专利名称：快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法
技术领域：
本发明涉及雌激素与抗雌激素联合毒性效应研究技术领域，具体是涉及一种快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法。
背景技术：
环境内分泌干扰物(EDCs )在环境中普遍存在，对生态环境和人类健康造成了极大的威胁。毒理学研究发现多种EDCs同时存在时所表现出的复合效应并不是单独效应的简单叠加，而是各EDCs相互作用的结果。而现实环境中往往是多种EDCs同时存在，故尤其有必要研究EDCs间的复合效应。目前的复合效应研究中，较多的是同类EDCs间的复合效应，不同种类EDCs间复合效应研究比较缺乏，亟需加强。环境雌激素与抗雌激素能对暴露于其中的人和野生动物的内分泌系统造成极大的损害，它们之间的复合效应研究鲜有报道。毒理学中一般采用体内(动物)和体外(细胞、分子等)实验来评价有毒物毒性。体外毒性方法简单，适用于药物毒性的快速评价，但试验结果常出现假象。体内毒性试验虽能较准确地反映药物的安全性，但试验周期长，用药量大。有些慢性毒性试验往往需要几个月甚至更长，不利于少量药物的快速毒性评价。斑马鱼作为一种模式生物，具有体型小，易于管理的优点，已被包括国际标准化组织ISO、USEPA、OECD以及中国环保部和农业部等各国际标准组织以及权威机构列为生态毒性测试主要鱼种之一。但是传统鱼类慢性毒性试验耗时长、费用高，无法实现反映长期效应的快速检验要求。 为此，开发出一种能够反映污染物长期效应的快速评价方法显得尤为必要。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺点，本发明提供了一种快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，该方法简单、快速、客观，仅需96h即可完成。本发明是通过以下技术方案实现的，一种快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，包括以下步骤:步骤一、斑马鱼胚胎的获取；步骤二、将雌激素与不同浓度的抗雌激素进行混合形成不同配比的暴露液，再将所述斑马鱼胚胎放入所述暴露液中，持续暴露96h，水温维持在26±1°C，光周期为白天16h和夜间8h，暴露液每24h换80%，并记录斑马鱼胚胎的孵化率、畸形率及孵化时间，暴露结束后，收集幼鱼保存；步骤三、在胚胎发育形态学水平和/或基因转录水平上评价复合效应。优选的，在所述步骤一中，斑马鱼胚胎的获取的具体步骤为:将雌雄鱼以1:1或1:2比例配对，放入斑马鱼专用孵化盒，用隔板将所述雌雄鱼隔开，12小时后将亲鱼置于光照下产卵，产卵结束用吸管吸出鱼卵，镜检是否受精，2 5ppm亚甲基蓝溶液消毒30min。优选的，在所述步骤二中，所述雌激素为17β-雌二醇或o，p’ -DDT，进一步优选的，所述17 β -雌二醇的浓度为0.25 μ g/L，所述ο，p’ -DDT的浓度为100 μ g/L。优选的，在所述步骤二中，所述抗雌激素为它莫西芬，进一步优选的，所述它莫西芬的浓度分别为10 μ g/L、50 μ g/L和250 μ g/L。优选的，在所述步骤二中，还设置有稀释水对照组。优选的，在所述步骤二中，所述胚胎用超纯水冲洗后放入所述暴露液。与现有技术相比，本发明的有益效果如下:利用斑马鱼胚胎研究有毒物对有机体毒性效应的试验方法具有独特的优势，其主要特点和优势有:在实验室条件下，斑马鱼可实现全年产卵，且一次产卵量大，可提供样品多；斑马鱼胚胎透明，易于观察和操作；斑马鱼胚胎阶段对有毒物敏感；斑马鱼胚胎试验可顺应伦理要求。特别是在环境中内分泌干扰物研究方面，由于环境中内分泌干扰物常以低浓度形式存在，不能产生明显的致死效应，因此斑马鱼胚胎具有的优势更加明显，因此，利用斑马鱼胚胎评价雌激素与抗雌激素的复合效应，具有简单、快速、客观的优点。
