用于递送核酸的脂化的糖胺聚糖颗粒的制作方法

用于递送核酸的脂化的糖胺聚糖颗粒的制作方法
【专利摘要】提供了包含脂化的糖胺聚糖颗粒的组合物、用于制备其的方法以及其用于体内和体外有效递送核酸，诸如siRNA分子的用途。
【专利说明】用于递送核酸的脂化的糖胺聚糖颗粒 发明领域
[0001] 本发明涉及包含脂化的糖胺聚糖颗粒（lipidatedglycosaminoglycan particle)(还称为gagomer)的组合物、用于制备其的方法以及其用于体内和体外有效递 送核酸，诸如siRNA分子的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 核酸至期望的靶位点的有效递送一直是许多深入研究的重点。引入至靶位点后， 核酸可直接地或间接地在靶位点发挥生物效应。在一些情况下，核酸的递送可利用被设计 成递送核酸至靶位点的载体。可被递送至靶位点的示例性核酸包括脱氧核糖核苷酸核酸 (DNA)和核糖核苷酸核酸（RNA)，诸如，例如，siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA(AS-RNA)，等。
[0004] RNA干扰（RNAi)是基因沉默的内源细胞机制。RNAi通过以互补核苷酸序列通过 降解特定信使RNA(mRNA)或通过阻断mRNA翻译抑制特定基因的表达的双链RNA(dsRNA) 来进行。RNAi还可通过用病毒载体表达短发夹RNA(shRNA)，或通过并入合成的小干扰 RNA(siRNA)直接进入细胞质被外源性激活。siRNA是19-23个碱基对的化学合成的双链 RNA(dsRNA)，具有在5' -磷酸化末端和未磷酸化的3' -末端的2个未配对的核苷酸。在细 胞细胞质内，将siRNA并入RNA诱导沉默复合物（RISC)，该复合物分离RNA双链体的链并丢 弃有义链。然后反义RNA链引导RISC退火并切割靶mRNA或阻断其翻译。通过回收靶mRNA， 并入反义链的RISC复合物可显示在分裂细胞中长达几天以及在非分裂细胞中持续数周的 治疗效应。此外，siRNA的重复施用可导致其靶的稳定沉默。然而，尽管有这个希望，利用 siRNA作为疗法不是简单的任务。例如，由于分子量大（?13kDa)和净负电荷，裸的siRNA 分子藉以穿过质膜并进入细胞质的效率通常非常低。当静脉注射时，除了快速肾清除和对 由RNA酶降解的敏感性外，未经修饰的裸的siRNA被Toll样受体（TLR)识另I」。这常常刺激 免疫系统，并引发干扰素反应、补体激活、细胞因子诱导、及凝血级联反应（由PeerD.评 述）。除了不期望的免疫激活，这些效应可抑制基因全局表达，产生脱靶和误解的结果。
[0005] 对于siRNA至细胞的体外或离体递送，通常使用常规的转染方法（由Weinstein 和Peer评述）。siRNA的体内递送可分为两类：局部的或全身性的。siRNA的局部递送已 在多种动物模型中被证明，并应用于几个正在进行的临床试验中。基于裸的或阳离子脂质/ 聚合物配制的siRNA的局部注射，该递送方法主要适用于粘膜病、皮下组织、眼内注射至眼 睛的玻璃体，等。siRNA的全身递送提供了另外的复杂性。由于细胞和局部递送处理siRNA 在细胞的细胞质中的内化、释放、和积累的需要，在整个动物中的全身递送执行另外的障碍 诸如，例如，siRNA与血液组分的相互作用（由于脂质体的正电荷与血清蛋白的通常负电荷 的静电相互作用，其是使用阳离子脂质体常见的并发症）、在毛细血管内的滞留、被网状内 皮细胞摄取、被RNA酶降解、解剖学屏障（诸如肝、脾和肾脏过滤）、免疫刺激、从血管渗出至 靶组织、在组织内的渗透，等。
[0006] 多年来已建议了用于全身递送siRNA分子的各种方法和载体。方法和载体 包括siRNA的被动递送或siRNA的祀向递送。在本领域中描述的示例性载体包括： 稳定的核酸-脂质颗粒（SNALP)、中性脂质体、包含脂质体的1ipidoid、去端肽胶原 (atelocollagen)、胆固醇_siRNA、dynamicpolyconjugates、PEInanoplexs、抗体-鱼精蛋 白融合蛋白、适体siRNA、革巴向阳离子脂质体和包含聚阳离子的环糊精（⑶P)(由Manjunath 和Dykxhoorn;以及Weinstein和Peer?评述）。
[0007] 本领域中所描述的一些siRNA载体利用可被作用颗粒的组分和/或作为靶向部分 的透明质酸。例如：Taetz等人的出版物涉及用于抗端粒酶siRNA至表达⑶44的肺癌细胞 的靶向递送的透明质酸修饰的D0TAP/D0PE脂质体。Lee.等人的出版物涉及使用可降解的 透明质酸纳米凝胶，siRNA的靶特异性细胞内递送。Choi等人的出版物涉及用于靶向活性 肿瘤的自组装的透明质酸纳米颗粒。Peer等人的出版物涉及全身白细胞定向siRNA递送， 揭示细胞周期蛋白D1作为抗炎靶点。例如，PCT专利申请公布号W0 2011/013130涉及包 含多核苷酸试剂的靶向细胞的纳米颗粒及其用途。此外，美国专利7, 544, 374涉及脂化的 糖胺聚糖颗粒以及其在用于诊断和治疗的药物和基因递送中的用途。
[0008] 然而，本领域中描述的载体，包括利用透明质酸的载体，没有解决与成功递送，并 且特别是体内递送siRNA至其靶细胞相关的所有障碍。
[0009] 因此，本领域中存在对用于有效并特定递送SiRNA进入期望的靶位点的改进的载 体组合物的需要，其中载体组合物是稳定的、具有长的保质期、可生物降解的、适合于工业 生产过程、具有高包封能力、无毒、避免诱导免疫应答、对包封于其中的siRNA提供增强的 保护（稳定性和完整性），并且能够有效地体外和体内递送siRNA至其靶位点，使得siRNA 能够有效地发挥期望的效应。
[0010] 概述
[0011] 根据一些实施方案，提供了被用作核酸分子，诸如，例如，SiRNA分子的体内和体外 有效的并有效率的递送系统的改进的脂化的糖胺聚糖组合物（Gagomer)。
[0012] 根据一些实施方案，本发明至少部分地依赖于以下的令人惊奇和意外的发现：在 用于制备脂化的糖胺聚糖颗粒的脂质的组合物中的修饰、在其制备的方法中的修饰、在Gagomer的各种组分之间的比率以及Gagomer颗粒的各种组分之间的缔合和其中包封的核 酸分子（诸如，例如，siRNA分子）的修饰，意外地提供了通常作为用于体外和体内两者应 用的核酸分子并且特别是siRNA分子的递送系统是非常有用的增强的Gagomer组合物。相 比于在先前描述的Gagomer组合物，本发明的增强的Gagomer组合物显示了各种改进。例 如，本发明的增强的Gagomer组合物显示了改进的稳定性（保质期），确定的结构和均匀尺 寸分布和电荷。此外，本发明的增强的Gagomer组合物适合于有成本效益的工业生产工艺， 并且还可通过常规消毒方法进行消毒。此外，本发明的增强的Gagomer组合物显示了包封 核酸分子的高效率以及高载量能力（即，Gagomer可有效地负载核酸的数/量）。另外，本 发明的增强的Gagomer组合物能够对包封在Gagomer颗粒内的核酸分子提供增强的保护。 此外，本发明的增强的Gagomer组合物对细胞无免疫毒性也不会在分离的人外周血单核细 胞（PBMC)中引起免疫应答，并基于体内施用。本发明的Gagomer组合物的增强的性能是用 于核酸的有效的、无毒的并有用的递送系统的关键参数。
[0013] 此外，在另一个意外的发现中，本发明的增强的Gagomer组合物显示了在Gagomer 颗粒的脂质组分和包封于其中的核酸（诸如，例如，siRNA)之间的意外的重量比。例如，更 高的脂质对siRNA的重量比提供了siRNA对其靶点的改进的生物效应。此外，如本文所显 示，在siRNA的水平和由此发挥的生物效应之间不存在直接相关性。
[0014] 根据一些实施方案，提供了包括包含形成颗粒脂质组合物的多个脂质的水不溶性 脂化糖胺聚糖颗粒和包封于该颗粒内的核酸的组合物，其中核酸与脂质的重量比小于1:1。
