一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的dna标记方法
【专利摘要】本发明提供一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，主要涉及分析生物化学【技术领域】，本发明主要设计了一对引物P1，引物序列为：上游引物F：5'—CGTGCCCAACGAACTCTT—3'；下游引物R：5'—CAGGGCGAACATGTGGA—3'，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在鸭DNA特异性地扩增出约523bp的PCR条带，再通过PCR—RFLP技术，最终观察酶切结果。本发明所提供的标记方法具有快速、灵敏、特异等优点，可在家鸭、番鸭和半番鸭群体上提供一种可靠的鉴定方法。
【专利说明】一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有效鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，属于分析生物化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]DNA分子标记是以个体间核苷酸变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体间的差异，是生物个体在DNA水平上遗传变异的直接反映，与应用表型性状、生产性能、生化标记等方法相比，更能真实的反映禽种的遗传背景和亲缘关系。利用家禽品种DNA遗传标记技术，其结果可作为鉴定家禽品种真伪的科学依据。
[0003]DNA溯源技术使用的分子标记有AFLP (扩增片段长度多态性)标记、SSR (微卫星)标记和SNP (单核苷酸多态性)标记。SNP标记是1996年美国学者提出的第三代DNA分子标记。SNP是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是可遗传的变异中最常见的一种，具有分布广密度高的特点，平均每1000个碱基便有I个SNP存在。SNP标记因分布广泛，遗传稳定，并且适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记，并逐步取代AFLP标记和SSR标记。
[0004]SNP标记是基因序列单个核苷酸发生变异而产生多态性的DNA分子标记，其是二等位基因多态，因此一个SNP理论上可以区分三个动物个体，包括两个纯合子和一个杂合子。本发明即利用SNP标记中的PCR-RFLP技术来区分家鸭、番鸭、半番鸭三类动物群体。该方法简便快捷、安全可靠、费用低廉，从本质上有效鉴定和区分家鸭、番鸭和半番鸭三类鸭群体。
[0005]目前，在雏苗市场上，·品种来源不纯、以次充好的现象时有发生，该方法的发明，对于有效解决市场上家鸭、番鸭和半番鸭品种混乱，有效保护家鸭、番鸭和半番鸭品种纯正性和优良基因的流失均具有重要意义；同时，在一定程度上可以取代番鸭活体保种，为番鸭品种资源保存提供一种最安全、最可靠、维持费用最低的保存方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种有效鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，本发明主要利用SNP标记中的PCR-RFLP技术来有效区分家鸭、番鸭、半番鸭三类动物群体。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
在含SNP酶切位点的鸭MClR基因编码区设计一对Pl引物，引物序列为:
上游引物 F: 5’ 一 CGTGCCCAACGA ACTCTT — 3’ ；
下游引物 R: 5’ 一CAGGGCGAACATGTGGA— 3’。
[0008]一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，其具体步骤包括:
Cl)静脉采血，EDTA抗凝，-20°C保存；基因组DNA试剂盒提取总DNA，端粒酶(TE)溶解，_20°C保存备用；
(2)已设计好的引物上游引物:5’一GCCAGTGAGGGCAACCAGAG — 3’下游引物:5’一CTACCAGGAGCACAGCACCA — 3’分别对家鸭、番鸭和半番鸭的DNA进行扩增；产物回收、克隆并正反向测序；应用DNAStar中的SeqMan软件对测序结果进行比对，搜索 SNP ；
(3)引物的设计
利用软件Oligo 6.0和Primer Primer5.0，在含SNP酶切位点的鸭MClR基因编码区设计一对引物P1，上游引物F与下游引物R ;预期扩增出约523bp的PCR条带；
(4)PCR扩增
利用引物Pl对番鸭、半番鸭和家鸭基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为:2 XTaq MasterMix 12.5 μ L，上游引物 F I μ L，下游引物 R lyL，模板 DNA 2μ L，补充 ddH20至终体积25yL;PCR 反应条件:94 °C 5 min，94 °C 50 s，55.5°C 35 s，72°C 40 s，共 35个循环；72 V 10 min，4 °C保存；PCR产物经质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；
(5)PCR-RFLP 检测
取扩增产物5-6μ L，加入限制性内切酶Hin6 I I μ L, IOXBuffer I μ L，加ddH20至终体积10 μ L，37°C酶切反应过夜，酶切产物用质量分数为3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000 DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio-Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型； (6)结果
