一种分离产氢衣藻叶绿体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离产氢衣藻叶绿体的方法。该方法包括如下步骤：1）将衣藻悬于裂解液中，加入皂素至其终浓度为0.25g/100mL；2）将步骤1）溶液置于冰上1-2min裂解衣藻细胞；3）将步骤2）溶液4℃2300g离心1min；4）用裂解液漂洗步骤3）沉淀，4℃1000-2300g离心1min，得叶绿体粗提物；5）将叶绿体粗提物悬于裂解液中；6）在离心管底层加入75%体积的Percoll，上层加入45%体积的Percoll，再在最上层加入步骤5）溶液，形成梯度，4℃4600g离心20min，在两不同体积分数的Percoll之间形成墨绿色条带；7）取出墨绿色条带，用裂解液稀释，4℃890-1000g离心2min，收集沉淀，获得所述叶绿体。实验证明，本发明方法操作简单，叶绿体产率高，用时短。
【专利说明】一种分离产氢衣藻叶绿体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种分离产氢衣藻叶绿体的方法。
【背景技术】
[0002] 藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，具有可再生、制氢 过程清洁等明显优点，有潜在的应用价值，是实现氢能可持续生产的重要途径之一。衣藻是 光合产氢的模式藻种，产氢效率高，易培养。叶绿体是光合产氢发生的细胞器，从分离纯化 的叶绿体入手分析光合产氢的过程与调控，对研究和开发光合产氢的人工模拟体系非常重 要。
[0003] 目前正常状态的衣藻细胞的叶绿体已被成功分离。但产氢的衣藻细胞发生了一些 代谢及结构变化使人们在用压力法分离缺硫产氢衣藻细胞的叶绿体时有一定困难。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种分离产氢衣藻叶绿体的方法。
[0005] 本发明所提供的分离产氢衣藻叶绿体的方法，具体可包括如下步骤：
[0006] (1)将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液（Breaking buffer)中，向其中加 入阜素（saponin),得到悬浮液1 ;
[0007] 所述皂素在所述悬浮液1中的含量为每IOOmL所述悬浮液1中含有0. 25g所述皂 素；
[0008] (2)将所述悬浮液1置于冰上搅拌l-2min (如lmin)，使所述产氢衣藻细胞裂解， 得到悬浮液2 ;
[0009] (3)将所述悬浮液2于4°C 2300g离心lmin，收集沉淀；
[0010] (4)用所述裂解缓冲液对步骤（3)所得沉淀进行漂洗，4°C 1000_2300g (如1600g) 离心lmin，收集沉淀，为叶绿体粗提物；
[0011] (5)将所述叶绿体粗提物悬浮于所述裂解缓冲液中，得到悬浮液3 ;
[0012] (6)在离心管底层加入体积分数为75%的Percoll缓冲液，在所述体积分数为 75%的Percoll缓冲液上，缓慢加入体积分数为45%的Percoll缓冲液，使两者形成明显 的Percoll梯度，再在所述体积分数为45%的Percoll缓冲液上方缓慢加入所述悬浮液3， 4°C 4600g离心20min，离心后可见位于所述体积分数为45%的Percoll缓冲液和所述体积 分数为75%的Percoll缓冲液之间的界面上有墨绿色条带；
[0013] (7)取出所述墨绿色条带，用所述裂解缓冲液(所述裂解缓冲液的体积可为取出的 所述墨绿色条带体积的3倍)稀释，4°C 890-1000g (如IOOOg)离心2min，收集沉淀，获得叶 绿体；
[0014] 在上述方法中，在步骤（7)中所述收集沉淀后，还可包括如下步骤：
[0015] (8)用所述裂解缓冲液对步骤（7)所得沉淀进行漂洗，4°C 890-1000g (如900g)离 心2min，所得沉淀即为叶绿体。
[0016] 在上述方法中，所述裂解缓冲液的pH为7. 8,溶剂为水，溶质及浓度如下：0. 3M山 梨醇（sorbitol)、50mM HEPES-K0H、5mM MgCl2。
[0017] 所述50mM HEPES-K0H是指HEPES在所述裂解缓冲液中的终浓度为50mM，KOH的量 为调节所述裂解缓冲液的PH为7. 8所需的用量。
[0018] 更加具体的，所述裂解缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：〇. 3M山梨醇 (sorbitol )、50mM HEPES、5mM MgCl2 ;用 KOH (固体）调节溶液 pH 为 7.8。
[0019] 在上述方法中，步骤（1)中，所述将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液中， 为将所述待分离的产氢衣藻细胞悬浮于所述裂解缓冲液中至所述待分离的产氢衣藻细胞 含量为5 X IO7个/mL。
[0020] 在上述方法中，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液的pH为7. 8,组成如下：体 积分数为75%的Percoll、终浓度为0. 33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-K0H、终浓度 为5mM的MgCl2，余量为水；
[0021] 所述体积分数为45%的Percoll缓冲液的pH为7. 8,组成如下：体积分数为45%的 Percoll、终浓度为0. 33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-K0H、终浓度为5mM的MgCl2, 余量为水。