[0015] 在一些实施方案中，多个脂质可选自阳离子脂质，以及具有伯氨基基团的脂质。阳 离子脂质可选自，但不限于：单阳离子脂质N-[l-(2, 3-二油酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙 烧（D0TAP)、BCAT(0-(2R-12-双(I'Z, 9'Z-十八碳二稀基）-甘油）(二氛 乙基）_ 氛基甲酸醋）（〇_(2R-12_di-〇-(I'Z, 9'Z-octadecadienyl)-glycerol)-3-N-(bis -2-aminoethvl)-carbamate)、BGSC(双-胍盐-亚精胺-胆固醇）、BGTC(双-胍盐-三 氨乙基胺-胆固醇）（Bis-guanidinium-tree-cholesterol)、CDAN(N' -胆固醇基氧撰 基-3, 7-二氮杂壬烷-1，9-二胺）、CHDTAEA(胆固醇基半二硫代二甘醇基三（氨（乙基） 胺）、DCAT(0-(1，2-二_0_(9'Z-十八碳烯基）-甘油）-3-N-(双-2-氨乙基）-氨基甲酸 酯）（〇_(1，2_di-〇-(9,Z-octadccenyl)-glycerol)-3-N-(bis-2-aminoethyl)-carbamat e)、DC-Chol(3P-[N-(N'，N' -二甲基氨（乙基）氨基甲酰基胆固醇）、DLKD(0,0' -二月桂 基N-赖氨酰天冬氨酸酯）（0, 0'-DilaurylN-lysylaspartate)、DMKD(0, 0' -二肉豆蘧基 N-赖氨醜天冬氨酸酯）（0, 0'-DimyristylN-lysylaspartate)、D0G(二油基甘油、DOGS(二 (十八碳烯基）酰氨基甘氨酰基精胺）、DOGSDSOd，2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酰 基-2-羟乙基二硫鸟氨酸）、D0PC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、DOPE(1，2-二 油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、D0SN(二油基琥珀酰乙基硫代新霉素）、D0SP(二油基 琥珀酰巴龙霉素）、DOST(二油基琥珀酰妥布霉素）、D0TAP(1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙 烷）、D0TMA(N' [1-(2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵）、DPPES(二棕榈酰磷 脂酰乙醇酰氨基精胺）、DDAB和D0DAP。每个可能性是独立的实施方案。
[0016] 具有伯氨基基团的脂质（磷脂酰乙醇胺）可选自，但不限于：1，2-二月桂酰 基-L-磷脂酰乙醇胺（DLPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1，2-二植 烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhPE)、1，3-二棕榈酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1-棕榈酰基-3-油酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-P0PE)、生物素-磷脂 酰乙醇胺、1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺 (DPPE))。每个可能性是独立的实施方案。
[0017] 在另外的实施方案中，多个脂质还可包括（除阳离子脂质和具有伯氨基 基团的脂质外）膜稳定化脂质，其可选自但不限于：胆固醇、磷脂（诸如，例如， 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘 油（diphosphatidylglycerols))、脑磷脂、鞘脂（鞘磷脂和糖鞘脂）、和甘油糖脂 (glycoglycerolipid)。每个可能性是独立的实施方案。
[0018] 根据另外的实施方案，糖胺聚糖可选自，但不限于：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮 肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、以及其片段、盐、和混合物。在一些实施方案中，透 明质酸可选自，但不限于：高分子量透明质酸（例如，在约MW= 3. 1\105-1.5\1061^)&的范 围内）。
[0019] 根据一些实施方案，颗粒脂质组合物可具有约10-200nm的范围内的粒径。
[0020] 在另外的实施方案中，核酸可选自DNA、RNA、其修饰形式、以及其组合。在一些实 施方案中，RNA可选自siRNA、miRNA、反义RNA、或其组合。
[0021] 在另外的实施方案中，多个脂质和核酸之间的重量比是2:1。在一些实施方案中， 多个脂质和核酸之间的重量比是5:1。在一些实施方案中，多个脂质和核酸之间的重量比是 10:1。
[0022] 在一些实施方案中，阳离子脂质不是D0TMA(N' [1_(2,3_二油酰氧基）丙基]- N，N，N-三甲基氯化铵）。
[0023] 在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约50nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约100nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约200nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约750nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约lOOOnrn的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约1500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约2000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约2500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约3000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约3500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约4000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约4500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约5000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有约50nm-12微米的范围内 的粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有约500nm-5微米的范围 内的粒径。
[0024] 在另外的实施方案中，组合物还可包括靶向部分。
[0025] 在另外的实施方案中，颗粒可适合于递送核酸至靶位点。靶位点可选自细胞、组 织、器官、以及微生物。
[0026] 根据一些实施方案，提供了包含适合于经由选自口服、肠胃外和局部的路径的施 用的剂型中的脂化的糖胺聚糖颗粒的药物组合物。
[0027] 根据另外的实施方案，组合物可呈冷冻干燥的颗粒的形式。
[0028] 根据示例性实施方案，组合物包含D0TAP、DLPE和胆固醇。
[0029] 根据一些实施方案，提供了用于治疗需要其的受试者中的癌症的方法，该方法包 括向受试者施用包括包含形成颗粒脂质组合物的多个脂质的水不溶性脂化的糖胺聚糖颗 粒、和包封于该颗粒内的核酸的组合物，其中核酸对脂质的重量比小于1:1，或包含所述组 合物的药物组合物。在一些的实施方案中，核酸在另外的实施方案中，核酸可选自DNA、RNA、 其修饰形式、以及其组合。在一些实施方案中，RNA可选自811?嫩、1^1?嫩、8111?嫩、反义1?嫩、 或其组合。
[0030] 根据一些实施方案，提供了用于制备包封核酸的脂化的糖胺聚糖组合物的方法， 该方法包括以下步骤：
[0031] a)形成颗粒脂质组合物，包括以下步骤：
[0032] i)将一种或更多种脂质在有机溶剂中以期望的比混合并且形成均匀的脂质混合 物；
[0033] ii)在水性缓冲液中悬浮脂质混合物并通过在加热的脂质挤压机中连续过滤脂质 悬浮液获得期望的粒径；
[0034]b)活化糖胺聚糖，包括以下：
[0035] i)将糖胺聚糖溶解于酸性缓冲液中，并加入交联剂，以形成活化的糖胺聚糖；以 及
[0036] c)由以下步骤形成脂化的糖胺聚糖组合物：
[0037] i)将步骤a)中的脂质组合物与核酸温育；以及
[0038] ii)将步骤b)中的活化的糖胺聚糖加入至混合物。
[0039] 根据一些实施方案，脂质颗粒具有约50_200nm的粒径。
