一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了一种鉴定小粒种咖啡和中粒种咖啡的方法。本发明所述方法对待测咖啡进行DNA提取，然后采用SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示序列的引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若检测到条带为90bp和110bp双条带，则为小粒种咖啡，若检测到条带为90bp或100bp的单条带，则为中粒种咖啡。本发明基于SSR分子标记技术从遗传本质上对小粒种咖啡和中粒种咖啡进行了准确鉴定，解决了小粒种咖啡和中粒种咖啡鉴定困难的问题，且简单、准确、易操作。
【专利说明】一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体的说是涉及一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法。
【背景技术】
[0002]咖啡与可可、茶同列世界三大饮料作物，其产量、消费量、经济价值均占首位，是继石油之后，世界排名第二的原料型产品。种植咖啡的国家和地区已达76个，直接从业人员约2500万人，消费者达15亿人，年贸易额100~120亿美元，咖啡在世界热带农业经济、国际贸易以及人类生活中具有极其重要的作用。
[0003]咖啡为茜草科(Rubiaceae)咖啡属(Coffea)植物，该属植物共4组66种，通常所指的咖啡为真咖啡组(Eucoffea)小粒种(Coffea arabica)、中粒种(Coffea canphora)、大粒种(Coffea Iiberica)和埃塞尔萨种(Coffea excelsa)的植物,其中生产性栽培的主要为小粒种和中粒种，小粒种约占栽培面积的70%，中粒种约占30%，其它几个种主要作为种质资源保存和育种材料。
[0004]小粒种咖啡因其品质优于中粒种咖啡，其国际市场交易价格也经常是中粒种咖啡的2-3倍，在咖 啡贸易过程中常常出现将中粒种咖啡冒充小粒种咖啡进行销售的不法行为，损害消费者利益。同时，两种咖啡适合种植的生长环境不一样，小粒种适合种植于高海拔温热地带，而中粒种适合种植于低海拔的高温湿热地区，如果两种咖啡的种子或苗木发生混淆，则会造成咖啡减产并影响咖啡品质，给咖啡种植者带来很大影响。
[0005]传统的小粒种咖啡鉴别方法主要通过将咖啡培炒后进行杯品品尝，这种方法容易受主观人为因素及培炒条件等影响，鉴别结果不准确，且需要专业杯品师参与，可操作性差。现有中、小粒种咖啡鉴别技术主要包括化学分析法及DNA检测法。化学分析法主要基于两种咖啡内含特定化学物质含量存在差异，通过测定这些化学物质含量，如固醇类(F.Carrera, M.Leon-Camacho, F.Pablos, et al.Authenticationof green coffee varieties according to their sterolic profiIej Anal.Chim.Acta, 1998，370:131-139)、脂肪酸(M.J.Martin, F.Pablos, A.G.Gonzalez, M.S.Valdenebroj et al.Fatty acid profiles as discriminant parameters for coffeevarieties differentiation，2001，54:291-297)、绿原酸及咖啡因(M.J.Martin，F.Pablos, A.G.Gonzalez, Discrimination between arabica and robusta green coffeevarieties according to their chemical composition，Aalanta， 1998，46:1259-1264)等，再与标准样品进行比较鉴别，由于这类化学物质含量差异在两种咖啡中不是十分明显，且某些化学物质含量容易受栽培环境、施肥等生产环节因素的影响，检测结果很不精确，而且方法相对复杂，需要检测多种物质含量进行比对。因此，生产和销售上急需一种简便、准确的鉴别中、小粒种咖啡的检测方法。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简便、准确鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0008]一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法，对待测咖啡进行DNA提取，然后采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示序列的引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若检测到条带为90bp和IlObp双条带，则为小粒种咖啡，若检测到条带为90bp或IOObp的单条带，则为中粒种咖啡。
[0009]本发明针对目前尚未有利用SSR分子标记鉴别咖啡种类的技术空白，基于SSR分子标记技术选择两条适宜的SSR引物用于待测咖啡DNA的扩增，直接反映小粒种咖啡和中粒种咖啡在DNA水平上的遗传多态性，进而表现为两者在核苷酸序列上的差异，达到简便、准确的鉴定目的。
[0010]其中，本发明所述DNA提取方法可参照本领域常规的提取方法，也可通过购买市售的DNA提取试剂盒提取。
[0011]作为优选，所述PCR扩增体系为:
[0012]
【权利要求】
1.一种鉴定小粒种咖啡与中粒种咖啡的方法，其特征在于，对待测咖啡进行DNA提取，然后采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示序列的引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若检测到条带为90bp和IlObp双条带，则为小粒种咖啡，若检测到条带为90bp或IOObp的单条带，则为中粒种咖啡。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为:
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR为普通PCR或降落PCR0
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述普通PCR扩增程序为: 95°C预变性3min ； 95°C变性 30s、57°C复性 45s、72°C延伸 lmin，循环 35 次； 72°C 延伸 5min，4°C 保存。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述降落PCR扩增程序为: 95°C预变性3min ； 95°C变性30s、68°C复性45s、72°C延伸lmin，循环15次，每次循环后复性温度递降rc ； 95°C变性 30s、53°C复性 45s、72°C延伸 lmin，循环 25 次； 72°C 延伸 5min，4°C 保存。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述凝胶电泳检测为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用胶浓度为8%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述8%变性聚丙烯酰胺凝胶由210g尿素、Ig甲叉、39g丙烯酰胺和50mL10XTBE定容至500mL制备获得。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测以IXTBE为电泳缓冲液进行Ih的200v恒压电泳。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用银染法显影。
【文档编号】C12Q1/68GK103540663SQ201310490342
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】王晓阳, 董云萍, 闫林, 黄丽芳, 龙宇宙, 孙燕 申请人:中国热带农业科学院香料饮料研究所