专利名称：植物种胚微创非组培转化方法
技术领域：
本发明涉及一种基因转化方法，具体涉及一种植物种胚微创非组培转化方法。
背景技术：
目前植物基因工程所包含的转化方法很多。如基因枪法、农杆菌介导法、电穿孔法、激光穿孔法等等。这些方法要么需要专门的贵重的仪器设备，要么转化周期太长，一般在普通实验室里是不易操作完成的。社会的进步和其它科学领域的飞速发展，需要相适应的技术来带动植物基因工程学科的发展。各国科学家通过不懈的努力，仅转化方法本身的技术进步已经令人目不暇接。这其中包括新的转化方法的建立和对传统方法的改良。孙毅、王景雪、刘少翔申请的中国发明的农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，申请号码:CN01104185，授予日期:2004/5/19，该技术用刀尖进行划胚处理，对胚的微创伤面积太大，出苗率太低。并且种子萌发时间过长，对种子在其后的胚创伤处理中影响较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物种胚微创非组培转化方法，它能避免农杆菌介导法等所需的较长时间的组织培养过程，节省大量的时间；且不需要贵重的仪器设备，普通实验室即可进行操作完成。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方:I)、选择饱满、无机械损伤的子粒若干；2)、将子粒于0.1%氯化汞浸泡2分钟左右，70%酒精浸泡10分钟左右灭菌；最后用无菌水或煮沸冷却以后 的自来水漂洗子粒3-5次以上，以除去子粒表面黏附的灭菌液；3)、将灭菌种子放在一个预先灭菌的容器中，加无菌水至淹没种子为止，烧杯口用透气的封口纸包裹，于摇床上120转/分28°C培养，让种子充分吸水膨胀；4)、培养4-12小时，依据种子类型而定，停止培养，准备切胚；5)、将吸水膨胀种子放在一个干净的器皿内，操作人员事先戴上卫生手套，用注射针在种子胚部进行穿刺，深度不超多2-4_，依据种子类型而定，穿刺使胚致伤但又不影响种子的进一步萌发；6)、将伤胚种子进行超声波处理，超声波的功率依据种子类型而定。超声波处理后划胚的种子置于带有目的基因的质粒菌液中共培养或再次进行低功率的超声波处理，处理后的伤胚种子于摇床上震荡120转/分培养1-2天，以种子露白为准；7)、露白种子先用无菌水或煮沸冷却以后的自来水漂洗3-5次，然后播种于事先灭菌的并用相关标记抗性基因的适当浓度的抗生素溶液浇至饱和的蛭石苗床上，进行抗性基因筛选，蛭石呈现干旱状态时，用同样的抗生素溶液浇灌；记录播种的种子颗粒数和出苗情况，出苗初步认定为抗生素抗性苗；8)、3叶期，将苗移栽到大田进一步生长，记录移栽苗数及成活苗数，正常生产管理，直至收获种子；
9)、收获的种子来年播种得到下一代，称为T1代；10) ,T0和T1植株在5叶期取幼嫩叶片进行PCR检测，并对PCR检测呈阳性结果的植株样品进行Southern blot杂交分析,确定是否得到转基因植株；11)、在确定得到转基因植株及种子的基础上，进一步进行田间生物学鉴定和纯系选育。所述的步骤5用注射器针头进行处理，可以避免大面积创伤，也可以利用注射器进行负压处理，增大对胚的微创伤，而不增加面积。所述的步骤6是将带有目的基因的质粒菌在LB培养基上培养，在菌对数生长期间停止培养。取少量菌液按梯度稀释，测OD6tltl值，以OD6tltl值在0.04——0.08为所需菌液浓度。超声波功率100-1000W之间进行选择，工作时间和工作频率都依据种子类型而定。本发明具有以下有益效果:能避免农杆菌介导法等所需的较长时间的组织培养过程，节省大量的时间；且不需要贵重的仪器设备，普通实验室即可进行操作完成。
具体实施例方式本具体实施方式
采用以下技术方案:I)、选择饱满、无机械损伤的子粒若干；2)、将子粒于0.1%氯化汞浸泡2分钟左右，70%酒精浸泡10分钟左右灭菌；最后用无菌水或煮沸冷却以后的自来水漂洗子粒3-5次以上，以除去子粒表面黏附的灭菌液；3)、将灭菌 种子放在一个预先灭菌的容器中，加无菌水至淹没种子为止，烧杯口用透气的封口纸包裹，于摇床上120转/分28°C培养，让种子充分吸水膨胀；4)、培养4-12小时，依据种子类型而定，停止培养，准备切胚；5)、将吸水膨胀种子放在一个干净的器皿内，操作人员事先戴上卫生手套，用注射针在种子胚部进行穿刺，深度不超多2-4_，依据种子类型而定，使胚致伤但又不影响种子的进一步萌发；6)、将伤胚种子进行超声波处理，超声波的功率依据种子类型而定。