[0040] 在另外的实施方案中，在制备脂化的糖胺聚糖组合物的方法的步骤a)中，有机溶 剂可从脂质混合物中蒸发以形成脂质膜。
[0041] 在另外的实施方案中，用于制备脂化的糖胺聚糖组合物的方法还可包括冷冻干燥 脂质颗粒。
[0042] 在一些实施方案中，在制备脂化的糖胺聚糖组合物的方法中使用的多个 脂质可选自阳离子脂质，以及具有伯氨基基团的脂质。阳离子脂质可选自，但不 限于：单阳离子脂质N-[l-(2, 3-二油酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙烷（D0TAP)、 BCAT(〇-(2R-12_di-〇-(I，Z，9'Z-十八碳二稀基）-甘油）-3-N-(二 _2_ 氛乙基）-氛基 甲酸酯）、BGSC(双-胍盐-亚精胺-胆固醇）、BGTC(双-胍盐-三氨乙基胺-胆固醇）、 CDAN(N'_胆固醇基氧羰基-3, 7-二氮杂壬烷-1，9-二胺）、CHDTAEA(胆固醇基半二硫代二 甘醇基三（氨（乙基）胺）、DCAT(0-(1，2-二-0-(9'Z-十八碳烯基）-甘油）-3-N-(双-2-氨 乙基）-氨基甲酸酯）、〇〇〇1〇1(30-[^(^，^-二甲基氨（乙基）氨基甲酰基胆固醇）、 DLKD(0, 0'-二月桂基N-赖氨酰天冬氨酸酯）、DMKD(0, 0'-二肉豆蘧基N-赖氨酰天冬氨酸 酯）、D0G(二油基甘油、DOGS(二（十八碳烯基）酰氨基甘氨酰基精胺）、D0GSDS0 (1，2-二油 酰基-sn-甘油-3-琥珀酰基-2-羟乙基二硫鸟氨酸）、D0PC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷 酸胆碱）、D0PE(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、D0SN(二油基琥珀酰乙基硫代新 霉素）、D0SP(二油基琥珀酰巴龙霉素）、DOST(二油基琥珀酰妥布霉素）、D0TAP(1，2-二油 酰基-3-三甲基铵丙烷）、D0TMA(N' [1- (2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵）、 DPPES(二棕榈酰磷脂酰乙醇酰氨基精胺）、DDAB、D0DAP以及其组合。每个可能性是独立的 实施方案。
[0043] 在一些实施方案中，阳离子脂质不是D0TMA(N' [1_(2,3_二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵）。
[0044] 在一些实施方案中，具有伯氨基基团的脂质（磷脂酰乙醇胺）可选自，但不限 于：1，2-二月桂酰基-L-磷脂酰乙醇胺（DLPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇 胺（DOPE)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhPE)、1，3-二棕榈酰基-sn-甘 油-2-磷酸乙醇胺（1，3-DPPE)、1-棕榈酰基-3-油酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-P0PE)、生物素-磷脂酰乙醇胺、1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE)、 二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE))，以及其组合。每个可能性是独立的实施方案。
[0045] 在另外的实施方案中，在制备脂化的糖胺聚糖组合物的方法中使用的脂质还可包 括（除阳离子脂质和具有伯氨基基团的脂质外）膜稳定化脂质，其可选自但不限于：胆固 醇、磷脂（诸如，例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘 油、二磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerols))、脑磷脂、鞘脂（鞘磷脂和糖鞘脂）、甘油糖 月旨，以及其组合。每个可能性是独立的实施方案。
[0046] 根据另外的实施方案，在该方法中使用的糖胺聚糖可选自，但不限于：透明质酸、 硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、以及其片段、盐、和混合物。透 明质酸可选自，但不限于：高分子量透明质酸（例如，在约MW= 3. 1\105-1.5\1061^)&的范 围内）。
[0047] 在另外的实施方案中，包封于脂化的糖胺聚糖组合物内的核酸可选自DNA、RNA、其 修饰形式、以及其组合。在一些实施方案中，RNA可选自811?嫩、11111?嫩、8111?嫩、反义1?嫩、或 其组合。
[0048] 除了以上描述的示例性方面和实施方案，通过参考附图以及通过研究以下的详细 说明，另外的方面和实施方案将变得明显。
[0049] 附图简述
[0050] 示例性实施方案示于参考附图中。附图中显示的组分和特征的尺寸通常为了方便 和清楚的呈现来选择，并不一定按比例示出。附图列于以下。
[0051] 图1-根据一些实施方案，Gagomer结构的示意图；
[0052] 图2A-C-显示颗粒脂质组合物的粒径分布的（筛选器（Zetasizer)分析数据；
[0053] 图3-显示以下的4电位中的变化的曲线图：(A)阳离子颗粒脂质组合物；(B)加 入siRNA后；（C)将活化的HA加入至阳离子脂质组合物后；
[0054] 图4显示包封于改进的Gagomer组合物内的siRNA的稳定性的象形图 (pictogram)。图4A-B显示使用未化学修饰的siRNA的实验；图4C显示使用化学修饰的 siRNA的实验（使用交替的2-0-甲基化）；
[0055] 图5-在与以不同的siRNA对脂质比率包含针对pGP的siRNA的Gagomer组合物 温育后PGP蛋白表达的减少的FACS分析。上图-1:lOsiRNA对脂质重量比，中图-1: 5siRNA 对脂质重量比，下图-l:2siRNA对脂质重量比；
[0056] 图6A-B-显示在转染了 100nm的包封于改进的Gagomer组合物中的siRNA的NCI/ ADR-RES(NAR)细胞系中Ahal和Kifll(分别图6A和7B)的表达的相对减少的图；
[0057] 图7A-C-显示在与改进的Gagomer-siRNA组合物温育18小时后，转染进NAR细胞 (图8A-B)或B16F10细胞（图7C)的siRNA的量和特定基因在细胞中表达的减少之间的剂 量响应的图。图7A-Aha1相对表达；图7B-Kifll相对表达；图7C-Ahal基因相对表达；
[0058] 图8A-B显示在用100nm的包封于改进的Gagomer组合物的siRNA或通过 lipofectamine转染的各种细胞系中Ahal的表达的相对减少的图。图8A-小鼠黑色素瘤 B16-F10细胞系。图8B-人LLC-D122细胞系；
[0059] 图9A-D-显示在PBMC细胞用改进的Gagomer-siRNA组合物转染后，细胞因子或 干扰素的表达水平（浓度，pg/mL)随时间（小时）的变化的柱状图。结果显示，改进的 Gagomer-siRNA组合物不引起任何显著的免疫应答。图9A-IL-6的浓度，图9B-IL-10的浓 度；图9C-INFY的浓度；图9D-TNFa的浓度；
[0060] 图10A-C-显示在PBMC细胞转染了包含D0TAP作为阳离子脂质的Gagomer颗粒 ("DOTAP"）或包含DOTMA作为阳离子脂质的Gagomer颗粒（"DOTMA"）后，细胞因子或干 扰素的表达水平（浓度，pg/mL)随着时间（小时）的变化的柱状图。结果令人惊奇地显示， 尽管包含D0TAP的Gagomer不引起任何显著免疫应答，包含D0TMA的Gagomer引起各种炎 症标志物（IL-6、TNF-a和IFN-y)的浓度的牢固和急剧增加。图10A-IL-6的浓度（pg/ mL);图 10B-TNF-a的浓度（pg/mL);图IOC-INFy的浓度（pg/mL);
[0061] 图11A-11H-从注射了包封于改进的Gagomer组合物内的Cy5标记的siRNA的幼 稚或荷瘤小鼠获得的各种组织的冰冻切片制品的显微象形图。图11A-B:肝；图11C-D:脾； 图 11E-F:肾；图 11G-H:肺；
[0062] 图12A-C-在不同时间点从荷瘤小鼠获得的肿瘤的冰冻切片的图。图12A-共聚焦 显微镜图；图12B-H&E组织染色；图12C-高分辨率光谱荧光显微图；
