专利名称：鸭i型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
背景技术：
鸭I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I,DHV I)是雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病的病原。该病主要侵害4周龄以内的雏鸭，死亡率高达90%以上，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。番鸭细小病毒(Muscovy duckling parvovirus,MDPV), 是危害番鸭养殖的重要病原，可引起I周龄-3周龄雏番鸭发病，致死率可达到50% -80%。 这两种病毒是雏鸭最易感并且致死率也非常高的病毒。鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒是危害雏鸭的最重要病原，并且感染发病后致死率非常高，因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒进行检测和诊断的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光 PCR的引物组。本发明提供的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列4和序列5。本发明的另一个目的是提供检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR 的试剂。本发明提供的试剂由上述的引物组、探针A和探针B组成；所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料C ；所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料D。上述试剂中，所述报告荧光染料A为FAM，所述报告荧光染料B为ROX ;所述淬灭荧光染料C为BHQl，所述淬灭荧光染料D为BHQ2 ；所述试剂中所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比为3 : 3 : 3 : I : I : I。本发明的第三个目的是提供一种检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR试剂B。本发明提供的试剂B，由上述的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。本发明提供的试剂B，所述引物I、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为O. 6 μ M ；所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述试剂B中的浓度均为O. 2 μ Μ。本发明的第四个目的是提供一种检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B。上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒为用上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光PCR反应。本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有如下优点I)检测时间短本研究通过Primer Express 3. O软件,设计了多套探针和引物,通过分析其引物之间的二聚体，筛选出了 2套探针和引物。对筛选出的2套探针和引物进行不同浓度的配比，选出了其最佳引物和探针的浓度组合，建立了鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法实现了一管二检的目的，并且反转录和PCR是一步完成，仅需要约30分钟的时间，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3. 5小时来完成扩增反应，然后需要花2小时进行凝胶电泳来观察结果；2)检测敏感性高且特异性强当鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒同时存在时，所建立的方法对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检出及检出的敏感性。另外，建立的方法可以对样品中相应的病原含量进行定量，并且检测的敏感性非常高，均能检测到200个拷贝的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒，比常规PCR方法敏感性高10倍，可用于鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此该方法的建立对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的防治有重要意义。
图I为检测鸭肝炎病毒的敏感性及标准曲线图2为检测鸭肝炎病毒的敏感性及标准曲线图3为检测鸭I型肝炎病毒的特异性图4为检测番鸭细小病毒的特异性图5为批内重复性
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用一些材料和试剂如下Lightcycler2. O荧光定量PCR仪(Roche)。DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司；pGEM_T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自 Fermengtas 公司；0ne Step PrimeScript RT-PCR Kit 购自大连宝生物公司；TIANamp 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。鸭I型肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHV I)购自中国兽医药品监察所；番鸭细小病毒(MDPV)记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医， 2002，18 (6) :5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医， 2010,37(11) : 156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯，2008，160 (06) :30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，
(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09) :858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；实施例I、引物与Taqman探针的设计与合成根据GenBank中鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的保守序列，采用Primer Express3. O软件,设计两对特异性引物和两条Taqmam探针(表I)。表I为引物和TaqMan探针序列(5 ’ _3 ’)
引物序列MDPVl590Tgagctctttgcttcagttgct (序列 I)MDPVI642cccacgggttttctttctctt (序列 2)MDPV1613TFAM-ctctgccttccagtccggacacatct-BHQl (序列 3)DHV82ggatacccaggagtacacgtaaaac (序列 4)DHVl34ctgtcaagctgggaggtgtc (序列 5)DHVl08TR0X-cccactggctttggagctgtgcc-BHQ2 (序列 6)实施例2、荧光定量RT-PCR检测一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定I、样本的制备I)、核酸的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸭I型肝炎病毒 AV2111 (DHV I)、新城疫病毒和H9亚型禽流感的RNA，提取番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒AV1221株的DNA。2)、RNA的反转录鸭I型肝炎病毒AV2111RNA反转录合成cDNA，具体如下建立如下反转录体系， 总反应体积为20 μ L，上述I)的鸭I型肝炎病毒AV2111RNA为2yL(约20yg)，4yL 8mM MgCl2 (大连宝生物工程有限公司，产品目录号DRR0019A)，2yL 10XPCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司，产品目录号DRR0019A)，2 μ L IOmM dNTP (四种碱基)，I μ L RNA抑制剂(大连宝生物工程有限公司，产品目录号DRR0019A)，I μ L随机引物(大连宝生物工程有限公司，产品目录号DRR0019A)，I μ L AMV反转录酶(大连宝生物工程有限公司，产品目录号=DRROO19Α)，用无Rnase水加至总体积为20 μ L,离心均匀，于25°C IOmin, 42°C 60min, 95°C 5min，4°C结束，得到鸭I型肝炎病毒AV2111cDNA。2、标准品的制备分别以上述得到的鸭I型肝炎病毒AV2111的cDNA和番鸭细小病毒的DNA为模板进行 PCR 扩增，反应体系为 50 μ L (含 O. 2mmol/L dNTP、2. 5mmol/L MgCl2、0. 5 μ mol/L 引物 (分别为表2)、1. 25U Taq聚合酶、IXPCR buffer、5 μ LDNA模板)，反应条件为95°C预变性 5min，94°C 60s, 50°C 60s, 70°C 60s，35 个循环，72°C延伸 IOmin0PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pGEM-T Easy载体，阳性克隆菌(pGEM-DHV和pGEM-MDPV)送大连宝生生物技术有限公司进行测序，pGEM_DHV菌中含有的PCR产物大小为234bp，具有序列表中序列11的第1-234位核苷酸(为DHV HDHVl-GD 株的3’端的UTR序列，genbank号为FJ157179. 1，第7379-7612位核苷酸)，说明为阳性克隆，含有DHV病毒；pGEM-MDPV菌中含有的PCR产物大小为571bp，具有序列表中序列12的第1-571位核苷酸(为MDPV FM株的r印基因，genbank号为NC_006147.2，第1157-1727位核苷酸)， 说明为为阳性克隆，含有MDPV病毒；表2试验所使用弓I物序列
权利要求
1.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列4和序列5。
2.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂A，由权利要求I所述的引物组、探针A和探针B组成；所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料C ；所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料D。
3.根据权利要求2所述的试剂A，其特征在于所述报告荧光染料A为FAM，所述报告荧光染料B为ROX ;所述淬灭荧光染料C为BHQl ；所述淬灭荧光染料D为BHQ2 ；所述试剂中所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B 的摩尔比为3 : 3 : 3 : I : I : I。
4.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR试剂B，由权利要2或3所示的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。
5.根据权利要求4所示的试剂B，其特征在于所述引物I、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为0. 6 y M ;所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述试剂B中的浓度均为0. 2 y M。
6.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂盒，包括权利要求I所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4或5所述的试剂B。
7.权利要求I所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4或5所述的试剂B或权利要求6所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒产品中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒为用权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4 或5所述的试剂B或权利要求6所述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一种鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本发明提供了检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有检测时间短、灵敏度高和特异性强的特点。
文档编号C12N15/11GK102586487SQ201210069199
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所