以计算方式优化的h3n2、h2n2和b型流感病毒的广泛反应性抗原的制作方法
【专利摘要】本文描述了用于引起针对流感病毒分离株的广泛反应性免疫应答的优化的H3N2、H2N2和B型流感HA多肽的产生。基于H3N2、H2N2和B型流感分离株，通过一系列的HA蛋白比对和随后的共有序列产生，开发了优化的HA多肽。本文提供了优化的H3N2、H2N2和B型流感HA多肽以及包含所述HA多肽的组合物、融合蛋白和VLP。本文还提供了编码所述HA多肽的密码子优化的核酸序列。本公开内容还提供了在受试者中引起针对流感病毒的免疫应答的方法。
【专利说明】以计算方式优化的H3N2、H2N2和B型流感病毒的广泛反应性抗原
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2012年2月7日提交的美国临时申请N0.61/596，014的优先权，所述临时申请以引用的方式全文纳入本文。
【技术领域】
[0003]本公开内容涉及可引起针对H3N2、H2N2或B型流感病毒的广泛反应性的免疫应答的优化的流感血凝素蛋白及其作为疫苗的用途。
【背景技术】
[0004]流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的成员。有三个亚型的流感病毒，命名为A型流感、B型流感和C型流感。所述流感病毒粒体含有分段的负义(negativesense)RNA基因组，所述基因组编码以下蛋白:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(Ml)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白I (PBl)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2 (NS2)。HA、NA、M1和M2为膜相关蛋白，而NP、PB1、PB2、PA和NS2为核衣壳相关蛋白。Ml蛋白是流感颗粒中最丰富的蛋白质。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，负责病毒吸附和病毒颗粒侵入细胞，并且是用于病毒中和及保护性免疫的主要免疫显性表位的来源。HA和NA蛋白都被认为是预防性流感疫苗的最重要组分。
[0005]每年，季节性流感仅在美国就导致超过300，000例入院和36，000例死亡(Simonsen et al., Lancet Infect Dis 7:658-66，2007)。2009年新型HlNl 流感病毒的出现证明了新的流感大流行可如何快速地横扫全球。H3N2流感毒株可感染鸟类和哺乳动物，并在季节性流感中H3N2流感正在变得越来越丰富。H2N2是之前已经引起人类大流行的另一种流感亚型。H2N2毒株引起了 1957年的亚洲大流行。B型流感病毒是另一种流感亚型，该病毒感染人类并代表季节性流感的一个重要病因，但是由于它的受限的宿主范围(人和海豹)，尚未得知其能够引起大流行。
[0006]目前在美国有两种获得批准的流感疫苗方法一灭活的裂解疫苗和减毒活病毒疫苗。灭活疫苗可有效地诱导体液免疫应答，但通常只有弱的细胞免疫应答。活病毒疫苗不能给予免疫妥协的或怀孕的患者，因为这些患者具有增加的感染风险。因此，存在对广泛保护性的流感病毒疫苗的需求。
【发明内容】
[0007]本文公开了用于引起针对流感病毒的广泛反应性免疫应答的以计算方式优化的H2N2、H3N2和B型流感HA多肽的产生。基于选择的H2N2、H3N2和B型流感病毒分离株，通过一系列的HA蛋白比对和随后的共有序列产生，开发了所述优化的HA多肽。
[0008]本文提供了用于引起针对H2N2、H3N2和B型流感的广泛反应性免疫应答的具有优化的氨基酸序列的重组流感HA多肽。在一些实施方案中，所述HA多肽包含:与SEQ IDNO:1至少99.6%相同、与SEQ ID N0:2至少99.4%相同、与SEQ ID N0:4至少99.7%相同、与 SEQ ID N0:5 至少 99.6%相同、与 SEQ ID N0:6 至少 98.8%相同、与 SEQ ID N0:8 至少99.7%相同、与SEQ ID N0:9至少98.4%相同、与SEQ ID NO: 10至少97.8%相同或与SEQ ID NO: 11至少98.9%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列包含:与SEQ ID NO:1相比不多于2个氨基酸置换；与SEQ ID NO: 2相比不多于3个氨基酸置换；与SEQ ID NO:4相比不多于I个氨基酸置换；与SEQ ID NO:5相比不多于2个氨基酸置换?’与SEQ ID NO:6相比不多于7个氨基酸置换；与SEQ ID NO:8相比不多于10个氨基酸置换；与SEQ ID NO:9相比不多于9个氨基酸置换；与SEQ ID NO: 10相比不多于10个氨基酸置换；或与SEQ ID NO: 11相比不多于6个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述流感HA多肽没有N-末端的甲硫氨酸残基。
[0009]本公开内容还提供了编码所述重组HA多肽的分离的核酸分子和载体。还提供了包含所述载体的分离的细胞。