[0063] 图13-显示施用了Gagomer-siRNA组合物（处理）的小鼠和未处理的小鼠的体重 (g)随着时间（小时）的变化的线性图；
[0064] 图14A-D-在施用Gagomer-siRNA组合物（对于每个时间点/组n= 5)后，在 不同的时间点（小时/天）从小鼠获得的血清中的各种肝酶和脂质的水平的柱状图。图 14A-SG0T/AST的水平（IU/L)。图 14B-SGPT/AST的水平（IU/L)。图 14C-胆固醇（mg/dL)。 图14D-甘油三酯的水平（mg/dL);
[0065] 图15A-D-在施用Gagomer-siRNA组合物（对于每个时间点/组n= 5)后，在不 同的时间点（小时）从小鼠获得的血液中各种细胞因子的浓度的柱状图。图15A-IL-6的 浓度（pg/ml)。图 15B-IL-10 的浓度（pg/ml)。图 15C-IFNY(pg/ml)。图MD-TNFa的浓 度（pg/ml);以及
[0066] 图16A-D-在施用Gagomer-siRNA组合物后长达七小时，从测试的小鼠获得的组织 的组织学切片的象形图。图16A-肺；图16B-肝；图16C-肾；图16D-脾。
[0067] 图17A-B-显示从接种了B16-F10细胞并且5天后全身施用了所示Gagomer-siRNA 组合物的小鼠获得的各种组织中的Ahal表达的相对mRNA表达的柱状图。施用 Gagomer-siRNA组合物后24小时，处死小鼠并提取指示的组织，并且分析Ahal的表 达。Gagomer组合物包括：1.包含针对萤光素酶的siRNA的对照Gagomer-siRNA组合物 ("siLuc"），2?包含针对Ahal的siRNA的测试Gagomer-siRNA组合物（siAhal)。"未处 理的"指示不施用Gagomer-siRNA组合物的小鼠。图17A:显示用指示的Gagomer-siRNA组 合物（0. 4mg/kg)处理的、或未处理的肝、肺和肿瘤组织中的AhalmRNA的相对表达水平的柱 状图。图17B:显示Gagomer-siRNA组合物对肿瘤提取物中AhalmRNA的相对表达的剂量和 时间效应的柱状图。测试的时间点是在施用Gagomer-siRNA组合物之后的24小时和48小 时。测试的Gagomer-siRNA组合物的剂量为0? 4mg/kg和2. 0mg/kg。
[0068] 图18A-C-从施用了B16-F10细胞（IV)以诱导肺转移瘤的C57BL小鼠获得的肺的 象形图。在IV施用B16-F10细胞十天后获取肺。图18A显示了获取的肺的腹视图的肉眼 检查象形图；图18B显示了背视图的肉眼检查象形图。箭头指示标识的转移性集群（标识 为黑点）。图18C显示了来自B16-F10细胞接种后10天处死的动物的肺的组织学制品的象 形图，其显示了伴随实质侵入，胸膜下聚集的迹象；
[0069] 图19A-D-从施用（IV) 了诱导肺转移瘤的B16-F10细胞的C57BL小鼠获得的肺转 移瘤的冰冻切片制品的显微象形图。用包封于具有用FITC标记的HA部分的改进的Gagomer 组合物的Cy5标记的siRNA注射小鼠。在施用Gagomer-siRNA组合物之后在各种时间点处 死小鼠，并且肺转移的冰冻切片用Cy5标记（最初显示为红色）和FITC(最初显示为绿色） 来荧光标记。图19A-来自对照小鼠（未施用Gagomer-siRNA组合物）的肺转移瘤冰冻切 片。图19B-来自施用了Gagomer-siRNA组合物后一小时处死的小鼠的肺转移瘤冰冻切片。 图19C-来自施用了Gagomer-siRNA组合物后三小时处死的小鼠的肺转移瘤冰冻切片。图 19D-来自施用了Gagomer-siRNA组合物后七小时处死的小鼠的肺转移瘤冰冻切片。对于所 有图-右侧图（BF)-明场图，右侧第二个图（Cy5-siRNA) -Cy5标记（最初红色），左侧第二 个图（FITC-HA) -FITC标记（最初绿色），左侧图（融合的）-显示Cy5和FITC标记的融 合图的图（最初黄色）。
[0070] 详细说明
[0071] 定义
[0072] 为了便于本发明的理解，对一些术语和短语定义如下。应当理解，这些术语和短语 是为了说明的目的并非限制，使得本说明书的术语或措词将由技术人员根据本文提出的教 导和指导结合本领域的普通技术人员的知识来解释。
[0073] 如本文提及的，术语"核酸"、"核酸分子"、"寡核苷酸"、"多核苷酸"、和"核苷酸"在 本文中可互换使用。术语涉及脱氧核糖核苷酸（DNA)、核糖核苷酸（RNA)的聚合物、以及其 修饰形式，以单独片段或作为更大构建体的组分、直链或支链的、单链的、双链的、三链的、 或其杂合体的形式。术语还包括RNA/DNA杂合体。多核苷酸可包括DNA或RNA的有义和反 义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是，例如，但不限于：互补DNA(cDNA)、基 因组DNA、合成的DNA、重组DNA、或其杂合体或RNA分子，诸如，例如，mRNA、shRNA、siRNA、 miRNA、反义RNA等。每个可能性是独立的实施方案。术语还包括包括天然存在的碱基、糖 和共价的核苷间键的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分，其功能与各自天然存在的部 分类似的寡核苷酸。
[0074] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。术 语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨 基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
[0075] 如本文使用的术语"多个"涉及包括多于一个的组分。
[0076] 术语"糖胺聚糖"（GAG)或"粘多糖"涉及由重复二糖单元组成的长的无支链的多 糖。重复单元可以包括连接至己糖胺的己糖（六碳糖）或己糖醛酸。糖胺聚糖家族的成员 可在其包含的己糖胺、己糖或己糖醛酸单元的类型（例如，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖、 半乳糖胺、葡糖胺）和糖苷键的几何形状方面变化。术语糖胺聚糖包括天然的、合成的或半 合成的糖胺聚糖分子。示例性糖胺聚糖包括，这样的糖胺聚糖如，但不限于：硫酸软骨素、硫 酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质烷（Hyaluronan)(还称为透明质酸、透 明质酸盐/酯、HA)以及其片段、盐、和混合物。术语糖胺聚糖还包括，已通过修饰诸如，但 不限于：酯化、硫酸化、多硫酸化、和甲基化化学修饰的糖胺聚糖。除了透明质酸之外，糖胺 聚糖还天然呈共价结合至聚-糖部分的蛋白部分的形式。用于水解蛋白-糖键的化学和酶 促两种方法对于本领域技术人员是熟知的。
[0077] 术语"HA"和"透明质烷"是指可呈游离的形式，以及附着的形式，诸如细胞外基质 组分的透明质酸。术语HA还涉及其任何透明质酸盐，包括，例如，透明质酸钠、透明质酸钾、 透明质酸镁、及透明质酸钙。HA多糖由通过交替的0 -1，3-葡糖苷酸和0 -1，4-氨基葡糖苷 键连接的交替的N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸残基组成。HA可以是低分子量（例如， 在MW= 104-7. 2X104的范围内），和/或高分子量（例如，在MW= 3. 1X105-1. 5X106kDa 的范围内）。HA可呈不同链长。透明质酸具有对细胞外基质和多种肿瘤，包括乳腺、脑、肺、 皮肤和其他器官和组织的肿瘤的高亲和性。HA具有CD44细胞受体的高亲和性。
[0078] 术语"Gagomer"和"Gagomer组合物"可互换使用，并且涉及脂化糖胺聚糖颗粒。 通常，Gagomer是通过将脂质交联至包含羧酸的糖胺聚糖产生的生物粘附性生物聚合物。术 语"改进的Gagomer"、"增强的Gagomer"、"改进的Gagomer组合物"和"增强的Gagomer组 合物"可互换使用，并且涉及包括本发明的Gagomer组合物，如本文所公开的。
[0079] 术语"siRNA-Gagomer"和"Gagomer-siRNA"可互换使用，并涉及本发明包封siRNA 分子的改进的Gagomer。siRNA分子可包括，例如，但不限于：短双链的siRNA(例如，在 18-25个核苷酸的长度）。siRNA分子可以是修饰的或未修饰的。在一些实施方案中，在 Gagomer中的所有siRNA分子是相同的。
[0080] 如本文使用的术语"构建体"，是指人工组装或分离的核酸分子，其可包括一个或 更多个核酸序列，其中核酸序列可包括编码序列（即，编码最终产物的序列）、调控序列、非 编码序列、或其任何组合。术语构建体包括，例如，载体，但不应被视为限制于其。