[0022] 在所述体积分数为75%的Percoll缓冲液，以及所述体积分数为45%的Percoll 缓冲液中，所述终浓度为50mM的HEPES-K0H均指HEPES在所述Percoll缓冲液中的终浓度 为50mM，KOH的量为调节所述Percoll缓冲液的pH为7. 8所需的用量。
[0023] 更加具体的，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液的pH为7. 8,组成如下：体积 分数为75%的Percoll、终浓度为0. 33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES、终浓度为5mM 的MgCl2，调节溶液pH为7. 8时所需用量的Κ0Η，余量为水；
[0024] 所述体积分数为45%的Percoll缓冲液的pH为7. 8,组成如下：体积分数为45% 的Percoll、终浓度为0. 33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES、终浓度为5mM的MgCl2，调 节溶液pH为7. 8时所需用量的Κ0Η，余量为水。
[0025] 在上述方法中，步骤（6)中，所述体积分数为75%的Percoll缓冲液、所述体积分 数为45%的Percoll缓冲液，以及所述悬浮液3的体积配比为4 :5 :1。
[0026] 在本发明中，所述产氢衣藻为：将衣藻在缺硫条件下进行培养，得到的处于产氢状 态的衣藻。
[0027] 所述将衣藻在缺硫条件下进行培养的培养时间为24h以上，如24_48h，具体如24h 或 48h。
[0028] 所述将衣藻在缺硫条件下进行培养的培养液为缺硫TAP培养液，所述缺硫TAP 培养液为将正常TAP培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物。所述正常TAP培 养液的 pH 为 7. 0,组成如下：NH4ClO. 4g/L ;MgS04 · 7H20 0· lg/L ;CaCl2 · 2H20 0· 05g/L ; K2HPO4 0.108g/L;KH2P04 0 . 0 56g/L;Trisbase2.423g/L;亨特微量元素（Hunter，s trace elements)lml/L，冰乙酸lml/L，余量为水。所述亨特微量元素的pH为7. 0,组成如下：H3B04 11. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 22. Og/L, MnCl2 · 4H20 5. 06g/L, CoCl2 · 6H20 I. 61g/L, CuSO4 · 5H20 I. 57g/L，（NH4)6Mo7O24 · 4H20 I. 10g/L，FeSO4 · 7H20 4. 99g/L，余量为水。
[0029] 所述将衣藻在缺硫条件下进行培养时，所述衣藻在所述缺硫TAP培养液中的含量 为每mL所述缺硫TAP培养液中含有叶绿素总量为25 μ g的所述衣藻。
[0030] 所述将衣藻在缺硫条件下进行培养的培养温度为25°C，光强为120 μ E · m_2 · s_S 持续光照，密封培养。
[0031 ] 在本发明的一个实施例中，所述衣藻具体为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)。更加具体的，所述莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)为莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) CC400。
[0032] 实验证明，本发明所提供的分离产氢衣藻叶绿体的方法具有如下优点：
[0033] 1、简便：此方法步骤简单，涉及仪器常规，普通的生物实验室即可完成。
[0034] 2、节省时间：本方法45分钟左右可完成叶绿体的分离。
[0035] 3、产率高：传统针压法几乎很难分离到产氢衣藻的叶绿体，而本法所得叶绿体产 率最高可达32. 72%。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为莱茵衣藻CC400缺硫密闭培养细胞放氢量气相色谱图。其中，1表示缺硫密 闭培养后24小时；2表示缺硫密闭培养后48小时。
[0037] 图2为密度梯度离心纯化莱茵衣藻CC400放氢细胞叶绿体的percoll梯度照片。 其中，A为传统针压法分离产氢细胞叶绿体的密度梯度离心效果；B为本发明所提供方法分 离产氢细胞叶绿体的密度梯度离心效果。
[0038] 图3为本发明所提供方法分离的莱茵衣藻CC400放氢细胞叶绿体的电子显微镜照 片。其中，A和B为缺硫密闭培养24h细胞的叶绿体；C和D为缺硫密闭培养48h细胞的叶 绿体。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) CC400购自美国杜克大学莱茵衣藻藻种 库（Chlamy center，http://www.chlamy.org/)，其 Strain# :CC_400cwl5mt+ (详见如下网 址：http://chlamycollection. org/strain/cc-400-cwl5_mt/)〇
[0042] 培养基：