利用引物Pl对3类鸭群体进行扩增、克隆测序比对，发现A399G位于限制性酶切Hin6 I的识别位点(G*CGC)，I个可用PCR-PFLP方法检测SNP的鸭MClR基因标记，即为鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法。
[0009]鸭个体基因组DNA经引物Pl扩增电泳后，得到一条亮度强、前后无非特异性带且大小与预期值吻合的523bp的目的条带(图1)，因此可继续RFLP酶切分析。扩增产物有一个Hin6 I酶切位点，将产物切为334bp和189bp两个片段，其中AA基因型显示I条带(523bp), GG基因型显示2条带(334bp+189bp),杂合子AG基因型显示3条带(523bp+334bp+189bp)。各种基因型如图2所示。
[0010]测定的家鸭品种包括北京鸭、闽农白鸭、莆田黑鸭、山麻鸭、台湾白改鸭、卡其康贝尔鸭。
[0011]本发明的优点在于:本发明方法可直接通过该DNA分子标记有效地区分家鸭、番鸭、半番鸭三类动物群体，可在家鸭、番鸭和半番鸭群体上提供一种可靠的鉴定方法，为鸭DNA基因库的长期保存和利用提供一定的技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1引物Pl扩增产物电泳结果。
[0013]图2 PCR-RFLP 酶切图谱。
【具体实施方式】
[0014]不同鸭群体基因型分布及等位基因频率见表1。由表1可知，MClR基因A399G突变位点在家鸭、番鸭群体中分布非常单一，其中闽农白鸭、莆田黑鸭、北京鸭、山麻鸭、台湾白改鸭、卡基康贝尔鸭等家鸭个体基因型全部为GG，只存在一种等位基因G ;白番鸭的基因型全部为AA，只存在一种等位基因A ;该位点在半番鸭群体中呈低度多态，基因型以AG为主(0.981)，少数为GG (0.019)，A、G等位基因相当。
[0015]本研究利用PCR-RFLP技术检测了 8个品种/群体MClR基因A399G位点的多态性，结果表明，北京鸭、闽农白鸭、莆田黑鸭、台湾白改鸭、卡其康贝尔鸭、番鸭等6个品种均表现为极端的单态分布，其中5个家鸭品种的基因型均为GG型；番鸭的基因型则全部为AA型。这表明A399G位点在家鸭、番鸭内相当保守的；但在两者间却完全不同，该位点G等位基因只出现在家鸭中，A/G突变事件并不发生在番鸭中，这为家鸭和番鸭起源于不同属提供了新的佐证，说明家鸭与番鸭进化过程的某一阶段在该位点上产生了分化，进而出现了不同的纯合基因型。在本研究中，半番鸭虽具多态性，但属极低度多态，基因型几乎全为杂合子AG型，其频率高达0.981 ；GG型只占0.019 (可忽略不计)；G等位基因频率几乎等于A等位基因，这可能与半番鸭为家鸭与番鸭属间杂交产物有关，该位点的基因型介于两亲本之间。
[0016]表1不同鸭群体基因型及等位基因频率
【权利要求】
1.一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，其特征在于: 在含SNP酶切位点的鸭MClR基因编码区设计一对Pl引物，引物序列为:
上游引物 F: 5’ 一CGTGCCCAACGA ACTCTT — 3’ ； 下游引物 R: 5’ 一CAGGGCGAA CATGTGGA — 3’。
2.一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，其特征在于:其具体步骤包括: (1)对鸭子采用颈静脉采血，EDTA抗凝，-20°C保存；基因组DNA试剂盒提取总DNA，端粒酶TE溶解，_20°C保存备用； (2)利用已设计好的引物 上游引物:5’一GCCAGTGAGGGCAACCAG AG—3'； 下游引物:5’ 一CTACCAGGAGCACAGCACCA— 3’，分别对家鸭、番鸭和半番鸭的DNA进行扩增；产物回收、克隆并正反向测序；应用DNAStar中的SeqMan软件对测序结果进行比对，搜索 SNP ； (3)引物的设计 在含SNP酶切位点的鸭MClR基因编码区设计一对引物P1，上游引物F与下游引物R ； (4)PCR扩增 利用引物Pl对番鸭、半番鸭`和家鸭基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为:2 XTaq MasterMix 12.5 μ L，上游引物 F I μ L，下游引物 R lyL，模板 DNA 2μ L，补充 ddH20至终体积25yL;PCR 反应条件:94 °C 5 min，94 °C 50 s,55.5°C 35 s，72°C 40 s，共 35个循环；72 V 10 min，4 °C保存；PCR产物经质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果；
(5)PCR-RFLP 检测 取扩增产物5-6μ L，加入限制性内切酶Hin6 I I μ L, IOXBuffer I μ L，加ddH20至终体积10 μ L，37°C酶切反应过夜，酶切产物用质量分数为3%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DL1000 DNA Marker作为分子量的标准对照，观察酶切结果，Bio-Rad凝胶成像系统观察拍照保存，由带型判断基因型； (6)结果 利用引物Pl对3类鸭群体进行扩增、克隆测序比对，发现A399G位于限制性酶切Hin6 I的识别位点，I个可用PCR-PFLP方法检测SNP的鸭MClR基因标记，即为鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的DNA标记方法，其特征在于:家鸭包括北京鸭、闽农白鸭、莆田黑鸭、山麻鸭、台湾白改鸭、卡其康贝尔鸭。
【文档编号】C12Q1/68GK103667489SQ201310676168
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】郑嫩珠, 辛清武, 缪中纬, 朱志明 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所