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1是17 β_雌二醇和它莫西芬共暴露的斑马鱼胚胎孵化率的结果图。图2是17 β -雌二醇和它莫西芬共暴露的斑马鱼胚胎孵化时间的结果图。图3是17 β -雌二醇和它莫西芬共暴露的斑马鱼胚胎总畸形率的结果图。图4是17 β -雌二醇和它莫西芬共暴露对斑马鱼胚胎雌激素相关基因表达影响结果图·图5是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露的斑马鱼胚胎孵化率的结果图。图6是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露的斑马鱼胚胎孵化时间的结果图。图7是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露的斑马鱼胚胎总畸形率的结果图。图8是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露对斑马鱼胚胎雌激素相关基因表达影响结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1、应用斑马鱼胚胎评价17 β -雌二醇与它莫西芬的复合效应受试药物:17β -雌二醇(Ε2)、它莫西芬,均购自美国sigma公司。配制方法:标准品溶于0.1%丙酮配制成lg/L母液并于4°C保存，实验室用超纯水稀释至所需浓度。动物:斑马鱼。试剂:RT-PCR试剂盒，购于宝生物工程(大连)有限公司。试验方法的具体步骤如下:
一、斑马鱼胚胎的获取:将10对雌雄鱼以1:1或1:2比例配对，放入斑马鱼专用孵化盒，用隔板将雌雄鱼隔开，12小时后将亲鱼置于光照下，半小时内开始产卵，产卵结束用吸管吸出鱼卵，镜检是否受精，2 5ppm亚甲基蓝溶液消毒30min ；二、暴露实验:选取的雌激素与抗雌激素混合配比为=E2为0.25 μ g/L,它莫西芬分别为10 μ g/L,50 μ g/L和250 μ g/L,同时设置稀释水对照组，每个烧杯里加入暴露液IOOmL,每浓度设三个重复，即用三个烧杯，把用超纯水冲洗过后的胚胎小心放入暴露液，每个烧杯20颗胚胎，暴露时间持续96h。水温维持在26±1°C，光周期为16:8h(昼:夜)，暴露液每24h换80%，期间及时清除死卵，并记录其孵化率、畸形率及孵化时间，暴露结束，每个样品收集8 15尾幼鱼至ImL EP管里并放入_80°C冰箱保存备用；三、复合效应的评价:1、形态学水平的评价:将胚胎置于显微镜下进行观察，并记录现象，观察的时间点选择在72h 96h，在观察过程中，发现死卵要及时的挑出，48h后可以观察到黑色素沉着、畸形情况，72h后可以观察到孵化情况等，终点可观察的指标有:孵化率，心包囊肿、尾巴弯曲、脊柱弯曲等畸形情况；·数据以孵化率、孵化时间、畸形率表示；(I)孵化率=孵化的斑马鱼胚胎数量/总的斑马鱼胚胎数量X 100%(2)孵化时间以72h之后，每两个小时记一次孵化出壳的情况(3)畸形率=畸形斑马鱼胚胎的数量/总的斑马鱼胚胎数量X 100%将三次平行组的实验结果进行ANOVA统计分析，表示为平均值+SD，与相应的对照组相比，P〈0.05为有显著性差异，P〈0.01时为极显著差异，a, b代表两组之间差异显著；2、基因转录水平的评价:(I)RNA的提取与反转录:用超声波处理器对幼鱼样品进行粉碎处理，然后用RNA提取试剂盒抽提斑马幼鱼总RNA，用紫外分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度，0D260/280 一般要求在1.8 2.2之间；反转录反应:取500ng总RNA、0.5 μ L的50 μ Moligo_dT、0.5 μ L 的 50 μ M random6mers、2 μ L 缓冲液和 0.5 μ L 反转录酶，用 RNaseFreedH20稀释成10 μ L体系，混匀，37°C反应15min，再85°C 5s使反转录酶失活，然后I μ L的RT反应液将直接用于下一步的PCR反应；(2)基因表达分析:实时定量PCR用的是ABI St印one荧光定量PCR仪，雌激素响应基因和管家基因β-actin的引物参照本领域常规技术手段。基因扩增的特异性由熔解曲线保证，目的基因mRNA通过它与β -actin mRNA的比率表示其表达水平，PCR反应条件为95°C预变性30s，PCR循环如下:95°C变性5s，60°C延伸34s, 40个循环，用2-ΛΛ Ct方法计算得到的Ct值来分析基因的相对表达量；(3)数据分析:将三次平行组的实验结果进行ANOVA统计分析，表示为平均值+SD，与相应的对照组相比，p〈0.05为有显著性差异，P〈0.01时为极显著差异，a，b代表两组之间
差异显著；结果表明:在形态学水平上，雌激素E2与抗雌激素它莫西芬暴露之后，对胚胎的发育毒性比二者单独作用要强，如图1、图2和图3所示；但在基因转录水平上雌激素E2与它莫西芬体现出相互拮抗的效应，如图4所示。实施例2、应用斑马鱼胚胎评价O，p’ -DDT与它莫西芬的复合效应