[0010]还提供了包含本文公开的优化的HA多肽的流感病毒样颗粒(VLP)和融合蛋白。
[0011]还提供了包括在可药用载体中的本文公开的优化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP的组合物。本公开内容还提供了通过给予所公开的组合物、融合蛋白或VLP在受试者中引起针对流感病毒的免疫应答的方法。
[0012]还提供了通过给予受试者包含含有优化的HA多肽的VLP的组合物而使所述受试者对流感病毒免疫的方法。
[0013]根据以下参照附图进行的详细描述，本发明的上述和其他目的、特征和优点会变得更加清楚。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1的示意图概述了根据实施例1所描述的方法2产生H2N2流感COBRA HA序列的方法。
[0015]图2的示意图概述了根据实施例1所描述的方法3产生H2N2流感COBRA HA序列的方法。
[0016]图3的示意图概述了根据实施例2所描述的方法2产生B型流感COBRA HA序列的方法。
[0017]图4的示意图概述了根据实施例2所描述的方法3产生B型流感COBRA HA序列的方法。
[0018]图5的示意图概述了根据实施例3所描述的方法I产生H3N2流感COBRA HA序列的方法。
[0019]图6的示意图概述了根据实施例3所描述的方法2产生H3N2流感COBRA HA序列的方法。
[0020]图7的示意图概述了根据实施例3所描述的方法3产生H3N2流感COBRA HA序列的方法。
[0021]图8的示意图概述了根据实施例3所描述的方法4产生H3N2流感COBRA HA序列的方法。
[0022]序列表
[0023]列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列是使用在37 C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每条核酸序列的一条链，但是应理解任何提及所示链时均包括其互补链。所述序列表以创建于2013年I月30日的53.7KB的ASCII文本文件提交，以引用的方式纳入本文。在所附序列表中:
[0024]SEQ ID NO: 1-4 为 H2N2 流感 HA 的 COBRA 氨基酸序列。
[0025]SEQ ID NO: 5-7为B型流感HA的COBRA氨基酸序列。
[0026]SEQ ID NO: 8-11 为 H3N2 流感 HA 的 COBRA 氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0027]1.缩写
[0028]COBRA:以计算方式优化的广泛反应性抗原
[0029]HA:血凝素
[0030]HA1:血凝抑制
[0031]HRP:辣根过氧化物酶
[0032]Ml:基质蛋白I
[0033]NA:神经氨酸酶
[0034]PFU:空斑形成单位
[0035]VLP:病毒样颗粒
[0036]I1.术语和方法
[0037]除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于 Benjamin Lewin, genesV, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN0-19-854287-9) ；Kendrew et al.(eds.) , The Encyclopedia of MolecularB1logy, published by Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.), Molecular B1logy and B1technology:a Comprehensive DeskReference, published by VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0038]为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释:
[0039]佐剂:非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬液；或其中抗原溶液乳化在矿物油中的油包水乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包括灭活的分枝杆菌(mycobacteria)(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号 6，194,388 ；6, 207,646 ;6，214，806 ;6，218，371 ;6，239，116 ；6，339，068 ;6，406，705 ;和6，429，199)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括 IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-a、IFN-Y、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X_40L和 41 BBL0
