一种医用纳米复合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种医用纳米复合物，包括：（a）用于分子识别的寡核苷酸或多肽适配体；（b）超顺磁氧化铁纳米微粒；（c）生物相容性双亲性葡聚糖嵌段共聚物载体，用于超顺磁氧化铁纳纳米粒子和连接用于分子识别的寡苷酸酸或多肽适配体。本发明使用适配体、超顺磁性氧化铁纳米微粒与聚乙二醇、聚己内酯和多糖的嵌段共聚物组装成为的医用纳米复合物，利用适配体与靶分子特异性结合的靶向作用及SPIO纳米微粒的磁共振造影特性，通过生物相容性的嵌段共聚物构建复合纳米胶束，进入体内后，靶向定位微小病灶，通过常规的核磁共振造影诊断设备用于体内外微小病变的早期靶向定位诊断。本发明通过选择合适的靶分子适配体，也可以用于细胞信号传导、代谢过程、基因检测、病毒侦测、肿瘤探测等生物研究。
【专利说明】一种医用纳米复合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种医用纳米复合物，适用于微小病变定位的早期的辅助治疗。
【背景技术】
[0002]由于当前老龄化社会的趋势和世界范围内人们寿命的延长，人们逐渐意识到如何实现个人健康生活的重要性。相应地，人们一直强调对于诸如癌症和其它威胁生命的重大疾病早期诊断的必要，因此一直迫切需要开发一种在认为需要的时候能够用于早期诊断，并且具备微小病变精确定位的诊断技术。在此背景下人们一直努力开发新颖的诊断和治疗技术，应用人类基因组计划所获得的丰富的生物信息与纳米技术相结合，将两者结合巧妙地用于制造高度敏感及具有精确靶向的生物传感器件，结合常规的核磁共振影像技术，从而实现体内外微小病变的早期靶向定位诊断及其它生物目的研究，如细胞信号传导、代谢过程等等研究。[0003]SELEX技术是近年来发展起来的一种研究核酸结构、功能及进化等的一种新的组合化学技术，它不仅在基础研究、生物筛查等方面均有很好的应用，而且在临床诊断方面显示了广阔的前景。通过指数富集配基的系统进化技术体外筛选得到的一组能与目标靶分子高亲和、高特异性结合的寡核苷酸系列(单链DNA或RNA)，称为适配体(Aptamer)。作为一类新型的功能分子，适配体克高亲和力和高特异性地识别不同的分子。它的亲和力和特异性可与抗体相媲美，被认为是“挑战”抗体地位的一种新型试剂，已在生命科学、化学等领域获得越来越多的应用，以不同类型的示踪分子标记适配体后，该类适配体探针可以直观地将适配体与靶分子的特异性识别转化为灵敏的示踪信号，从而为靶分子的检测提供一种灵敏、特异的新型模式，在疾病诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。最近Santa-ColomaTA等报道了用IE标切换技术制备的高特异性“monoclonal oligobody (单克隆寡核苷酸适配体)”或 “synthetic oligobody (合成寡核苷酸适配体)” (Bianchini M et al, J.1mmunol, methods, 2001, 252:191-197)可以特异性识别相应的蛋白质,应用于蛋白质印迹、免疫组化、免疫共沉淀等分析试验中。相对于适配体，蛋白类抗体的产生和应用存在以下限制:病毒性抗原免疫,动物无法产生耐受免疫,免疫原性弱导致抗体难以产生；杂交瘤单克隆抗体，在人体的排异反应；抗体生产成本高、费时费力，稀有抗体需要大量筛选才能得到，克隆细胞株需要传代培养；批间质量不均一，需要重新优化标定，体内外识别特异性差异；抗体对温度敏感，寿命有限，需要低温保存等缺点。而适配体在体外筛选，特性可依要求设计改变；动力学参数可依照诊断条件的要求而改变；无毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受限制；在体外化学合成，可以保证时间、质量和数量的特别需要；特异性不受组织或样品中非靶蛋白的干扰；可以在合成时精确、定点、随意连接其它功能集团和分子，如巯基、氨基、荧光素、生物素、酶等；比抗体分子小，更适合于体内影像诊断和治疗；变性和复性可逆,而且速度快,可反复使用、长期保存和室温下运输。
