专利名称：一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术：
2010年4月以来，我国主要蛋鸭养殖区福建、山东、浙江、上海、江苏等地陆续暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。在疫病流行初期，根据主要病变和临床特点，将该流行性疾病称为鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0)。随着病原学研究的深入,该病被确诊是由一种新型黄病毒(Duck Flavivirus)-鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)引起。2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”(朱丽萍，颜世敢.鸭坦布苏病毒研究进展.中国预防兽医学报，2012，1，第34卷，第I期:79-82.)。我们从某大型鸭场的发病种鸭群中分离到一株病毒，经初步鉴定该病毒为有囊膜的RNA病毒。RT-PCR扩增测序显示该病毒与黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒亲缘关系最近，随将该原称为黄病毒(Duck Flavivirus)的病毒称为鸭坦布苏病毒。
鸭坦布苏病毒病的发生在我国为首次报道，截至目前，许多单位对其已经进行了为期2年的研究，主要包括病原分离、生物学特性分析、检测方法建立等。疫苗的研制开发仍被列为控制该疾病的首选措施。
目前鸭坦布苏病毒灭活疫苗的研制主要以鸡胚、鸭胚、转瓶培养细胞作为病毒扩繁和抗原制备材料，申请人已经于2011年8月31日提交了灭活疫苗的发明专利申请，申请号为201110254517.X。由于这些原材料及生产方法虽然操作技术要求低、工艺成熟稳定，但操作劳动强度较大，生产效率低，疫苗批间差异大，不适应当前疫苗的大规模生产。利用搅拌式生物反应器进行鸭坦布苏病毒灭活疫苗大规模生产，是一个新的研究方向。发明内容
本发明的目的在于提供一种应用生物反应器培养敏感细胞，生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法。本发明所用的生物反应器为搅拌式生物反应器，培养方式是向生物反应器内接种种子细胞，培养到一定密度后，接种病毒，收获病毒液。本发明的优点是使鸭坦布苏病毒灭活疫苗的生产过程机械化、易于自动控制，该生产方法效率高、副产物少，疫苗的副反应小，与传统的转瓶工艺相比，毒液病毒含量高，病毒滴度可提高0.5 1.0TCID5cZml，疫苗质量稳定。
本发明的技术方案
1.一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法是将VeiO细胞或BHK细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料，采 用生物反应器培养至致密单层或3X 106/ml时，接种鸭坦布苏病毒强毒株逐级放大培养后经过灭活、乳化制备出一种鸭坦布苏病毒灭活疫苗。
2.本发明涉及到一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法，选择鸭坦布苏病毒(Duck Tembusuvirus,)强毒WFG36株作为生产用毒种，该病毒株，即为原黄病毒(DuckFlavivirUS)WFG36株，该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为:CGMCCN0.4718。
具体实施方式
1.一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤:
(I)用微载体培养细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料
将微载体和生物反应器灭菌后，加入细胞生长液。其中，微载体为Cytodex系列微载体(GE公司生产)，使用密度为2 25g/L ;接种制苗用细胞进行悬浮培养，待微载体上的细胞形成致密单层后，接种鸭坦布苏病毒生产毒株，病毒接种量为0.1 1.0Μ0Ι，并继续培养，制苗用细胞为对鸭坦布苏病毒病毒株敏感的细胞，VeiO细胞和BHK细胞。其中，制苗用细胞采用5L 30L或5L 30L 150L逐级放大的培养模式，于30L或150L生物反应器培养鸭坦布苏病毒。
培养过程中每天观察细胞病变情况，待细胞病变达到80%以上时，收获病毒液，保存于-20°C。
生物反应器设定参数为:pH:7.0 7.4、温度:36.5 37°C、溶氧:30% 60%、搅拌速度:30 90r/min。
(2)用纯悬浮培养细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料在灭菌的生物反应器内加入细胞生长液，接入制苗用细胞进行悬浮培养，待细胞密度达到3 X 106/ml，细胞活力在93%以上时，接种鸭坦布苏病毒病毒株，病毒接种量为0.1 1.0MOI(感染复数)，并继续培养，制苗用细胞为对鸭坦布苏病毒病毒株敏感的悬浮培养BHK细胞。其中，制苗用细胞采用5L 30L或5L 30L 150L逐级放大的培养模式，于30L或150L生物反应器培养鸭坦布苏病毒。
