专利名称：鸭源副粘病毒弱毒lc株及其在制备疫苗上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸭源副粘病毒病弱毒LC株及其在制备疫苗上的应用。
背景技术：
副粘病毒(APMV)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属，目前已确定有 9个血清型，即从APMV-I到APMV-9，其中APMV-I是禽类最重要的病原体，新城疫病毒为 APMV-I的代表种。以往的研究报道水禽(鸭、鹅)对致病性禽副粘病毒1型(APMV-I)具有 极强的抵抗力，仅表现为带毒。然而2000年以来陆续见半番鸭、肉鸭和地方品种鸭发病的 报道，目前该病在我国养鸭地区以零星发生为主，发病率20 40 %，病死率约25 % 30 %， 给养鸭业造成一定的经济损失。为有效防制该病，福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物 病毒研究室开展了该病病原、诊断和防治研究，我们从番鸭、半番鸭和鹅体内分离到病毒 (PMV)，并进行了全面系统的鉴定，发现不同品种鸭人工感染的发病率(达90%以上)和病 死率(达60以上)明显高于野外自然发病鸭群，并确认该病毒为鸭副粘病毒。在此基础上， 我们筛选到5株抗PMV杂交瘤细胞株并制备了相应的腹水，建立了免疫荧光诊断方法，能快 速准确诊断鸭副粘病毒病；同时应用生物技术传代致弱选育出一株鸭副粘病毒弱毒株，该 弱毒已失去对一日龄雏番鸭的致病性，免疫原性良好，以此弱毒株(已保藏于CCTCC)为种 毒已研制成适宜于不同生产用途鸭群应用的新型疫苗，可有效预防该病。
发明内容
本发明的任务是提供鸭副粘病毒病弱毒株及其在制备疫苗上的应用，本发明的任 务是通过如下技术方案来实现的一种来源于人工致弱的鸭源副粘病毒弱毒LC株(PMV-LC株)，保藏在位于中国武 汉大学内的中国典型培养物保藏中心一以下简称CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏编 号=CCTCC NO :V201018o本发明以鸭源副粘病毒弱毒LC株(PMV-LC株)为种毒，应用SPF鸡胚成纤维细 胞转瓶培养技术增殖病毒，分别用于制备活疫苗、新型佐剂灭活疫苗和免疫刺激复合物亚 单位疫苗。本发明涉及鸭源副粘病毒弱毒LC株的致弱选育及其在制备鸭源副粘病毒病活 疫苗、佐剂灭活疫苗和亚单位疫苗上的应用(1)鸭源副粘病毒病活疫苗的制备方法为取 PMV-LC株经SPF鸡胚成纤维细胞培养增殖病毒，收获PMV-LC细胞毒与冻干保护剂混合后冷 冻干燥而成；该活疫苗具有成本低廉、免疫原性好、免疫力产生快等特点，适用于鸭副粘病 毒病暴发流行地区的商品鸭免疫预防和紧急接种。(2)鸭源副粘病毒病新型佐剂灭活疫苗 的制备方法为以终浓度为0. 1 %甲醛灭活PMV-LC细胞毒后，与适宜比例的佐剂ISA15A混 合制备而成；制备的鸭副粘病毒病新型佐剂灭活疫苗适用于非疫区商品鸭和种鸭的免疫预 防，也可用于制备高免精制卵黄抗体的免疫原。(3)鸭源副粘病毒病ISCOM亚单位疫苗的制 备方法为取HA效价> 2_8_°的PMV-LC细胞毒，经浓缩和提取病毒囊膜蛋白为免疫原，应用新 型佐剂QuilA和离心透析相结合研制而成。制备的鸭副粘病毒病亚单位疫苗不受母源抗体的干扰作用，加强免疫后能产生高效价的保护抗体，适用于父母代种鸭场鸭副粘病毒病的 预防。本发明适于GMP条件下大规模生产鸭副粘病毒病新型疫苗。
图1是PMV-LC亚单位疫苗电镜下形态。
具体实施例方式以下结合实施例及实验数据进一步说明本发明。(但不是对本发明的限制)。来源于人工致弱的鸭源副粘病毒弱毒LC株(PMV-LC株)是利用鸭源副粘病毒强 毒株经番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞交替传代等生物技术人工选育致弱而成，具有 自主知识产权。PMV-LC株已失去对一日龄雏番鸭的致病性，并具有如下特性(1)病毒效价 PMV-LC株经尿囊腔接种对9日龄鸡胚ELD5tl彡10_4 5/0. 1ml，尿囊液HA效价彡2_8_° ；对鸡胚 成纤维单层细胞TCID50彡IO-5 VO. Iml ； (2)安全性用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽 腿部肌肉注射毒种原液0. 2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性一日龄健康敏感 雏番鸭，腿部肌肉注射0. 