添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法
【专利摘要】本发明涉及添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法，包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序，在发酵培养时添加了发酵促进剂来促进发酵培养生产天然β-胡萝卜素的发酵水平。与现有技术相比，本发明在发酵培养基中添加了经过试验对比得出的多种发酵促进剂，包括表面活性剂，烷烃及三羟酸循环中部分代谢产物，金属离子、氧胁迫效应的物质，有望通过改变细胞膜的通透性，刺激呼吸和生长，以及为了提高氧气的溶解度以解决三孢布拉霉的好氧发酵需要。
【专利说明】添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生产β -胡萝卜素的方法，尤其是涉及一种添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法。
【背景技术】
[0002]在现有的技术中，中国专利CN1331343A(申请号00116698.0，申请日2000年6月22号)公开了一种发酵法生产天然β-胡萝卜素的方法，该方法是将丝状真菌的正、负菌株接种在搅拌发酵罐中培养丝状真菌发酵制备β_胡萝卜素，对搅拌桨叶的改进提高了发酵液的传质性 能，更适合菌体的生长，发酵水平可达2.0g/L，未对利用发酵促进剂提高发酵产
量进行工作。
[0003]〈无锡轻工大学学报>2003年V.22，N0.3报道了 “Mg2+对三孢布拉霉菌合成β-胡萝卜素的影响”，提出发酵48小时补加0.3g/L Mg2+，β-胡萝卜素产量为0.141g/L，而对比的胡萝卜素产量很低(仅为0.097g/L)。而在对比的β-胡萝卜素产量提高到0.305g/L时(添加Mg+2，和β-紫罗酮)时发酵产量仅提高到0.342g/L，增加的倍数远低于对比产量低的菌株，但未进行更多的发酵促进剂的组合研究，使发酵产量进一步提高，尤其是在对比产量进一步提高，即选用对比产量高的菌株时，其发酵增加的倍数将进一步减少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种在发酵工序中添加多种发酵促进剂来提高发酵法生产天然β_胡萝卜素的产量，可为现有工业生产提供提高发酵产量的方法。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，该方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序，
[0007]所述的斜面培养将丝状真菌三孢布拉霉(Blakeslea Trispora)接种在斜面培养基上，控制温度为26?28°C，培养48?96h ；
[0008]所述的种子培养是将经斜面培养的三孢布拉霉接种到种子培养基上，调节pH6.5 ?7.5，培养 16 ?24h ；
[0009]所述的发酵培养是将经种子培养的三孢布拉霉接种到发酵培养基中，控制发酵培养的温度为26?28°C、培养120?168h ；
[0010]在发酵培养时添加了发酵促进剂来提高发酵培养生产天然β-胡萝卜素的发酵水平，所述的发酵促进剂的组成成分为:镁盐0.1?0.5mmol/L,双氧水5?60 μ mol/L、表面活性剂O?llg/L、癸烷0.5?6v/v%,甲酸钠0.05?2mmol/L、柠檬酸钠0.05?2g/L，发酵促进剂在发酵培养工序中作为补充液加入。
[0011]所述的斜面培养基基质为去皮土豆，控制土豆与水的质量比为10?30: 80?130，煮沸10?25min后过滤，按质量比为I?4: 0.5?3: I?4加入葡萄糖、蛋白胨，琼脂，再加入维生素?lOppm。
[0012]所述的种子培养采用的种子培养基为柏饼粉5?15wt%，玉米粉3?8wt%，维生
素 B1S ?IOppnio
[0013]所述的发酵培养采用的发酵培养基含有玉米淀粉5?8wt%、柏饼粉1.2?