培养过程中每天观察细胞活力变化情况，待细胞活力下降到20%以下时，收获全悬浮病毒液，保存于_20°C。
生物反应器设定参数为:pH:7.0 7.4、温度:36.5 37°C、溶氧:30 60%、搅拌速度:30 90r/min。
(3)病毒液抗原含量
制备的抗原应按《中国兽药典》(中国兽药典委员会中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011，本发明简称《中国兽药典》)附录逐瓶作无菌检验，并抽样I份测定病毒含量(TCID5tl),应无菌生长，每0.1ml病毒含量应> IO6 0TCID500
(4)病毒液灭活
向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液(或丙内酯或二乙烯亚胺)，摇匀后置于37 °C进行灭活。
(5)油乳剂灭活疫苗制备
将配苗用的油相(注射用白油94份、加司本-806份、硬脂酸铝2份)和水相(灭活抗原96份、吐温-804份)制备完成后，按油相与水相2: I份的配比比例置于乳化罐中进行乳化，乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟,应不出现分层。乳化完成后进行无菌分装，即可得到成品疫苗。
2.鸭出血性卵巢炎灭活疫苗检验标准
(I)性状:外观乳白色乳剂。
剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均应不扩散。
稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。
黏度用Iml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应在8秒以内。
(2)无菌检验:按《中国兽药典》规定的方法进行，应无菌生长。
(3)安全检验:取I 2周龄SPF鸭10只，分别颈背皮下或肌肉注射疫苗1ml，观察14天，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。
(4)效力检验:取10只7 10日龄SPF雏鸭，平均分为两组，5只作为试验组，5只作为空白对照组，试验组每只颈背皮下注射疫苗0.3ml，接种后21天，用鸭黄病毒强毒攻毒，点眼、滴鼻0.2ml/只，肌注0.3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鸭的抗凝血，分离血浆，分别经卵黄囊接种7日龄易感鸡胚5枚，0.2ml/胚，接种后观察7天，试验组应至少4只病毒分离阴性，对照组应至少4只病毒分离阳性。
(5)甲醛、汞类防腐剂残留量测定:分别按《中国兽药典》规定的方法进行，应符合兽用生物制品通则的规定。
本发明涉及的微生物资源信息
选择鸭坦布苏病毒(Duck Tembusuvirus, DTMUV)强毒WFG36株作为生产用毒种，该病毒株，即为原黄病毒(Duck Flavivirus) WFG36株,该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为:CGMCCN0.4718。
本发明的积极意义
—种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法。本发明米用生物反应器培养技术进行细胞的高密度培养，生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控，保证了产品质量的均一、稳定；生产中可节省人力、物力，降低生产成本；生产的毒液病毒 含量较高，批间差异小，副反应减少。实施例
以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
鸭坦布苏病毒灭活疫苗的制备
生物反应器:14L和40L搅拌式生物反应器，生物反应器设定参数为:pH:7.0、温度:36.5°C、溶氧:50%、搅拌速度:60r/min ；
微载体:Cytodexl (GE公司生产)
鸭坦布苏病毒:WFG36株，一株鸭黄病毒(Duck Flavivirus)WFG36株，该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为:CGMCCN0.4718 ；
细胞生长液:含10%胎牛血清的DMEM/F12 (GIBC0公司生产)
病毒维持液:含5%胎牛血清的DMEM (GIBC0公司生产)
细胞培养:
(I)在14L生物反应器中按照15g/L的浓度加入Cytodex-Ι，灭菌；
(2)加入Vero细胞进行培养，每天观察；
(3)待14L生物反应器细胞密度达3.0X 106/ml时，将长满细胞的微载体收集到密闭容器中，接种到40L生物反应器；
(4)待40L生物反应器细胞密度达2.5X 106/ml时，接种鸭坦布苏病毒WFG36株，病毒接种量为0.5M0I，继续培养；
(5)待细胞病变达到80%以上时，收获病毒液，保存于_20°C。