[0040]给药:如本文使用的，给予受试者组合物是指给予、施用所述组合物或使其与所述受试者接触。给药可通过许多途径中的任一种来完成，例如，局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内和真皮内给药。
[0041]抗体:由B淋巴细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗体在人或其他动物中由特定抗原(免疫原)诱发。抗体是通过以某些可证明的方式与抗原进行特异性反应来表征，抗体和抗原各自以对方来定义。“引起抗体应答”是指抗原或其他分子诱导抗体产生的能力。
[0042]抗原:可在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源性免疫原诱导的那些)反应。在所公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述抗原为流感HA蛋白。
[0043]密码子优化的:“密码子优化的”核酸是指已经被改变使得密码子最适于在具体系统(例如具体物种或物种群)中表达的核酸序列。例如，核酸序列可被优化用于在哺乳动物细胞中表达。密码子优化不改变所编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0044]融合蛋白:通过表达从编码两种不同(异源)蛋白质的至少一部分的核酸序列改造的核酸序列而产生的蛋白质。为了产生融合蛋白，所述核酸序列必须在相同的读码框内并且不包含内部的终止密码子。例如，融合蛋白可包括融合至异源蛋白的流感HA。
[0045]血凝素(HA):流感病毒表面糖蛋白。HA介导病毒颗粒结合到宿主细胞和随后的病毒进入所述宿主细胞。本领域已知并可公开获得许多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列，例如通过NCBI流感病毒资源数据库(Bao et al., J Virol 82:596-601,2008)。HA (和NA一起)是两个主要的流感病毒抗原决定簇之一。
[0046]免疫应答:免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(例如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可包括参与宿主防卫反应的机体的任何细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。如本文所使用的，保护性免疫应答是指保护受试者免受感染(预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法在本领域中已知，包括例如测量淋巴细胞(例如B细胞或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等等。
[0047]免疫原:在合适的条件下能够刺激产生免疫应答(例如在动物中产生抗体或T细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。本文所使用的“免疫原性组合物”是包含免疫原(例如HA多肽)的组合物。
[0048]免疫:使受试者受到保护免患传染性疾病，例如通过疫苗接种。
[0049]流感病毒:属于正粘病毒科家族的分段的负链RNA病毒。有A、B和C三种类型的流感病毒。A型流感病毒感染多种鸟和哺乳动物，包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。在动物中，大多数A型流感病毒引起温和的呼吸道和肠道的局部感染。然而，高致病性A型流感毒株(例如H5N1)引起家禽的全身感染，其中死亡率可达到100%。2009年，HlNl流感是人流感的最常见病因。2009年出现的起源于猪的HlNl的新毒株，并被世界卫生组织宣布为大范围流行的。该毒株被称为“猪流感”。HlNl A型流感病毒还是1918年的西班牙流感大流行、1976年的迪克斯堡(Fort Dix)大爆发和1977-1978年的俄罗斯流感大流行的病因。H3N2、H2N2和B型流感病毒也感染人并且是季节性流感的致病因子。
[0050]分离的:“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质或病毒)已经基本上从其他生物组分(例如细胞碎片，或其他蛋白质或核酸)中分离或纯化。已经被“分离的”生物组分包括那些通过常规纯化方法纯化的组分。该术语还包括重组核酸、蛋白质或病毒(或VLP)，以及化学方法合成的核酸或肽。
[0051]接头:在融合蛋白的两个多肽之间充当间隔物的一个或多个氨基酸。
[0052]基质(Ml)蛋白:存在于病毒包膜中的流感病毒结构蛋白。Ml被认为在装配和出芽中起作用。
[0053]神经氨酸酶(NA):—种流感病毒膜糖蛋白。NA是通过在被感染细胞表面上的碳水化合物部分切割末端的唾液酸残基，参与破坏病毒HA的细胞受体。NA还从病毒蛋白上切割唾液酸残基，防止病毒聚集。NA(和HA —起)为两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。
