段提高丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)途径中限速酶的活性，即提高乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)的活性，从而增加聚3-羟基丙酸的合成前体物3-羟基丙酰辅酶A的量，再利用细菌聚3-羟基丙酸合成酶将3-羟基丙酰辅酶A催化合成目标产物聚3-羟基丙酸。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种聚3-羟基丙酸生物合成代谢途径。
[0039]在本发明的一个优选的方面中，本发明提供一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法包括下述步骤:
[0040]第一步，利用分子克隆方法构建共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE),以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(PhaC)的重组宿主细胞；[0041]第二步，将第一步构建得到的重组宿主细胞在适当的培养基中培养发酵，添加表达诱导剂诱导适当的时间；
[0042]第三步，收集菌体，离心，水洗，冻干后，氯仿萃取，得到的聚3-羟基丙酸产物。
[0043]其中，所述宿主细胞可以为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌，优选大肠杆菌。所用的重组方法为本领域中的常规分子克隆方法。例如，实施例中所述的构建方法。可以将上述各种酶构建到可诱导的启动子的控制下，例如，可以用IPTG诱导上述酶类的表达。
[0044]所述“适当的培养基”包括以各种适于所选用的宿主细胞(例如，大肠杆菌)生长的培养基，对培养基的碳源没有特别的限定，碳源可以是葡萄糖、甘油等，只要是能产生乙酰辅酶A的碳源均可。优选成本低的碳源，例如，葡萄糖或甘油。
[0045]其中所述的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)、丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)均如本发明第一方面所述。
[0046]更具体地，本发明提供以下各项:
[0047]1.一种重组大肠杆菌菌株，所述菌株包含:
[0048](1)编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子、与乙酰辅酶A羧化酶基因具有70%以上同源性且编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或与乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性但编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子；
[0049](2)编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的核酸分子、与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性且编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子或与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性但编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子；
[0050](3)编码丙酰辅酶A合成酶的核酸分子、与丙酰辅酶A合成酶基因具有70%以上同源性且编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或与丙酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性但编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；
[0051](4)编码聚羟基脂肪酸合成酶的核酸分子、与聚羟基脂肪酸合成酶基因具有70%以上同源性且编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或与聚羟基脂肪酸合成酶基因没有明显的同源性但编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。
[0052]2.根据第I项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)选自:
[0053]1)埃希氏菌属大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，
[0054]2)来源于其他细菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，例如，沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶
基因，
[0055]3)和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因同源性超过70%且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0056]4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0057]3.根据第I项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)选自:[0058]1)绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，
[0059]2)来源于其他细菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，
[0060]3)和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因同源性超过70%且编码具有与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0061]4)来源于其它生物体，和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因没有明显的同源性，但编码与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0062]4.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)选自:
[0063]1)埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因，
[0064]2)来源于其他细菌的丙酰辅酶A合成酶基因，例如，沙门氏菌的丙酰辅酶A合成酶基因，
[0065]3)和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因同源性超过70 %且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的PrpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0066]4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的PrpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0067]5.根据第I项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶/丙二酸单酰辅酶A还原酶和丙酰辅酶A合成酶这三种酶活性的共同提高增加聚3-羟基丙酸的前体物质3-羟基丙酰辅酶A的量。
[0068]6.根据第I项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaCl)选自:
[0069]1)产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因，
[0070]2)和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaCl基因同源性超过70%且编码具有与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0071]3)来源于其它生物体，和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaCl基因没有明显的同源性，但编码与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0072]7.根据第I项所述的重组大肠杆菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC N0.6615。
[0073]8.一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法通过将第1-7项中任一项所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含适当的表达诱导剂的培养基中进行培养发酵，所述重组大肠杆菌菌株利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。