病毒液抗原含量测定:制备的抗原抽样I份测定病毒含量(TCID5tl),每0.1ml病毒含量为 IO6-65TCID500
病毒液灭活:向检验合格的病毒液中加入0.2%的甲醛溶液，摇匀后置于37°C进行灭活。
油乳剂灭活疫苗制备:
将配苗用的油相·(注射用白油94份、加司本-806份、硬脂酸铝2份)和水相(灭活抗原96份、吐温-804份)制备完成后，按油相与水相2: I份的配比比例置于乳化罐中进行乳化，乳化后，取IOml以3000r/min离心15分钟,未出现分层。乳化完成后进行无菌分装，即可得到成品疫苗。
实施例2
鸭坦布苏病毒灭活疫苗的制备
生物反应器:14L和40L搅拌式生物反应器，生物反应器设定参数为:pH:7.0 7.4、温度:36.5 37°C、溶氧:30 60%、搅拌速度:30 90r/min ；
微载体:Cytodexl；
鸭坦布苏病毒:WFG36株；
细胞生长液:含10%胎牛血清的DMEM/F12 ()
病毒维持液:含5%胎牛血清的DMEM (购自GIBCO公司)
细胞培养:
(I)在14L生物反应器中按照15g/L的浓度加入Cytodex-1，灭菌；
(2)加入BHK细胞进行培养，每天观察；
(3)待14L生物反应器细胞密度达3.0X 106/ml时，将长满细胞的微载体收集到密闭容器中，接种到40L生物反应器；
(4)待40L生物反应器细胞密度达2.5X 106/ml时，接种鸭坦布苏病毒WFG36株，病毒接种量为0.5M0I，继续培养；
(5)待细胞病变达到80%以上时，收获病毒液，保存于_20°C。
病毒液抗原含量测定:制备的抗原抽样I份测定病毒含量(TCID5tl),每0.1ml病毒含量为 IO6-68TCID500
病毒液灭活:向检验合格的病毒液中加入0.2%的甲醛溶液，摇匀后置于37°C进行灭活。
油乳剂灭活疫苗制备:
将配苗用的油相(注射用白油94份、加司本-806份、硬脂酸铝2份)和水相(灭活抗原96份、吐温-804份)制备完成后，按油相与水相2: I份的配比比例置于乳化罐中进行乳化，乳化后，取IOml以3000r/min离心15分钟,未出现分层。乳化完成后进行无菌分装，
即可得到成品疫苗。
实施例3
鸭出血性卵巢炎灭活疫苗成品检验
本例中检验的疫苗是按本发明提供的技术方案制备的。
性状外观疫苗均为乳白色乳剂。
剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均不扩散。
稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底均无水相析出。
黏度用Iml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，均在8秒以内。
无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行，均无菌生长。
安全检验取2周龄SPF鸭10只，分别颈背皮下或肌肉注射疫苗1ml，观察14天，均无由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应，具体结果见表I。
表I疫苗安全检验结果
权利要求
1.一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法，其特征在于是将Vero细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料，采用生物反应器培养至致密单层或3X 106/ml时，接种鸭坦布苏病毒强毒株逐级放大培养后经过灭活、乳化制备出一种鸭坦布苏病毒灭活疫苗。
2.如权利要求1所述一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法，其特征在于生产用毒种是选择鸭坦布苏病毒强毒株WFG36株，该病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为:CGMCCN0.4718。
3.如权利要求1所述一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法，其特征在于生产用BHK细胞作为病毒繁殖及抗原 制备用材料。
全文摘要
一种大规模生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗的方法。本发明采用生物反应器培养技术进行细胞的高密度培养，生产鸭坦布苏病毒灭活疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控，保证了产品质量的均一、稳定；生产中可节省人力、物力，降低生产成本；生产的毒液病毒含量较高，批间差异小，副反应减少。
文档编号C12R1/93GK103143009SQ20131007235
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者鲍海忠, 王蕾, 徐龙涛, 张青婵, 吴昊, 巩志宏, 李晓静, 彭建云, 张中波, 陈茹, 张丹 申请人:齐鲁动物保健品有限公司