[0081] "表达载体"是指具有在外源细胞中整合并表达异源核酸片段（诸如，例如，DNA) 的能力的构建体。换言之，表达载体包括能够被转录的核酸序列/片段（诸如DNA、mRNA、 tRNA、rRNA)。许多原核和真核表达载体是已知的和/或商购可得的。选择适当的表达载体 在具有本领域技术的人员的知识范围内。在一些示例性实施方案中，表达载体可在靶位点 编码双链的RNA分子。
[0082] 如本文使用的术语"表达"，是指在靶细胞中产生期望的最终产物分子。最终产物 分子可包括，例如RNA分子、肽或蛋白、等、或其组合。
[0083] 本文所用的术语"引入"和"转染"可互换使用，并且是指将分子，诸如，例如，核 酸、多核苷酸分子、载体等转移进靶细胞，更具体地进入靶细胞的膜封闭空间的内部。可 通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过如Sambrook等人MolecularCloning:A LaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(2001)教导的方法 将分子"引入"进靶细胞，其内容通过引用并入本文。将分子"引入"进细胞的方法包括，例 如，但不限于：热休克、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂质转染、转染试剂、病毒介导的转 移等，或其组合。细胞的转染可对任何来源的任何类型的细胞，诸如，例如，人细胞、动物细 胞、植物细胞、病毒细胞等进行。细胞可选自分离的细胞、组织培养的细胞、细胞系、在生物 体内存在的细胞等。
[0084] 如本文提及的，术语"靶位点"是指其中核酸针对的位置和/或其中核酸将发挥其 生物学效应的位点。在一些示例性实施方案中，靶位点是可选自，但不限于以下的细胞：培 养细胞（原代细胞或细胞系来源的细胞）、以及在生物体内的细胞；组织、器官、微生物（诸 如，例如，病毒、细菌、寄生虫）等。生物体可以是任何生物体，诸如，但不限于：哺乳动物，诸 如人或动物，非哺乳动物的动物（诸如，例如，鸟、鱼等）等。在一些示例性实施方案中，靶 位点是亚细胞位置或细胞器（诸如，例如，细胞核、细胞质等）。
[0085] 如本文使用的术语"治疗（treating) "和"治疗（treatment) "是指消除、抑制、减 缓或逆转疾病或状况的进展，缓解疾病或状况的临床症状或阻止疾病或状况的临床症状的 出现。术语"预防"在本文中被定义为阻碍受试者获得紊乱或疾病或状况。
[0086] 术语"治疗癌症"涉及包括以下中的一个或更多个：降低癌症的生长速率（即癌症 仍然生长，但以较慢的速度）；停止癌性生长的生长，即，肿瘤生长的停滞，以及，使肿瘤减 小或尺寸减小。术语还包括减少转移瘤的数目、减少形成的新的转移瘤的数目，减缓癌症从 一个阶段至另一个阶段的进展以及减少由癌症诱导的血管发生。在最优选的情况下，肿瘤 完全消除。另外包括在该术语中的是延长正在接受治疗的受试者的存活期，延长疾病进展 的时间、肿瘤消退等。
[0087] 如本文使用的术语"约"是指+/-10%。
[0088] 根据本发明的一些实施方案，提供了包含活化的糖胺聚糖和与其连接的脂质的组 合的改进的Gagomer组合物，其中Gagomer颗粒包封核酸分子，并且其中Gagomer颗粒被用 作递送系统以递送核酸分子至期望的靶位点。靶位点可包括任何靶位点，诸如，但不限于： 细胞、组织、器官、微生物等。靶位点可以是体内或体外的靶位点。
[0089] 根据一些示例性实施方案，改进的Gagomer组合物包含一种或更多种脂质的组 合。组合物中的多个脂质可以是天然的或合成的来源并且可选自，但不限于：阳离子脂质、 具有伯氨基基团的脂质和膜稳定化脂质（膜稳定剂）。例如，阳离子脂质可选自但不限于： 阳离子脂质可选自，但不限于：单阳离子脂质N-[l-(2, 3-二油酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵 丙烧（DOTAP)、BCAT(〇- (2R-12-双-〇-(I'Z, 9'Z-十八碳二稀基）-甘油）-3-N-(二 _2_ 氛 乙基）_氨基甲酸酯）、BGSC(双-胍盐-亚精胺-胆固醇）、BGTC(双-胍盐-三氨乙基 胺-胆固醇）、CDAN(N' -胆固醇基氧羰基-3, 7-二氮杂壬烷-1，9-二胺）、CHDTAEA(胆固 醇基半二硫代二甘醇基三（氨（乙基）胺）、DCAT(0-(1，2-二-0-(9'Z-十八碳烯基）-甘 油）-3_N-(双-2-氨乙基）-氨基甲酸酯）、DC-Chol(3P-[N-(N'，N' -二甲基氨（乙基） 氨基甲酰基胆固醇）、DLKD(0, 0' -二月桂基N-赖氨酰天冬氨酸酯）、DMKD(0, 0' -二肉 豆蘧基N-赖氨酰天冬氨酸酯）、D0G(二油基甘油、DOGS(二（十八碳烯基）酰氨基甘氨 酰基精胺）、D0GSDS0(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酰基-2-羟乙基二硫鸟氨酸）、 D0PC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、D0PE(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙 醇胺、D0SN(二油基琥珀酰乙基硫代新霉素）、D0SP(二油基琥珀酰巴龙霉素）、DOST(二油 基琥珀酰妥布霉素）、D0TAP(1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷）、D0TMA(N' [1- (2, 3-二油酰 氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵）、DPTOS(二棕榈酰磷脂酰乙醇酰氨基精胺）、DDAB(双 十八烷基二甲基溴化铵）和D0DAP(1，2-二油酰基-3-二甲基-丙烷）及其任何盐以及其 任何组合。例如，具有伯氨基基团的脂质（磷脂酰乙醇胺）可选自，但不限于：1，2_二月桂 酰基-L-磷脂酰乙醇胺（DLPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1，2-二 植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhPE)、1，3-二棕榈酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1-棕榈酰基-3-油酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-P0PE)、生物素-磷 脂酰乙醇胺、1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙 醇胺（DPPE)，以及其组合。例如，膜稳定化脂质可选自，但不限于：胆固醇、磷脂（诸如， 例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油 (diphosphatidylglycerols))、脑磷脂、鞘脂（鞘磷脂和糖鞘脂）、甘油糖脂以及其组合。每 个可能性是独立的实施方案。
[0090] 在一些实施方案中，脂质不是D0TMA(N'[l-(2,3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三 甲基氯化铵）。
[0091] 根据一些实施方案，在Gagomer的脂质组合物（颗粒脂质组合物）中的各种脂质 之间的比可发生变化。在一些实施方案中，比为摩尔比。在一些实施方案中，比为重量比。 在一些实施方案中，脂质组的每个可以为约1% -99%的摩尔比/重量比。
[0092] 根据一些示例性实施方案，可确定各种脂质之间的比例，使得对于包封于Gagomer 内的核酸其提供最大的效力。最大效力可包括这样的示例性参数如，但不限于：Gagomer的 稳定性、保护包封于Gagomer内的核酸、祀向递送核酸至期望的祀位点、由核酸在祀位点发 挥的最大的生物效应；Gagomer中的核酸的最高有效载量等，以及其组合。