[0004]目前在影像探针的研究领域，可用作药物载体的聚合物胶束已受到越来越多的关注，这些聚合物胶束通过双亲性两嵌段聚合物在水溶液中自组装而形成核-壳结构。经自组装形成的聚合物胶束体系具有较低临界胶束浓度(CMC)、较低药物毒副作用和较长血液循环时间等优点，是包裹功能性纳米粒子如SPIO和量子点灯的良好载体，用于生物成像的研究。聚合物胶束包裹纳米粒子所形成的纳米复合物除保留纳米粒子原本的磁学和光学特性外，还提高了它在体内外的生物相容性，尤其突出的是多个磁性纳米微粒可以在胶束疏水核内形成致密的团簇结构，从而在同样铁浓度下产生比单个氧化铁粒子更强的T2效应，这一独特结构是开发高灵敏度磁共振影像探针的重要基础。同时两嵌段聚合物胶束的亲水段可以和适配体连接，从而具有了靶向特异性。多糖是一类具有良好生物相容性的天然聚合物，其中葡聚糖、透明质酸、硫酸软骨素和壳聚糖等在药物和基因转导中已有广泛的应用。右旋糖酐等葡聚糖因其良好的生物安全性而在临床上用于血浆替代品，它也是Feridex和Resovist两种SPIO造影剂得包被材料。但单一的葡聚糖本身并不能够使疏水性SPIO颗粒在水溶液中稳定分散。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供一种医用纳米复合物，包括:
Ca)用于分子识别的寡核苷酸或多肽适配体；
(b)超顺磁氧化铁纳米微粒；
(c)生物相容性双亲性葡聚糖嵌段共聚物载体，用于超顺磁氧化铁纳纳米粒子和连接用于分子识别的辅助治疗。
[0006]进一步的，上述寡核苷酸或多肽适配体是筛选可特异性结合某些靶标；具体包括肿瘤、病毒、细菌、信号蛋白、抗原、抗体，核酸、有机小分子、金属离子及某些特异性细胞等。
[0007]进一步的，上述生物相容性双亲性葡聚糖嵌段共聚物，是通过缩合反应连接分子识别寡核苷酸或多肽适配体，通过乳液挥发包裹超顺磁氧化铁纳米粒子。
[0008]进一步的，基于上述适配体的寡核苷酸或多肽与超顺磁氧化铁纳米颗粒在生物相容性嵌段共聚物中组合成为具有靶向功能的纳米复合影像造影剂，利用适配体的靶向识别革巴分子。
[0009]上述靶分子包括蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、药物、维生素、有机化合物、无机化合物、细胞、细菌、病毒、肿瘤、信号蛋白、抗原、抗体、金属离子中的一种或多种组合。
[0010]一种医用纳米复合物的应用，可用于体内、体外靶向定位微小病灶，通过常规的核磁共振造影诊断设备用于体内外微小病变的早期靶向定位诊断，也可用于细胞信号传导、代谢过程、基因检测、病毒侦测、肿瘤探测等生物研究。
具体实施例
[0011]选用叶酸作为靶标分子，将叶酸、福氏免疫佐剂、磷脂、胆固醇适量混合研磨制备免疫原,将上述免疫原小鼠大腿、背部皮下多点免疫注射,30-60天后采血检测叶酸抗体。采小鼠血清提取叶酸抗体，将小鼠抗叶酸抗体用PBS缓冲液稀释后在合适的温度条件下包被聚乙烯小孔板。实验时将叶酸稀释适量加入已包被抗叶酸抗体的聚乙烯小孔板孵育适当时间，用PBS缓冲液清 洗未结合的游离叶酸分子，真空低温抽干密封储存于4°C冰箱备用。
[0012]把约0.5nmol生物素标记的随机ssDNA和上述聚苯乙烯微孔板在500ul含1%BSA的结合 TE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, PH 7.5，ImM EDTA, lmMCaC12, ImM MgCl2)中孵育，轻轻震荡，4°C过夜。倾去孵育液，然后用0.5 ml TE缓冲液洗涤3次微孔板，然后用7M尿素在94°C反应10分钟洗脱结合的寡核苷酸，然后用酚/氯仿/异丙醇(25:24:1，PH 8)抽提，洗脱液加入10%糖原后用乙醇沉淀，再进行PCR (95°C预变性5分钟后，扩增5个循环:94°C变性1分钟，55°C退火2分钟，72°C延伸1分钟，最后72°C终止延伸5分钟)，取10 ul上述PCR产物为模板，再次PCR扩增，每3个循环取样，选择PCR产量大，无杂带的循环数为最佳循环数，将剩余90ul产物全部扩增。其中一部份以[a -32P] CTP为底物进行PCR，得到的产物与包被不同浓度有叶酸的聚苯乙烯板杂交进行验证。其余部分通过PCR生成生物素化dsDNA，再拆分为生物素化ssDNA。
[0013]不同浓度叶酸包被微孔板和放射性标记的第一轮筛选后的扩增文库进行点杂交，结果显示杂交信号强度随叶酸浓度增加而增加，表明获得的标记DNA文库和叶酸有特异的结合作用。