[0054]可操作地连接:当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能的关系放置时，所述第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接于所述编码序列。可操作地连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区域时则位于相同的读码框中。
[0055]优化的流感HA蛋白:如本文所使用的，“优化的流感HA蛋白”是指通过对H2N2、H3N2或B型流感病毒分离株进行序列比对而产生的HA蛋白共有序列(如下文实施例1_3所描述)。可通过密码子优化和RNA优化(例如以增加RNA稳定性)可将编码优化的HA蛋白的核苷酸序列进一步优化以用于在哺乳动物细胞中表达。本文公开(并且如本文SEQID NO: 1-11所示)的优化的流感HA蛋白也称作“COBRA” (以计算方式优化的广泛反应性抗原)序列。设计优化的HA多肽以用于在受试者中引起广泛反应性免疫应答。在本公开内容的上下文中，“广泛反应性”意指所述蛋白序列在受试者中引起足以抑制、中和或预防众多流感病毒(例如特定亚型中的大多数或全部流感病毒)的感染的免疫应答。在一些实例中，所述优化的流感HA蛋白能够引起针对大多数或全部H3N2流感病毒分离株、大多数或全部H2N2流感病毒分离株、或者大多数或全部B型流感病毒分离株的免疫应答，例如保护性免疫应答。
[0056]爆发:如本文所使用的，流感病毒“爆发”是指在给定年份中来自单个国家的病毒分离株的集合。
[0057]可药用载体:可在本公开内容中使用的可药用载体(carrier或vehicle)是常规的° Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E.ff.Martin, Mack PublishingC0.，Easton, PA,第15版，(1975)，记载了适于一种或多种治疗组合物(例如一种或多种流感疫苗)以及其他的药剂的药物递送的组合物和制剂。
[0058]通常，所述载体的性质会取决于采用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂常常包含可注射流体作为载体，所述可注射流体包括可药用和生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性的载体之外，待给予的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0059]多肽:其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当所述氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意图包括任何氨基酸序列和包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”特别意欲覆盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成方法产生的那些。术语“残基”或“氨基酸残基”包括提及整合入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。
[0060]保守性氨基酸置换是当进行氨基酸置换时对原始蛋白质的性质有最少干扰的那些置换，即，所述蛋白的结构，特别是功能是保守的，且没有被这些置换显著改变。保守性置换的实例如下文所示。
[0061]
【权利要求】
1.一种重组流感血凝素(HA)多肽，包含: (i)与SEQID NO:8的2-566位残基至少97.7%相同的氨基酸序列； (ii)与SEQID NO:1的2-562位残基至少99.6%相同的氨基酸序列； (iii)与SEQID NO:2的2-562位残基至少99.4%相同的氨基酸序列； (iv)包含SEQID NO:3的2-562位残基的氨基酸序列； (V)与SEQ ID NO:4的2-562位残基至少99.7%相同的氨基酸序列； (vi)与SEQID NO:5的2-584位残基至少99.6%相同的氨基酸序列； (vii)与SEQID NO:6的2-585位残基至少98.8%相同的氨基酸序列； (viii)包含SEQID NO:7的2-585位残基的氨基酸序列； (ix)与SEQID NO:9的2-566位残基至少98.4%相同的氨基酸序列； (X)与SEQ ID NO: 10的2-566位残基至少97.8%相同的氨基酸序列；或 (xi)与SEQ ID NO: 11的2-566位残基至少98.9%相同的氨基酸序列。
2.权利要求1的流感HA多肽，包含: ⑴与SEQ ID NO:8 至少97.7%相同的氨基酸序列； (ii)与SEQID NO:1至少99.6%相同的氨基酸序列； (iii)与SEQID NO:2至少99.4%相同的氨基酸序列； (iv)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列； (V)与SEQ ID N0:4至少99.7%相同的氨基酸序列； (vi)与SEQID NO:5至少99.6%相同的氨基酸序列； (vii)与SEQID NO:6至少98.8%相同的氨基酸序列； (viii)SEQID NO:7的氨基酸序列； (ix)与SEQID NO:9至少98.4%相同的氨基酸序列； (X)与SEQ ID NO: 10至少97.8%相同的氨基酸序列；或 (xi)与SEQ ID NO: 11至少98.9%相同的氨基酸序列。