2毫升，接种后7天对强毒攻击的保护率90%以上。2.根据上述的鸭源副粘病毒弱毒LC株(PMV-LC株)在制备疫苗的应用有如下技 术内容2. 1活疫苗的制备方法取上述的PMV-LC株为种毒，同步接种SPF鸡胚成纤维细 胞(CEF)，37°C旋转培养增殖病毒，至细胞病变达75%以上，收获PMV-LC细胞毒。测定病 毒含量TCID50和HA, PMV-LC对CEF单层细胞TCID50彡1(Γ5 5/0· lml, HA效价彡2-8.0时，将 PMV-LC与等量冻干保护剂混合后冷冻干燥而成。制备的鸭副粘病毒病活疫苗具有成本低 廉、免疫原性好、免疫力产生快等特点，适用于该病暴发流行地区的商品鸭免疫预防和紧急 接种。2. 2在制备佐剂灭活疫苗的应用取上述PMV-LC株为种毒，同步接种SPF鸡胚成 纤维细胞(CEF)，37°C旋转培养增殖病毒，至细胞病变达75%以上，收获PMV-LC细胞毒。测 定病毒含量TCID50和HAjPMV-LC对CEF单层细胞TCID50彡ΚΓ5.5/。· 1ml，HA效价彡2"8·0时， 在PMV-LC细胞毒中加入甲醛使其终浓度达0. 1%，37°C作用24小时，按8. 5 1.5的比例 与佐剂ISA15A混勻。制备的鸭副粘病毒病新型佐剂灭活疫苗，与活疫苗相比具有更好的 安全性，不受母源抗体的干扰作用，加强免疫后能产生高效价的保护抗体，但成本较活疫苗 高、免疫力产生期慢，适用于非疫区商品鸭和种鸭的免疫预防，也可用于制备高免精制卵黄 抗体的免疫原。2. 3在制备免疫刺激复合物亚单位疫苗的的应用取上述的PMV-LC株为种毒，接 种SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)增殖病毒，并浓缩和提取病毒囊膜蛋白为免疫原，应用新型佐 剂QuilA和离心透析相结合的免疫刺激复合物新技术研制而成。研制的鸭副粘病毒病新型 亚单位疫苗具有更好的安全性，加强免疫后能产生高效价的保护抗体，且能区分野毒感染 和免疫接种抗体，但成本高，适用于父母代种鸭场鸭副粘病毒病的预防。3.如何提高病毒效价和免疫效果是降低生产成本和本发明要解决的关键，为此， 本发明进一步采取如下措施3. 1病毒增殖工艺的改进首先，选择10 11日龄发育良好的SPF鸡胚制备CEF，比常规选用9日龄鸡胚可提高细胞产量40%且不影响病毒效价，进而降低了生产成本；其 次，采用鸡胚成纤维细胞同步接种PMV-LC种毒的方法，可节省50%的血清和培养液用量； 第三，采用转瓶培养技术，提高单位体积培养液中的病毒效价。3. 2应用PMV-LC株制备的不同疫苗免疫效果3. 2. 1鸭副粘病毒病活疫苗(PMV-LC活疫苗)的免疫效果从表1可知，安全性试 验结果显示，一日龄雏番鸭超剂量接种PMV-LC活疫苗后观察25天，均未见发病死亡，且饮 食欲、精神状态和生长发育均正常。效力试验结果显示，一日龄雏番鸭于1日龄肌注免疫不 同剂量免疫后7天攻PMV强毒，免疫鸭均能获得有效保护，而对照鸭的发病率和死亡率分别 达 70%禾口 50%。表1 PMV-LC活疫苗对一日龄雏番鸭和种番鸭的免疫效果
权利要求
来源于人工致弱的鸭源副粘病毒弱毒LC株，保藏在CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCC NOV201018。
2.权利要求1所述的鸭源副粘病毒弱毒LC株在制备鸭源副粘病毒病活疫苗上的应用。
3.权利要求1所述的鸭源副粘病毒弱毒LC株在制备佐剂灭活疫苗上的应用。
4.权利要求1所述的鸭源副粘病毒弱毒LC株在制备亚单位疫苗上的应用。
全文摘要
本发明涉及一种来源于人工致弱的鸭源副粘病毒弱毒LC株，保藏在CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCC NOV201018；本发明还包括所述的鸭源副粘病毒弱毒LC株在制备鸭源副粘病毒病活疫苗、在制备佐剂灭活疫苗和在制备亚单位疫苗上的应用。本发明适于GMP条件下大规模生产鸭副粘病毒病新型疫苗。
文档编号C12N7/00GK101979513SQ20101027824
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者俞伏松, 朱小丽, 林锋强, 王劭, 程晓霞, 陈仕龙, 陈少莺, 黄梅清 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所