[0014]将上述杂交方法筛选到与叶酸有强力结合的次级DNA文库用尿素-苯酚洗脱抽提纯化，通过PCR (95°C预变性5分钟后，扩增90个循环:94°C变性1分钟，55 °C退火2分钟，72°C延伸1分钟，最后72°C终止延伸5分钟)扩增生成生物素化dsDNA，拆分为生物素化ssDNA叶酸寡核苷酸适配体，多克隆寡核苷酸适配体经过PCR扩增后，连接与pGEM-T easyVector,然后转染感受态细胞，挑取3个克隆进行测序。每一个阳性克隆即为一个单克隆寡核苷酸适配体。通过包被叶酸聚苯乙烯微孔板，可以检测单克隆寡核苷酸适配体的结合系数，选择合适的单克隆寡核苷酸适配体备用。
[0015]将1mmolFe (acac) 3与5mmol 1，2_十六烧醇、3mmol油酸及3mmol油胺混合于1OmL苄醚、氩气保护下加热至300°C回流1小时，溶液冷却至室温后用甲醇沉淀得到黑色固体，将沉淀回溶于混合了油酸油胺的正己烷中，再用甲醇沉淀，得到的产物产物于正己烷中保存。
[0016]用乳液挥发法按照聚合物/SP1O等于3的质量比，将适量的聚合物和SP1O分散于0.5mL氯仿，并将其加至5mL纯水中，用探头超声(SON1CS，US)分散，氯仿挥发后即得到水相中的Dex-g-PCL/SP1O纳米复合物,该纳米复合物的粒度分布和形貌分别通过MalvernNanos1zer粒度仪和扫描电子显微镜(H1tach1 S-4800, Janpan)进行表征。
[0017]生物素化ssDNA叶酸寡核苷酸适配体携带的生物素与Dex-g-PCL葡聚糖通过缩合反应联接在一起，通过合适的柱层析纯化“适配体-Dex-g-PCL”复合物。
[0018]适配体-Dex-g-PCL/SP1O纳米复合物制备
将柱层析纯化“适配体-Dex-g-PCL”复合物加按照3:1加入超顺磁氧化铁纳米微粒(SP10)，用乳液挥发法制备复合物。
[0019]用动态光散射、磁化强度和T2驰豫效能(relax1v1ty)等参数来表征胶束的物理特性；通过小鼠肝脏造影来评价该纳米复合材料的体内显影效果；通过静脉注射造影剂后在不同时间点对肝脏、脾脏进行组织病理学切片和染色，检测磁共振造影剂在体内的分布、细胞吞嗤及靶向情况。
[0020]本发明医用纳米复合物，利用适配体与靶分子特异性结合的靶向作用及SP1O纳米微粒的磁共振造影特性，通过常规的核磁共振造影诊断设备用于体内外微小病变的早期靶向定位诊断。本发明通过选择合适的靶分子适配体，也可以用于细胞信号传导、代谢过程、细菌/病毒侦测、分子相互作用等生物研究。[0021]本发明选择双亲性葡聚糖作为包裹SPIO纳米粒子而形成纳米复合材料，技术上以聚乙二醇、聚己内酯等与多糖合成的嵌段共聚物，形成双亲性的纳米胶束，既可以包裹疏水性SPIO纳米微粒，同时通过合适的基团与修饰后的适配体聚合反应，可以共同组成具有靶向特异性的一种医用纳米复合物。
【权利要求】
1.医用纳米复合物，其特征在于， 包括: Ca)用于分子识别的寡核苷酸或多肽适配体； (b)超顺磁氧化铁纳米微粒； (c)生物相容性双亲性葡聚糖嵌段共聚物载体，用于超顺磁氧化铁纳纳米粒子和连接用于分子识别的寡苷酸酸或多肽适配体。
2.根据权利要求1所述的一种核磁共振影像造影剂，其特征在于，寡核苷酸或多肽适配体是经筛选的可特异性结合靶标或特异性细胞。
3.根据权利要求2所述的一种核磁共振影像造影剂，其特征在于，所述可特异性结合靶标包括肿瘤、病毒、细菌、信号蛋白、抗原、抗体，核酸、有机小分子或金属离子。
4.根据权利要求1所述的一种核磁共振影像造影剂，其特征在于，所述生物相容性双亲性葡聚糖嵌段共聚物，是通过缩合反应连接分子识别寡核苷酸或多肽适配体，通过乳液挥发包裹超顺磁氧化铁纳米粒子。
5.根据权利要求1所述的一种核磁共振影像造影剂，其特征在于，所述基于上述适配体的寡核苷酸或多肽与超顺磁氧化铁纳米颗粒在生物相容性嵌段共聚物中组合成为具有靶向功能的纳米复合影像造影剂，利用 适配体的靶向识别靶分子。
6.一种如权利要求1所述的一种医用纳米复合物的应用，是用于体内、体外靶向定位微小病灶、病变的辅助治疗。
【文档编号】C12Q1/68GK103893783SQ201210579872
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】陈亚玲 申请人:上海长征富民金山制药有限公司