3.权利要求1或权利要求2的流感HA多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含: (i)相对于SEQID NO:8不多于10个氨基酸置换； (ii)相对于SEQID NO:1不多于2个氨基酸置换； (iii)相对于SEQID NO:2不多于3个氨基酸置换； (iv)相对于SEQID NO:4不多于I个氨基酸置换； (V)相对于SEQ ID NO:5不多于2个氨基酸置换； (vi)相对于SEQID NO:6不多于7个氨基酸置换； (vii)相对于SEQID NO:9不多于9个氨基酸置换； (viii)相对于SEQID NO: 10不多于10个氨基酸置换；或 (ix)相对于SEQID NO: 11不多于6个氨基酸置换。
4.权利要求1的流感HA多肽，其包含SEQID NO:8的2-566位残基、SEQ ID NO:1的2-562 位残基、SEQ ID NO: 2 的 2-562 位残基、SEQ ID NO:4 的 2-562位残基、SEQ ID NO: 5 的2-584 位残基、SEQ ID NO:6 的 2-585 位残基、SEQ ID NO:9 的 2-566 位残基、SEQ ID NO: 10的2-566位残基或SEQ ID NO: 11的2-566位残基的氨基酸序列。
5.权利要求1的流感HA多肽，其由SEQID NO:8的2-566位残基、SEQ ID NO:1的2-562 位残基、SEQ ID NO: 2 的 2-562 位残基、SEQ ID NO: 2 的 2-562位残基、SEQ ID NO:4 的2-562 位残基、SEQ ID NO: 5 的 2-584 位残基、SEQ ID NO:6 的 2-585 位残基、SEQ ID NO: 7的 2-585 位残基、SEQ ID NO:9 的 2-566 位残基、SEQ ID NO: 10 的 2-566 位残基或 SEQ IDNO: 11的2-566位残基的氨基酸序列组成。
6.权利要求2的流感HA多肽，其包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: USEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
7.权利要求2 的流感 HA 多肽，其由 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:USEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成。
8.编码权利要求1-7任一项的流感HA多肽的分离的核酸分子。
9.权利要求8的分离的核酸分子，其中所述核酸分子被密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。
10.包含权利要求8或权利要求9的核酸分子的载体。
11.权利要求10的载体，还包含可操作地连接至编码所述流感HA多肽的核酸序列的启动子。
12.包含权利要求10或权利要求11的载体的分离的细胞。
13.包含权利要求1-7任一项的流感HA多肽的流感病毒样颗粒(VLP)。
14.权利要求13的流感VLP，还包含流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(Ml)蛋白或其两者。
15.包含权利要求1-7任一项的流感HA多肽的流感VLP，其通过在足以使所述HA、Ml和NA蛋白表达的条件下，使用编码所述HA多肽的载体、编码流感NA蛋白的载体和编码流感Ml蛋白的载体转染宿主细胞来产生。
16.包含权利要求1-7任一项的流感HA多肽的融合蛋白。
17.一种组合物，其包含权利要求1-7任一项的流感HA多肽、权利要求13-15任一项的VLP或权利要求16的融合蛋白，以及可药用载体。
18.一种在受试者中引起针对流感病毒的免疫应答的方法，包括给予权利要求1-7任一项的流感HA多肽、权利要求13-15任一项的VLP、权利要求16的融合蛋白或权利要求17的组合物。
19.一种针对流感病毒免疫受试者的方法，包括给予所述受试者包含权利要求13-15任一项的VLP和可药用载体的组合物。
20.权利要求19的方法，其中所述组合物还包含佐剂。
21.权利要求19或权利要求20的方法，其中所述组合物通过肌内给予。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述组合物包含约1-约25μ g的所述VLP。
23.权利要求22的方法，其中所述组合物包含约15μ g的所述VLP。
【文档编号】C12N15/44GK104136456SQ201380008469
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】T·M·罗斯, D·M·卡特, C·J·科雷瓦 申请人:高等教育联邦系统-匹兹堡大学