2.8wt%、植物油5.1?7.0wt%、憐酸二氢钾0.04?0.09wt%、维生素BJ?lOppm、硫酸锰0.0l?0.06wt%、非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚0.05?0.20wt%。
[0014]所述的发酵促进剂中使用的镁盐为MgCl2，所述的发酵促进剂中采用的表面活性剂为 Span20。
[0015]能够采用发酵法生产天然β_胡萝卜素的微生物有多种，其中以三孢布拉霉菌(Blakeslea Trispora)的性能最优，是国际上公认的实现工业化生产天然β_胡萝卜素的好菌株。属于真菌界真菌门(Fungi)、毛霉目、弃霉科、布氏弃霉属、三孢布拉氏弃霉(B.Trispora Thaxter),本发明所述的方法,是发酵生产天然β-胡萝卜素的菌株即为三孢布拉霉菌(Blakeslea Trispora)有正、负两种菌株,保藏于上海化工研究院菌种保藏处。
[0016]所述的丝状真菌三孢布拉霉分正、负两种菌株，分别接种到斜面培养基培养，然后将培养得到的丝状真菌三孢布拉霉正、负菌株按1:1?1: 20的比例接入种子培养基中进行培养。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0018]一、由于在发酵培养基中添加了经过试验对比得出的多种发酵促进剂，包括表面活性剂，烷烃及三羟酸循环中部分代谢产物，金属离子、氧胁迫效应的物质，有望改变细胞膜的通透性，刺激呼吸和生长 ，以及为了提高氧气的溶解度以解决三孢布拉霉的好氧发酵需要。
[0019]二、通过试验对比得出的多种发酵促进剂，由于考虑多种添加剂对发酵的交互作用有相互关系，通过试验得出了多种促进剂组分合适的添加量，增强促进因子的组合效果，使发酵产量能尽量提高。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0021]实施例1
[0022]三孢布拉霉(Blakeslea Trispora)，发酵培养基组成为淀粉8% (重量)、柏饼粉1.6% (重量)、植物油 6.6% (v/v)、KH2PO40.06% (重量)，MnSO4.H2O0.03% (重量)，调节pH为7.0，配制成的发酵培养基灭菌后接入正、负菌混合种子液，发酵50小时后，向发酵液中加入含发酵促进剂的补液，其组成为Mg2+0.25mmol/L，双氧水30 μ mol/L, Span201.0g/L、癸烷2% (v/v)、甲酸钠0.8mmol/L、柠檬酸钠0.5g/L、在27°C，转速为230rpm的摇床上发酵培养120小时后得发酵液，分析结果为发酵液中β -胡萝卜素含量2.27g/L。
[0023]对比例I
[0024]培养基配方、接入的菌种量及培养条件同实施例，不加培养促进剂，发酵液中β -胡萝卜素含量为0.99g/L。
[0025]对比例2
[0026]培养基配方、接入的菌种量及培养条件同实施例，不加培养促进剂，但在培养基中加入表面活性剂曲拉通triton0.12% (重量)，所得发酵液中β -胡萝卜素含量为1.28g/L0
[0027]实施例2
[0028]添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，该方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序，具体包括以下步骤:
[0029](I)能够采用发酵法生产天然β_胡萝卜素的微生物有多种，其中以三孢布拉霉菌(Blakeslea Trispora)的性能最优,是国际上公认的实现工业化生产天然β _胡萝卜素的好菌株。属于真菌界真菌门(Fungi)、毛霉目、弃霉科、布氏弃霉属、三孢布拉氏弃霉(B.Trispora Thaxter),本发明所述的方法,是发酵生产天然β-胡萝卜素的菌株即为三孢布拉霉菌(Blakeslea Trispora)有正、负两种菌株,保藏于上海化工研究院菌种保藏处。
[0030]将丝状真菌三孢布拉霉(Blakeslea Trispora)接种在斜面培养基上,真菌三孢布拉霉分正、负两种菌株，所采用的斜面培养基基质为去皮土豆，控制土豆与水的质量比为10: 80，煮沸IOmin后过滤，按质量比为1: 0.5: I加入葡萄糖、蛋白胨，琼脂，再加入维生素BJppm，并进过灭菌处理，斜面培养时，控制温度为26°C，培养48h ；
[0031](2)将经斜面培养的三孢布拉霉的正、负菌株按1:1的比例接接种到种子培养基中，采用的种子培养基为柏饼粉5wt %，玉米粉3wt %，维生素BJppm，并进过灭菌处理，种子培养时，调节pH至6.5，培养16h ；