受试药物:o, p’-DDT、它莫西芬,均购自美国sigma公司。配制方法:标准品溶于0.1%丙酮配制成lg/L母液并于4°C保存，实验室用超纯水稀释至所需浓度。动物:斑马鱼。试剂:RT-PCR试剂盒，购于宝生物工程(大连)有限公司。试验方法:同实施例1的试验方法相比，区别在于选取的雌激素与抗雌激素混合配比为:o，p，-DDT 为 100 μ g/L，它莫西芬分别为 10 μ g/L、50 μ g/L 和 250 μ g/L。试验结果:在胚胎发育形态学水平上，O, p’ -DDT与它莫西芬没有表现出任何中和或者平衡的效应，而是出现一定程度上毒性加和效应，如图5、图6和图7所示；在基因转录水平上，ο, p’ -DDT与它莫西芬共暴露组中，它莫西芬很好地显示了其选择性雌激素受体调节物的特性:浓度低时与O，p’ -DDT竞争雌激素受体(ER)，起到拮抗作用；高浓度时还可以通过与ER的结合诱导相关基因的表达，起到弱雌激素的作用，并不完全拮抗O，P’ -DDT，如图8所示。上述实施例的结果表明，用斑马鱼胚胎来评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法简单、快速、客观，仅需96h，是一种快速评价雌激素与抗雌激素间复合效应的新方法。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的 质内容。
权利要求
1.一种快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、斑马鱼胚胎的获取； 步骤二、将雌激素与不同浓度的抗雌激素进行混合形成不同配比的暴露液，再将所述斑马鱼胚胎放入所述暴露液中，持续暴露96h，水温维持在26± 1°C，光周期为白天16h和夜间8h，所述暴露液每24h换80%，并记录所述斑马鱼胚胎的孵化率、畸形率及孵化时间，暴露结束后，收集幼鱼保存； 步骤三、在胚胎发育形态学水平和/或基因转录水平上评价复合效应。
2.根据权利要求1所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，在所述步骤一中，斑马鱼胚胎的获取的具体步骤为:将雌雄鱼以1:1或1:2比例配对，并放入斑马鱼专用孵化盒，用隔板将所述雌雄鱼隔开，12小时后将亲鱼置于光照下产卵，产卵结束用吸管吸出鱼卵，镜检是否受精，2 5ppm亚甲基蓝溶液消毒30min。
3.根据权利要求1所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述雌激素为17β-雌二醇或o，p’ -DDT。
4.根据权利要求3所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，所述17 β -雌二醇的浓度为0.25 μ g/L。
5.根据权利要求3所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，所述ο, p，-DDT的浓度为100 μ g/L。
6.根据权利要求1所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述抗雌激素为它莫西芬。
7.根据权利要求6所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，所述它莫西芬的浓度分别为 ο μ g/L,50 μ g/L和250 μ g/L。
8.根据权利要求1所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，在所述步骤二中，还设置有稀释水对照组。
9.根据权利要求1所述的快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述斑马鱼胚胎用超纯水冲洗后放入所述暴露液。
全文摘要
本发明涉及一种快速评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法，该方法包括以下步骤斑马鱼胚胎的获取；将雌激素与不同浓度的抗雌激素进行混合形成不同配比的暴露液，再将所述斑马鱼胚胎放入所述暴露液中，持续暴露96h，水温维持在26±1℃，光周期为白天16h和夜间8h，暴露液每24h换80%，并记录斑马鱼胚胎的孵化率、畸形率及孵化时间，暴露结束后，收集幼鱼保存备用；在胚胎发育形态学水平和/或基因转录水平上评价复合效应。用斑马鱼胚胎来评价雌激素与抗雌激素复合效应的方法简单、快速、客观，仅需96h，是一种快速评价雌激素与抗雌激素间复合效应的新方法。
文档编号C12N5/073GK103243068SQ201310153409
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者王鲁梅, 向霄, 钟玲盈, 吕晶, 夏兵 申请人:上海交通大学