[0074]9.一种可生物降解的材料，其由根据第8项所述的方法合成的聚3-羟基丙酸制成。
[0075]10.根据第9项所述的材料，所述材料选自包装材料、缓释材料、电化学材料或组织工程材料。[0076]定义和缩写
[0077]在本文中使用下列的缩写或简称:
[0078]乙酰辅酶A羧化酶基因:acc
[0079]丙酰辅酶A合成酶基因:prpE
[0080]丙二酸单酰辅酶A还原酶基因:mcr
[0081]聚羟基脂肪酸合成酶基因:phaC
[0082]大肠杆菌(Escherichiacoli):Ε.coli
[0083]“可操作性连接”指在表达调控元件和受调控序列(例如基因)的多核苷酸之间的功能连接，使得受调控序列在适于表达该受调控序列的条件下表达，从而产生所期望的肽或多肽。例如，表达调控元件可以是转录调控元件如启动子、增强子序列和其他顺式作用元件等。[0084]“过量表达”或“过表达”是指特定基因在生物体中的表达超过正常水平(即，野生型表达水平)，例如，通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
[0085]保藏说明:
[0086]本发明构建的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli,又称大肠杆菌)菌株已于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，邮编=100101)，保藏编号为CGMCC N0.6615，命名为P3HP01。
[0087]附图简述
[0088]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0089]图1.利用乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸代谢途径示意图；
[0090]图2.pET21a-phaC-prpE_mcr载体构建不意图(即，pHP304质粒图谱);
[0091]图3.重组大肠杆菌目标蛋白的表达鉴定图，M表示分子量标记,泳道I为E.coliBL21 (DE3)/pACYCDuet-l/pET21a，泳道 2 为 E.coliBL21 (DE3)/pACYC-accABCD，泳道 3 为E.coli BL21 (DE3)/pHP304,泳道 4 为 E.coli BL21 (DE3)/pHP304/pACYC_accABCD，箭头表示外源蛋白的表达，乙酰辅酶A羧化酶C亚基AccC (49.3kDa)，A亚基AccA和D亚基AccD (35kDa 和 33.3kDa)，B 亚基 AccB (16.7kDa)，丙二酸单酰辅酶 A 还原酶 MCR(132kDa)，和聚羟基脂肪酸合成酶PhaCl (64kDa)；
[0092]图4.本发明的重组细胞发酵生产聚3-羟基丙酸的核磁图谱，a图为H谱，b图为C谱。
[0093]序列表说明
[0094]
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌菌株，所述菌株包含: (1)编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子、与乙酰辅酶A羧化酶基因具有70%以上同源性且编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或与乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性但编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子； (2)编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的核酸分子、与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性且编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子或与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性但编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子； (3)编码丙酰辅酶A合成酶的核酸分子、与丙酰辅酶A合成酶基因具有70%以上同源性且编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或与丙酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性但编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；和 (4)编码聚羟基脂肪酸合成酶的核酸分子、与聚羟基脂肪酸合成酶基因具有70%以上同源性且编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或与聚羟基脂肪酸合成酶基因没有明显的同源性但编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc选自: 1)埃希氏菌属大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因， 2)来源于其他细菌 的乙酰辅酶A羧化酶基因，例如，沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因， 3)和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因同源性超过70%且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr选自: 1)绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因， 2)来源于其他细菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因， 3)和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因同源性超过70%且编码具有与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 4)来源于其它生物体，和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因没有明显的同源性，但编码与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙酰辅酶A合成酶基因prpE选自: 1)埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因， 2)来源于其他细菌的丙酰辅酶A合成酶基因，例如，沙门氏菌的丙酰辅酶A合成酶基因，3)和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因同源性超过70%且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的PrpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的PrpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶、丙二酸单酰辅酶A还原酶和丙酰辅酶A合成酶这三种酶活性的共同提高增加聚3-羟基丙酸的前体物质3-羟基丙酰辅酶A的量。
6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述聚羟基脂肪酸合成酶基因phaCl选自: 1)产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因， 2)和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因同源性超过70%且编码具有与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 3)来源于其它生物体，和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因没有明显的同源性，但编码与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的PhaCl基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCCN0.6615。
8.—种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法通过将权利要求1-7中任一项所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含适当的表达诱导剂的培养基中进行培养发酵，所述重组大肠杆菌菌株利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。
9.一种可生物降解的材料，其由根据权利要求8所述的方法合成的聚3-羟基丙酸制成。
10.根据权利要求9所述的材料，所述材料选自包装材料、缓释材料、电化学材料或组织工程材料。
【文档编号】C12P7/62GK103898034SQ201210581073
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】咸漠, 赵广, 王 琦, 刘长水 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所