[0093] 根据一些示例性实施方案，当脂质组合物包含阳离子脂质、膜稳定化脂质和/或 具有伯氨基基团的脂质时，脂质组的每个可以是约1% -99%的摩尔比或重量比。例如， 阳离子脂质可以是脂质组合物的10% -90% ;具有伯氨基基团的脂质可以是脂质组合物 的1% -50% ;且膜稳定化脂质可以是脂质组合物的10% -90%。以下是示例性的脂质 组合物：1.阳尚子脂质：30-80%，具有伯氣基基团的脂质：5% -25 %，|旲稳定化的脂质： 10% -50% ;2.阳离子脂质：50% -70%，具有伯氨基基团的脂质：8% -12%，膜稳定化的脂 质：20%-40%;3.阳离子脂质：55-65%，具有伯氨基基团的脂质：9%-11%，膜稳定化的脂 质：25% -35% -50%。
[0094] 根据一些实施方案，还可调整核酸和Gagomer的脂质组合物之间的重量比，以达 到由核酸在靶位点上发挥最大的生物效应。如本文所示例的，已令人惊奇和意外地发现，对 于siRNA分子，高的脂质对siRNA重量比提供了改进的生物效应。已意外地发现，siRNA的 水平和生物效应之间不存在直接相关性。不希望受限于理论或机制，siRNA的水平和生物 效应之间的直接相关性的缺乏可至少部分归因于靶位点的载量能力，即细胞内的RNAi机 制的超载量，其利用siRNA发挥抑制在靶位点内的靶的表达的生物效应，可导致减弱RNAi 机制的活性。因此，为了实现最大反应，递送至靶位点的siRNA的量应超RNAi机制的负荷。 因此，siRNA对脂质的重量比小于1:1。例如，siRNA和脂质组合物之间的重量比可为1:1。 例如，siRNA和脂质组合物之间的重量比可为1:2。例如，siRNA和脂质组合物之间的重量 比可为1:5。例如，siRNA和脂质组合物之间的重量比可为1:10。例如，siRNA和脂质组合 物之间的重量比可为1:20。
[0095] 根据一些实施方案，用于制备改进的Gagomer使用的糖胺聚糖可包括任何未修饰 的和/或修饰的糖胺聚糖以及修饰的糖胺聚糖。在一些实施方案中，糖胺聚糖可选自但不 限于：HA、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、以及其盐。糖胺聚糖 可呈不同长度。在一些示例性实施方案中，糖胺聚糖是高分子量（HMW)HA。在一些示例性 实施方案中，糖胺聚糖是低分子量（LMW)HA。在其他示例性实施方案中，糖胺聚糖是具有 不同分子量的HA的组合。根据一些实施方案，糖胺聚糖可在与Gagomer的其他组分反应 之前被活化。例如，活化可包括，但不限于，酸化糖胺聚糖，添加交联剂至糖胺聚糖等。在 示例性实施方案中，交联剂可以是选自以下的碳二亚胺，但不限于：EDC(EDAC，EDCI，1-乙 基-3- (3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）、DCC(N，N' -二环己基碳二亚胺）、和DIC(N，N' -二 异丙基碳二亚胺）。
[0096] 根据另外的实施方案，在与脂质组合物反应之前，另外的分子/部分可被首先附 着至糖胺聚糖。另外的分子可以是，例如，抗体、叶酸、吓啉、或凝集素，并且可用于将改进的Gagomer祀向至特定的祀位点。在另外的实施方案中，另外的分子/部分可附着至Gagomer。
[0097] 在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约50nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约100nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约200nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约750nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约lOOOnm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约1500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约2000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约2500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约3000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约3500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约4000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约4500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约5000nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有超过约500nm的范围内的 粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有约50nm-12微米的范围内 的粒径。在一些实施方案中，脂化的糖胺聚糖颗粒（gagomer)具有约500nm-5微米的范围 内的粒径。
[0098] 在一些实施方案中，改进的Gagomer组合物不包括D0TMA(N' [1-(2, 3-二油酰氧 基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵）。在一些实施方案中，改进的Gagomer组合物缺乏 D0TMA(N' [1-(2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵）。
[0099] 根据一些实施方案，提供了用于制备用于递送核酸的改进的Gagomer组合物的方 法，该方法包括以下步骤的一个或更多个：
[0100] a)形成颗粒脂质组合物：以期望的比例将一种或更多种脂质混合在有机溶剂 中；通过蒸发形成均匀的脂质组合物（例如，以形成脂质膜）；在适当的缓冲液中分散（悬 浮）脂质膜；通过在加热的脂质挤出机中连续过滤脂质分散液获得期望的粒径（例如，在 10-200nm的尺寸）；
[0101] b)活化糖胺聚糖：将糖胺聚糖溶解于酸性缓冲液中；加入交联剂以形成活化的糖 胺聚糖；
[0102] c)Gag〇mer组合物形成：将步骤a)的颗粒脂质组合物以期望的重量比与核酸温育 一段时间，之后将活化的糖胺聚糖加入以形成改进的Gagomer组合物。
[0103] 根据一些实施方案，制备改进的Gagomer组合物的方法可包括各种修改以精细地 调整Gagomer的组分以及组分之间的比例，以获得最有效的Gagomer组合物。修改可包括， 例如，这样的参数如，但不限于：用于脂质组合物形成的特定脂质、脂质组合物的脂质之间 的比率、将封装于Gagomer内的核酸的身份、核酸和脂质组合物之间的比率、使用的特定糖 胺聚糖、糖胺聚糖和脂质组合物之间的比例、进行反应的pH、进行反应的温度、形成反应的 条件（有/无搅拌）、各个步骤的时间长度等，或其任何组合。
[0104] 根据示例性实施方案，对于制备包封siRNA分子的改进的Gagomer组合物，该方 法的步骤可包括至少以下特定调整的参数以提供最有效的Gagomer用于递送siRNA:颗粒 脂质组合物可包含60%阳离子脂质（其可包括，例如，D0TAP)、30%膜稳定化脂质（其可包 括，例如，胆固醇）和10%具有伯氣基基团的脂质（其可包括，例如，DLPE);可将脂质|吴溶 解于pH9.0的硼酸盐缓冲液；siRNA和脂质组合物之间的重量比可以是1:10 ;在脂质组合 物-siRNA和活化的HA之间的温育的最终步骤可在37°C下进行过夜，不搅拌。
[0105] 根据一些实施方案，用于制备本发明的改进的Gagomer的方法可有利地导致均匀 分布的脂质组合物粒径，如本文进一步说明的（实施例1)。
[0106] 在另外的实施方案中，在Gagomer结构的形成中不存在脂质体的形成，而是，将脂 质组合物共价地附着至糖胺聚糖。
[0107] 根据一些实施方案，通过本发明的方法形成的改进的Gagomer可在形成的各个 阶段被冻干或脱水。例如，可在除去溶剂之后并在加入核酸之前将脂质膜冻干。例如，月旨 质-核酸组合物可被冻干并很容易脱水。例如，Gagomer(包封核酸的脂化的糖胺聚糖）可 被冻干并容易脱水。
[0108] 根据一些实施方案，本发明的改进的Gagomer组合物显示了包封的高效率。在一 些示例性实施方案中，单一Gagomer可包封约7500个siRNA分子，其高于本领域已知的其 他siRNA载体的包封能力。