[0032](3)将经种子培养的三孢布拉霉接种到发酵培养基中，控制发酵培养的温度为26°C、培养120h，采用的发酵培养基含有玉米淀粉5wt%、柏饼粉1.2wt%、植物油5.lwt%、磷酸二氢钾0.04wt%、维生素BJppm、硫酸锰0.0lwt%、非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚0.05wt%，需要注意的是，在发酵培养时需要向其中添加发酵促进剂来促进发酵培养生产天然胡萝卜素的发酵水平，发酵促进剂的组成成分为:氯化镁0.lmmol/L，双氧水5 μ mol/L、表面活性剂 Span200.5g/L、癸烷 0.5v/v%、甲酸钠 0.05mmol/L、柠檬酸钠 0.05g/L，发酵促进剂在发酵培养工序中作为补充液加入，其中的表面活性剂，烷烃及三羟酸循环中部分代谢产物，金属离子、氧胁迫效应的物质，有望改变细胞膜的通透性，刺激呼吸和生长，提高氧气的溶解度以解决三孢布拉霉的好氧发酵需要。
[0033]实施例3
[0034]添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，该方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序，具体包括以下步骤:
[0035](I)将丝状真菌三孢布拉霉(Blakeslea Trispora)接种在斜面培养基上,真菌三孢布拉霉分正、负两种菌株，所采用的斜面培养基基质为去皮土豆，控制土豆与水的质量比为20: 90，煮沸20min后过滤，按质量比为2: I: 3加入葡萄糖、蛋白胨，琼脂，再加入维生素Bjppm，并进过灭菌处理，斜面培养时，控制温度为27°C，培养72h ；
[0036](2)将经斜面培养的三孢布拉霉的正、负菌株按1: 5的比例接种到种子培养基中，采用的种子培养基为柏饼粉IOwt玉米粉7wt%,维生素Bpppm,并进过灭菌处理,种子培养时，调节pH至7，培养18h ；
[0037](3)将经种子培养的三孢布拉霉接种到发酵培养基中，控制发酵培养的温度为27°C、培养150h，采用的发酵培养基含有玉米淀粉5wt%、柏饼粉1.2wt%、植物油6.0wt磷酸二氢钾0.08Wt%、维生素Bppm、硫酸锰0.03wt%、非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚0.09wt%，需要注意的是，在发酵培养时需要向其中添加发酵促进剂来促进发酵培养生产天然胡萝卜素的发酵水平，发酵促进剂的组成成分为:氯化镁0.3mmol/L，双氧水20 μ mol/L、表面活性剂Span20 lg/L、癸烷2v/v%、甲酸钠0.8mmol/L、柠檬酸钠0.lg/L，发酵促进剂在发酵培养工序中作为补充液加入，其中的表面活性剂，烷烃及三羟酸循环中部分代谢产物，金属离子、氧胁迫效应的物质，有望改变细胞膜的通透性，刺激呼吸和生长，以及为了提高氧气的溶解度以解决三孢布拉霉的好氧发酵需要。
[0038]实施例4
[0039]添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，该方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序，具体包括以下步骤:
[0040](I)将丝状真菌三孢布拉霉(Blakeslea Trispora)接种在斜面培养基上,真菌三孢布拉霉分正、负两种菌株，所采用的斜面培养基基质为去皮土豆，控制土豆与水的质量比为30: 130，煮沸25min后过滤，按质量比为4: 3: 4加入葡萄糖、蛋白胨，琼脂，再加入维生素B1IOppm,并进过灭菌处理，斜面培养时，控制温度为28°C，培养96h ；
[0041](2)将经斜面培养的三孢布拉霉的正、负菌株按1: 20的比例接种到种子培养基中，采用的种子培养基为柏饼粉15wt %,玉米粉8wt %,维生素B1IOppm,并进过灭菌处理,种子培养时，调节pH至7.5，培养24h ；
[0042](3)将经种子培养的三孢布拉霉接种到发酵培养基中，控制发酵培养的温度为26°C、培养168h，采用的发酵培养基含有玉米淀粉8wt%、柏饼粉2.8wt%、植物油7.0wt磷酸二氢钾0.09被％、维生素B1 lOppm、硫酸锰0.06wt%、非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚0.20wt%，需要注意的是，在发酵培养时需要向其中添加发酵促进剂来促进发酵培养生产天然胡萝卜素的发酵水平，发酵促进剂的组成成分为:氯化镁0.5mmol/L，双氧水60 μ mol/L、表面活性剂Span201.5g/L、癸烧6v/v%>甲酸钠2mmol/L、朽1檬酸钠2g/L,发酵促进剂在发酵培养工序中作为补充液加入，其中的表面活性剂，烷烃及三羟酸循环中部分代谢产物，金属离子、氧胁迫效应的物质，有望改变细胞膜的通透性，刺激呼吸和生长，以及为了提高氧气的溶解度以解决三孢布拉霉的好氧发酵需要。
