杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体，属于免疫化学【技术领域】。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的杂交瘤细胞株15号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.7215。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，和10种拟除虫菊酯存在交叉反应，分别为甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯和顺式氯氰菊酯的单克隆抗体，IC50范围在3.2-50ng/mL之间；其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体，可用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，为农产品中拟除虫菊酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
【专利说明】杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株15号及其产生的能同时识别10种拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体，可用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，属于免疫化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]据统计，目前世界上已有70多种拟除虫菊酯类杀虫剂，占全世界杀虫剂市场的20%;其杀虫活力比以前提高了十倍甚至百倍；再加上拟除虫菊酯类杀虫剂对于哺乳动物和鸟类的毒性非常低，因此，拟除虫菊酯类杀虫剂的应用得到了前所未有的发展，也使农业生产获得了巨大的经济效益。然而，随之也带来了拟除虫菊酯的残留问题。尽管拟除虫菊酯类农药属于环境友好型农药，但使用不当很容易造成残留超标；污染水源、大气和土壤；通过呼吸、食物和渗入等方式进入人体，危害人类健康。据报道，长期食用拟除虫菊酯残留超标的食品，很可能会引起人类的慢性中毒，导致疾病的发生如发生皮肤瘙痒，甚至会影响下一代的健康。另外，自我国加入世贸组织以来，由于我国农产品中农残标准与欧美国家的差距较大，造成了多种具有竞争潜力的农产品包括水果、蔬菜、蜂蜜、茶叶以及大米等，屡遭国际贸易绿色壁垒的阻碍而不能出口，如茶叶中拟除虫菊酯的最高残留限量参考值(20ppm)比国外实施的标准(Ippm)高出了 20倍，严重地影响了我国的对外贸易声誉，造成了巨大的经济损失。
[0003]目前，拟除虫菊酯类农药的分析方法有比色法、色谱法、免疫分析法和传感检测技术。其中色谱法应用的最为广泛，包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱分析方法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等。然而这些方法(除了 TLC外)需要昂贵的仪器、专业的操作人员和复杂的样品净化，不适用于农产品中拟除虫菊酯 残留的日常快速检测。随着检测拟除虫菊酯免疫分析技术的发展，不仅可以解决上述问题，并且具有高通量和低成本的优势，适于现场的批量检测。建立拟除虫菊酯类农药的免疫检测技术，首先要获得拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供了杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体。
[0005]本发明的技术方案:一株分泌抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体的杂交瘤细胞株15号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.7215。
[0006]所述的杂交瘤细胞株15号产生的单克隆抗体，能够广谱性地识别10种拟除虫菊酯，且灵敏度好，半数抑制浓度(IC50)在3.2-50 ng/mL之间；
10种拟除虫菊酯为:甲氰菊酯(CAS 39515-41-8)、氯氰菊酯(CAS 52315-07-8)、高效氯氰菊酯(CAS-65731-84-2 )、氟氯氰菊酯(CAS 68359-37-5 )、高效氯氟氰菊酯(CAS91465-08-6)、氰戊菊酯(CAS 51630-58-1)、溴氰菊酯(CAS 52918-63-5)、氟胺氰菊酯(CAS102851-06-9)、苯醚氰菊酯(CAS 39515-40-7)，顺式氯氰菊酯(CAS 67375-30-8)。
[0007]所述的单克隆抗体的应用，在于在拟除虫菊酯总量检测中的应用。
[0008]本发明将半抗原I (hapten 1，结构a)通过活性酯法和血蓝蛋白偶联，用作免疫原；将半抗原2 (hapten 2，结构b)通过羧基二咪唑法和鸡卵清蛋白偶联，用作包被原。通过小鼠免疫、抗血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到稳定分泌抗拟除虫菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株15号，通过体内诱生法制备腹水，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到相应的单克隆抗体。
[0009]半抗原I (haptenI, a)和半抗原 2 (hapten2, b)的结构:
【权利要求】
1.一株分泌抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体的杂交瘤细胞株15号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7215。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株15号产生的单克隆抗体，其特征在于能够广谱性识别10种拟除虫菊酯，且灵敏度好，半数抑制浓度IC5tl在3.2-50 ng/mL之间； .10种拟除虫菊酯为:甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯，顺式氯氰菊酯。
3.权利要求2所述的单克隆抗体的应用，其特征在于在拟除虫菊酯总量检测中的应用。
【文档编号】C12N5/20GK103509757SQ201310276061
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2013年7月3日
【发明者】匡华, 陈秀金, 徐利广, 胥传来, 宋姗姗, 任国艳, 张勋, 马伟 申请人:江南大学