[0109] 现参考图1，其是根据一些实施方案的包封核酸分子的改进的Gagomer的结构的 示意图。如图1中所示，Gagomer,诸如，例如Gagomer10,包含以下脂质的组合：诸如，例如 阳离子脂质（例如，如图1中16A-C所示的阳离子脂质）、具有伯氨基基团的脂质（例如， 如图1中14A-C所示的脂质）和膜稳定化脂质（例如，如图1中18A-C所示的膜稳定化脂 质），其被连接/附着在一起以形成颗粒脂质组合物，其还可被过滤器挤出以减小其尺寸至 期望的尺寸。将核酸分子（例如，如图1中20A-C所示的核酸分子）加入至颗粒脂质组合 物。带负电荷的核酸分子可结合脂质组合物中带正电荷的阳离子脂质。将不同长度的活化 的具有羧基残基的糖胺聚糖分子（例如，如图1中12A-C所示的糖胺聚糖分子）共价交联 至具有伯氨基基团的脂质的伯氨基团上，并包裹脂质_核酸复合物以形成保护性外表面并 形成改进的Gagomer结构。除了在活化的糖胺聚糖和具有伯氨基基团的脂质之间形成的共 价键，还在Gagomer的各种成分之间形成静电相互作用，由此进一步稳定其结构并对包封 于其中的核酸提供增强的保护。在一些实施方案中，Gagomer结构是球形。Gagomer结构并 不一定形成球形。
[0110] 在一些示例性实施方案中，图1中呈现的改进的Gagomer可包括以下组分：阳离子 脂质包括D0TAP、具有伯氨基基团的脂质包括DLPE、膜稳定化脂质包括胆固醇、核酸分子包 括双链的siRNA分子，以及糖胺聚糖分子包括高分子量透明质酸（HA)。
[0111] 根据一些实施方案，不希望束缚于理论或机理，图1中所示的改进的Gagomer结构 的形成产生可重复的和控制的结构，该结构对包封的核酸针对周围环境提供保护并提供有 效递送装置以将核酸递送至靶位点，其中核酸可被释放并发挥其生物效应。形成的结构还 提供核酸/每Gagomer的高载量能力。在一些示例性实施方案中，单一Gagomer可包封约 7500个siRNA分子。此外，如下显示，在将核酸和糖胺聚糖加入脂质组合物并形成Gagomer 之后，Gagomer获得了负电荷。这对体内递送是特别重要的，由此包封核酸颗粒的Gagomer 不被生物体身体感知到带正电荷，由此赋予Gagomer颗粒"隐身"模式。因此，不具有任何 暴露的阳离子脂质的核酸-Gagomer颗粒对颗粒提供另外的益处，因为其阻止与，例如，可 形成聚集体的血清蛋白发生不希望的相互作用，其不诱导免疫应答并且外面的HA阻止颗 粒被鉴定为外来颗粒，并且因此，允许颗粒为核酸的改进的体内递送装置。特别是，改进的 Gagomer组合物阻止在体内施用后由阳离子脂质发挥的已知的毒性效应。
[0112] 根据一些实施方案，改进的Gagomer组合物可被用于治疗需要其的生物体中的各 种病理状况。
[0113] 根据一些实施方案，改进的Gagomer组合物可原样来施用。在一些实施方案，改进 的Gagomer组合物可在溶液中来施用。在一些实施方案中，Gagomer组合物可被配制为合适 的药物组合物以通过任何期望的施用途径来施用。施用的示例性途径包括这样的途径如， 但不限于：局部、口服或肠胃外。取决于施用的预期模式，使用的组合物可呈以下形式：固 体、半固体或液体剂型，诸如，例如，片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉剂、液体、悬浮液等，优选地以 适于精确剂量的单一施用的单位剂型。药物组合物可包括改进的Gagomer、药学上可接受的 赋形剂，并任选地，可包括其他医药剂、药物试剂、载体、佐剂等。药学上可接受的载体是对 包封于Gagomer中的核酸是惰性的并且在使用的条件下不具有有害的副作用或毒性的载 体是优选的。
[0114] 在一些实施方案中，用于肠胃外施用的可注射的制剂可被制备为液体溶液或悬浮 液，适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或为乳剂。合适的赋形剂是，例如，水、 盐水、右旋糖、甘油、乙醇等。此外，如果需要，待施用的药物组合物还可包含少量的无毒的 辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，诸如例如，乙酸钠，脱水山梨醇单月桂酸酯、 油酸三乙醇胺等。含水注射悬浮液还可包含增加悬浮液的粘度的物质，包括，例如，羧甲基 纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含稳定剂。肠胃外制剂可存在于单 位剂量或多剂量密封容器，诸如安瓿和小瓶中，并且可存储在冷冻干燥（冻干）条件下，在 使用前，仅需立即加入无菌液体载体，诸如，例如，水，用于注射。
[0115] 在其他实施方案中，对于口服施用，药学上可接受的、无毒的组合物可通过掺入以 下的任何通常采用的赋形剂来形成：诸如，例如，甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑 石、纤维素、交联羧甲基纤维素钠、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁，等。此类组合物包括溶液、 混悬液、片剂、可分散片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等。适于口服施用的制剂可由以下 组成：液体溶液，诸如有效量的溶解于稀释剂诸如水、盐水或橙汁中的化合物；囊剂、含片 (lozenges)、以及锭剂（troches),各包含预定量的作为固体或颗粒的活性成分；粉末、适 当液体中的悬浮液；以及合适的乳液。液体制剂可包括稀释剂，诸如水和醇，（诸如，例如乙 醇、苯甲醇、和聚乙烯醇），加入或不加入药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂、或乳化剂。
[0116] 在确定待施用的改进的Gagomer组合物的剂量时，关于包封于Gagomer内的特定 核酸分子的药理学性质，选择施用的剂量和频率。
[0117] 在一些示例性实施方案中，取决于siRNA的身份、祀位点等，Gagomer-siRNA可被 用于治疗各种病理状况。示例性病理状况可选自，但不限于：各种类型的癌症、各种感染 (诸如，例如，病毒性感染、细菌感染、真菌感染等）、自身免疫性疾病、神经变性疾病、炎症 (例如，炎症性肠病诸如克罗恩病、结肠炎，等）、眼相关的综合征和疾病、肺相关的疾病、胃 肠相关综合征和疾病等。
[0118] 在一些示例性实施方案中，空的或包封核酸的改进的Gagomer(诸如 Gagomer-siRNA组合物）可被用于治疗癌症。癌症是其中细胞群在不同程度上已变得对通 常支配增殖和分化的控制机制无响应的紊乱。癌症是指包括转移至不同部位的各类恶性新 生物和肿瘤。可通过改进的Gagomer和/或改进的Gagomer-核酸（诸如Gagomer-siRNA) 组合物治疗的癌症的非限制性实例是卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、结肠 癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、尤因氏肉瘤、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、头颈癌、肾癌、 骨癌、肝癌和甲状腺癌。癌症的具体实例包括这样的类型如，但不限于：腺癌、肾上腺瘤、成 釉细胞瘤、间变性肿瘤、甲状腺细胞的未分化癌、血管纤维瘤、血管瘤、血管肉瘤、apud瘤、 嗜银细胞瘤（argentaffinoma)、卵巢男性细胞瘤（arrhenoblastoma)、腹水肿瘤细胞、腹水 肿瘤、星形母细胞瘤（astroblastoma)、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、心房粘液 瘤、基底细胞癌、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、癌、小脑星形 细胞瘤、子宫颈癌、樱桃状血管瘤、胆管癌、胆管瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、成绒 毛膜细胞瘤（chorioblastoma)、绒毛膜癌、结肠癌、普通急性成淋巴细胞性白血病、颅咽管 瘤、囊性癌（cystocarcinoma)、囊性纤维瘤（cystofibroma)、囊瘤、细胞瘤、皮肤T-细胞淋 巴瘤、导管原位癌、导管乳头状瘤、无性细胞瘤、脑瘤、子宫内膜癌、内皮瘤、室管膜瘤、上皮 瘤、红白血病、尤因氏肉瘤、结外淋巴瘤、猫肉瘤、纤维腺瘤、纤维肉瘤、甲状腺滤泡癌、神经 节神经胶质瘤、胃泌素瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、性腺胚细胞瘤、成血管细胞 