[0043] 1、正常 TAP 培养液：NH4C10. 4g/L ;MgS04 · 7H20 0· lg/L ;CaCl2 · 2H20 0· 05g/L ; K2HPO4 0.108g/L;KH2P04 0 . 0 56g/L;Trisbase2.423g/L;亨特微量元素（Hunter，s trace elements) lml/L，冰乙酸 lml/L，余量为水，pH 为 7. 0。
[0044] 2、缺硫TAP培养液：将正常TAP培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物。
[0045] 3、固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加 I. 5% (I. 5g/100mL)的琼脂粉。
[0046] 4、亨特微量兀素（Hunter，s trace elements) :H3B04 11. 4g/L，ZnSO4 · 7H20 22. Og/L, MnCl2 · 4H20 5. 06g/L, CoCl2 · 6H20 I. 61g/L, CuSO4 · 5H20 I. 57g/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H201. 10g/L，FeSO4 · 7H20 4. 99g/L，余量为水，pH 为 7. 0。
[0047] 试剂：
[0048] I、裂解缓冲液（Breaking buffer):0· 3M 山梨醇（sorbitol )，50mM HEPES-K0H，5mM MgCl2，余量为水，pH7. 8。
[0049] 配制方法如下：将 5. 4655g 山梨醇（sorbitol)、L 1916g HEPES 和 0. 1016gMgCl2 · 6H20-同用水溶解后，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH值为7.8， 再加水定容至100ml，得到所述裂解缓冲液（Breaking buffer)。
[0050] 2、5XGradient buffer :混合以下组分，溶解后加水定容至100ml。
[0051]
【权利要求】
1. 一种分离产氢衣藻叶绿体的方法，包括如下步骤： (1) 将待分离的产氢衣藻细胞悬浮于裂解缓冲液中，向其中加入皂素，得到悬浮液1 ; 所述皂素在所述悬浮液1中的含量为每lOOmL所述悬浮液1中含有0. 25g所述皂素； (2) 将所述悬浮液1置于冰上l-2min，使所述产氢衣藻细胞裂解，得到悬浮液2 ; (3) 将所述悬浮液2于4°C 2300g离心lmin，收集沉淀； (4) 用所述裂解缓冲液对步骤（3)所得沉淀进行漂洗，4°C 1000-2300g离心lmin，收集 沉淀，得到叶绿体粗提物； (5) 将所述叶绿体粗提物悬浮于所述裂解缓冲液中，得到悬浮液3 ; (6) 在离心管底层加入体积分数为75%的Percoll缓冲液，上层加入体积分数为45%的 Percoll缓冲液，形成Percoll梯度，在所述体积分数为45%的Percoll缓冲液上方加入所 述悬浮液3,4°C 4600g离心20min，离心后可见位于所述体积分数为45%的Percoll缓冲液 和所述体积分数为75%的Percoll缓冲液之间的界面上有墨绿色条带； (7) 取出所述墨绿色条带，用所述裂解缓冲液稀释，4°C 890-1000g离心2min，收集沉 淀，获得所述叶绿体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裂解缓冲液的pH为7. 8,溶剂为水， 溶质及浓度如下：〇. 3M山梨醇、50mM HEPES-K0H、5mM MgCl2。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述将待分离的产氢衣 藻细胞悬浮于裂解缓冲液中，为将所述待分离的产氢衣藻细胞悬浮于所述裂解缓冲液中至 所述待分离的产氢衣藻细胞含量为5 X 107个/mL。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述体积分数为75%的Percoll 缓冲液的pH为7. 8,组成如下：体积分数为75%的Percoll、终浓度为0. 33M的山梨醇、终浓 度为50mM的HETOS-KOH、终浓度为5mM的MgCl2，余量为水； 所述体积分数为45%的Percoll缓冲液的pH为7. 8,组成如下：体积分数为45%的 Percoll、终浓度为0. 33M的山梨醇、终浓度为50mM的HEPES-K0H、终浓度为5mM的MgCl2， 余量为水。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤（6)中，所述体积分数为 75%的Percoll缓冲液、所述体积分数为45%的Percoll缓冲液，以及所述悬浮液3的体积 配比为4 :5 :1。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述衣藻为莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)〇
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) CC400。
【文档编号】C12N1/12GK104277974SQ201310276602
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2013年7月3日
【发明者】黄芳, 孙永乐, 张锦, 陈梅 申请人:中国科学院植物研究所