[0043]实施例5-16 [0044]添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，该方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序，制备工艺与实施例4相同,各组分的加入量如表I所不。
[0045]表I
[0046]
【权利要求】
1.添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法，该方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养工序， 所述的斜面培养将丝状真菌三孢布拉霉(Blakeslea Trispora)接种在斜面培养基上，控制温度为26?28°C，培养48?96h ； 所述的种子培养是将经斜面培养的三孢布拉霉接种到种子培养基上，调节PH6.5?7.5，培养 16 ?24h ； 所述的发酵培养是将经种子培养的三孢布拉霉接种到发酵培养基中，控制发酵培养的温度为26?28°C、培养120?168h ； 其特征在于，在发酵培养时添加了发酵促进剂来促进发酵培养生产天然β_胡萝卜素的发酵水平， 所述的发酵促进剂的组成成分为:镁盐0.1?0.5mmol/L,双氧水5?60 μ mol/L、表面活性剂O?llg/L、癸烷0.5?6v/v%,甲酸钠0.05?2mmol/L、柠檬酸钠0.05?2g/L，发酵促进剂在发酵培养工序中作为补充液加入。
2.根据权利要求1所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的斜面培养基基质为去皮土豆，控制土豆与水的质量比为10?30: 80?130，煮沸10?25min后过滤，按质量比为I?4: 0.5?3: I?4加入葡萄糖、蛋白胨，琼脂，再加入维生素?lOppm。
3.根据权利要求1所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的种子培养采用的种子培养基为柏饼粉5?15wt%，玉米粉3?Swt %，维生素 B1S ?IOppnio
4.根据权利要求1所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的发酵培养采用的发酵培养基含有玉米淀粉5?8wt%、柏饼粉1.2?2.8wt%、植物油5.1?7.0wt%、憐酸二氢钾0.04?0.09wt%、维生素BJ?lOppm、硫酸锰0.01?0.06wt%、非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚0.05?0.20wt%。
5.根据权利要求1所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的发酵促进剂中使用的镁盐为MgCl2。
6.根据权利要求1所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的发酵促进剂中采用的表面活性剂为Span20。
7.根据权利要求1所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然胡萝卜素的方法，其特征在于，发酵生产天然胡萝卜素的菌株为丝状真菌三孢布拉霉(BlakesleaTrispora)。
8.根据权利要求7所述的添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的丝状真菌三孢布拉霉分正、负两种菌株，分别接种到斜面培养基培养，然后将培养得到的丝状真菌三孢布拉霉正、负菌株按1:1?1: 20的比例接入种子培养基中进行培养。
【文档编号】C12P23/00GK103436584SQ201310386075
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】徐大刚, 李泓全, 董宏伟, 徐静安, 杨晔, 陈慧芳, 尹金凤, 蔡扬, 孙建春, 喻静兰, 吴欣森 申请人:上海化工研究院