超声波处理后划胚的种子置于带有目的基因的质粒菌液中共培养或再次进行低功率的超声波处理，处理后的伤胚种子于摇床上震荡120转/分培养1-2天，以种子露白为准；7)、露白种子先用无菌水或煮沸冷却以后的自来水漂洗3-5次，然后播种于事先灭菌的并用相关标记抗性基因的适当浓度的抗生素溶液浇至饱和的蛭石苗床上，进行抗性基因筛选，蛭石呈现干旱状态时，用同样的抗生素溶液浇灌；记录播种的种子颗粒数和出苗情况，出苗初步认定为抗生素抗性苗；8)、3叶期，将苗移栽到大田进一步生长，记录移栽苗数及成活苗数，正常生产管理，直至收获种子；9)、收获的种子来年播种得到下一代，称为T1代；10) ,T0和T1植株在5叶期取幼嫩叶片进行PCR检测，并对PCR检测呈阳性结果的植株样品进行Southern blot杂交分析,确定是否得到转基因植株；11)、在确定得到转基因植株及种子的基础上，进一步进行田间生物学鉴定和纯系选育。所述的步骤5用注射器针头进行处理，可以避免大面积创伤，也可以利用注射器进行负压处理，增大对胚的微创伤，而不增加面积。所述的步骤6是将带有目的基因的质粒菌在LB培养基上培养，在菌对数生长期间停止培养。取少量菌液按梯度稀释，测OD6tltl值，以OD6tltl值在0.04——0.08为所需菌液浓度。超声波功率100-1000W之间进行选择，工作时间和工作频率都依据种子类型而定。本具体实施方式
能避免农杆菌介导法等所需的较长时间的组织培养过程，节省大量的时间；且不需要贵重的仪器设备，普通 实验室即可进行操作完成。
权利要求
1.植物种胚微创非组培转化方法，其特征在于它的转化方法为: 1)、选择饱满、无机械损伤的子粒若干； 2)、将子粒于0.1 %氯化汞浸泡2分钟左右，70%酒精浸泡10分钟左右灭菌；最后用无菌水或煮沸冷却以后的自来水漂洗子粒3-5次以上，以除去子粒表面黏附的灭菌液； 3)、将灭菌种子放在一个预先灭菌的容器中，加无菌水至淹没种子为止，用透气的封口纸包裹，于摇床上120转/分28°C培养，让种子充分吸水膨胀； 4)、培养4-12小时，依据种子类型而定，停止培养，准备切胚； 5)、将吸水膨胀种子放在一个干净的器皿内，操作人员事先戴上卫生手套，用注射针在种子胚部进行穿刺，深度不超多2-4_，依据种子类型而定，穿刺使胚致伤但又不影响种子的进一步萌发； 6)、将伤胚种子进行超声波处理，超声波的功率依据种子类型而定。超声波处理后划胚的种子置于带有目的基因的质粒菌液中共培养或再次进行低功率的超声波处理，处理后的伤胚种子于摇床上震荡120转/分培养1-2天，以种子露白为准； 7)、露白种子先用无菌水或煮沸冷却以后的自来水漂洗3-5次，然后播种于事先灭菌的并用相关标记抗性基因的适当浓度的抗生素溶液浇至饱和的蛭石苗床上，进行抗性基因筛选，蛭石呈现干旱状 态时，用同样的抗生素溶液浇灌；记录播种的种子颗粒数和出苗情况，能够正常出苗的幼苗初步认定为抗生素抗性苗，称为Ttl代； 8)、3叶期，将幼苗移栽到大田进一步生长，记录移栽苗数及成活苗数，按照一般生产条件进行管理，直至收获种子； 9)、收获的种子来年播种得到下一代，称为T1代； 10),T0和T1植株在5叶期取幼嫩叶片进行PCR检测，并对PCR检测呈阳性结果的植株样品进行Southern blot杂交分析,确定是否得到转基因植株； 11)、在确定得到转基因植株及种子的基础上，进一步进行田间生物学鉴定和纯系选育。
2.根据权利要求1所述的植物种胚微创非组培转化方法，其特征在于所述的步骤5是用注射针在种子胚部进行穿刺；步骤6是将带有目的基因的质粒菌在LB培养基上培养，在菌对数生长期间停止培养；取少量菌液按梯度稀释，测0D_值，以0D_值在0.04——0.08为所需菌液浓度。超声波功率100-1000W之间进行选择，工作时间和工作频率都依据种子类型而定。
全文摘要
本发明公开了一种植物种胚微创非组培转化方法，它涉及一种基因转化方法。选择饱满、无机械损伤的子粒若干；将子粒于0.1％氯化汞浸泡2分钟后，用无菌水或煮沸冷却以后的自来水漂冲洗子粒3-5次以上；放在一个预先灭菌容器中，加无菌水至淹没种子，在摇床上培养4-6小时；将吸水膨胀种子放在一个干净的容器中，操作人员事先戴上卫生手套，用针头在种子胚部轻轻刺一下将；划胚的种子进行超声波处理，然后置于带有目的基因的质粒菌液中在摇床上共培养；发芽和出苗阶段用抗生素进行幼苗筛选。本方法能避免农杆菌介导法等所需的较长时间的组织培养过程，节省大量的时间；且不需要贵重的仪器设备，普通实验室即可进行操作完成。
文档编号C12N15/82GK103184238SQ20131011750
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月24日 优先权日2013年3月24日
发明者张丽君, 刘龙龙, 崔林, 乔治军, 孙毅, 范银燕, 周建萍, 曹利萍, 师颖 申请人:山西农业科学院农作物品种资源研究所