瘤（haemangioblastoma)、成血管内皮细胞瘤（haemangioendothelioblastoma)、血管内皮 瘤、血管外皮细胞瘤（haemangiopericytoma)、血管淋巴管瘤（haematolymphangioma)、成 血细胞瘤（haemocytoblastoma)、血细胞瘤（haemocytoma)、毛细胞白血病、错构瘤、肝癌、 肝细胞癌、肝瘤、组织瘤（histoma)、霍奇金病、格拉维次氏瘤（hypernephroma)、浸润性癌、 浸润性导管癌、胰岛细胞瘤、青少年纤维血管瘤、卡波西肉瘤、肾肿瘤、大细胞淋巴瘤、白血 病、慢性白血病、急性白血病、脂肪瘤、肝癌、肝转移、吕克癌（Luckecarcinoma)、淋巴腺瘤、 淋巴管瘤、淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴细胞瘤（lymphocytoma)、淋巴管性 水肿、淋巴瘤、肺癌、恶性间皮瘤、恶性畸胎瘤、肥大细胞瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、 间皮瘤、转移癌、莫顿神经瘤、多发性骨髓瘤、成骨髓细胞瘤（myeloblastoma)、骨髓性白血 病、骨髓脂肪瘤、骨髓瘤、成肌细胞瘤、粘液瘤、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤 维瘤、神经纤维瘤病、神经胶质瘤、神经瘤、非何杰金氏淋巴瘤、少突神经胶质瘤、视神经胶 质瘤、骨软骨瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤 (phaeochromocytoma)、嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma)、楽细胞瘤、原发性脑肿瘤、突变 瘤（progonoma)、泌乳素瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma)、 横纹肌肉瘤（rhabdosarcoma)、实体瘤、肉瘤、继发性肿瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞癌、 鳞状细胞癌、草莓血管瘤、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、胸腺瘤、滋养细胞肿瘤、致肿瘤性 (tumourigenic)、前庭神经鞘瘤、肾母细胞瘤、或其组合。
[0119] 根据一些实施方案，因此提供了用于治疗癌症的方法，包括向需要其的受试者施 用Gagomer或Gagomer-siRNA或包含Gagomer或Gagomer-siRNA的药物组合物的步骤。在 一些实施方案中，提供了用于治疗需要其的受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者 施用Gagomer-siRNA或包含Gagomer-siRNA的药物组合物，由此治疗受试者中的癌症。在 一些实施方案中，提供了Gagomer-siRNA或包含Gagomer-siRNA的药物组合物用于治疗癌 症的用途。
[0120] 虽然若干示例性方面和实施方案已被以上讨论，但本领域技术人员将认识到某些 修改、置换、增加或其亚组合。因此，意图，以下所附权利要求书和下文引入的权利要求书被 解释为包含所有此类修改、置换、添加和亚组合，因为在其真实精神和范围内。
[0121] 以下实施例是为了更充分地说明本发明的某些实施方案而展示。然而，其不应以 任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可容易地设计出本文公开的原则 的许多变化和修改，而不偏离本发明的范围。 实施例
[0122] 实施例1-包封siRNA的改进的Gagomer组合物的制备
[0123] a)脂质纟目合物的制各：
[0124] 将以下脂质（表1)称重到具有95%乙醇的玻璃长颈烧瓶中并在65°C水浴中搅拌 溶解：
[0125] 复1
[0126] MW第一脂质（D0TAP) 698. 54
[0127] 第一脂质的％ 60%
[0128] MW第二脂质（胆固醇） 386.54
[0129] 第二脂质的％ 30%
[0130] MW第三脂质（DLPE) 579.8
[0131] 第三脂质的％ 10%
[0132] 各脂质的摩尔 1.686E-06
[0133] 第一脂质制品的重量（mg) 70.67
[0134] 第二脂质制品的重量（mg) 19.55
[0135] 第三脂质制品的重量（mg) 9.77
[0136] 脂质的最后重量（mg) 100
[0137] 将具有干净悬浮液的烧瓶放置于Buchi210蒸发器中并且形成脂质膜（全 真空，60°C)。为确认乙醇蒸发，将烧瓶放置于队气流下20-30秒。通过在60°C水浴 中旋转烧瓶15-30秒，将脂质膜分散于10ml100mMpH9.0硼酸盐缓冲液中。然后，将 烧瓶以完全颠倒旋转涡旋2分钟，并在37 °C下在轨道摇床上温育2小时。由在加热 (60 °C)的脂质压出机（thermobarrellipidextruded,NorthernLipids)中通过各种 滤器（200nm(X5)，100(X5)，200(xl))的连续脂质分散液过滤获得了期望的脂质粒径 (80_200nm)。
[0138] b)诱明质酸的活化
[0139] 37°C下将透明质酸溶解于乙酸盐缓冲液（100mM乙酸钠（MPBiomedicals,目录号 127-09-3)，lllmMNaCl，pH4. 0)中至2mg/ml的终浓度1小时，伴随搅拌直至获得澄清溶 液。
[0140] 将1-乙基_3(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺迮0(：交联剂）以2(^撤(《/?)加入， 并在37°C、伴随搅拌/振摇下温育1小时。
[0141] c)Gagomer组合物形成
[0142] 将 2ii1 (2. 66iig)的siRNA(储备液 100iiM于siRNA缓冲液中，Darmacon)加入 进 2. 68ii1 的OptiMEM(Invitrogen),并且与 2. 66ii1 (26. 6iig)的脂质载体（lOmg/ml)室 温下温育15分钟。将2. 66ill的HA-EDC(5. 32iigHA)加入并在37°C、无搅拌下温育过夜。
[0143] 实施例2-Gagomer的颗粒脂质组合物的尺寸分布
[0144] 图2A-C中显示的结果来自使用（筛选器的分析，显示脂质组合物的粒径分布。
[0145] 图 2A中显不的结果是在通过 400nm(x4)、200nm(x4)、100nm(x4)和 50nm(x4)nm滤 器挤压后制备的颗粒脂质组合物。结果显示粒径是不均匀的。主峰（62.7%)超过400nm 粒径，并且仅有约30%是期望的100-150nm大小。
[0146] 图2B和2C中显示的结果是通过本发明的方法在通过200nm(x7)、和200nm(x5)滤 器挤压脂质组合物之后制备的颗粒脂质组合物（如实施例1中详述的制备）。结果显示，在 100%分布下获得了单一、独特的峰，其在约135nm的平均尺寸下是非常可重复的。
[0147] 因此，结果显示，根据本发明的方法制备的本发明的脂质组合物，提供了期望的纳 米尺寸的均匀大小的颗粒。
[0148] 实施例3-在形成siRNA-Gagomer结构后脂质组合物的性质的变化。
[0149] 图3中所示结果，图A-C，显示4电位（mV)的变化：图（A):单独脂质组合物 (未加入siRNA或活化的HA)-约+61.2mV的正电荷。图⑶：在加入siRNA后，电荷减少 至-6. 05mV。图（C):在将活化的HA加入至脂质组合物-siRNA并形成Gagomer组合物后， 电荷变化至平均约-28. 5mV的负电荷。因此，结果显示，通过加入活化的HA和siRNA使阳 离子脂质净电荷为负。这对体内递送是特别重要的，由此颗粒不被身体感知到带正电荷，由 此赋予颗粒"隐身"模式。siRNA-Gagomer颗粒不具有任何暴露的阳离子脂质的发现对颗粒 提供另外的益处，因为其阻止与可形成聚集体的血清蛋白发生不希望的相互作用；其不诱 导免疫应答并且外面的HA阻止颗粒被鉴定为外源的。
[0150] 实施例4-改进的Gagomer结构保护包封于其中的siRNA。
[0151] 显示了包封于改进的Gagomer内的未修饰的siRNA在人血清中37°C下温育至少3 小时是稳定的。图4A所示结果显示包封的siRNA是稳定的并且未降解的，而对照，未包封 的siRNA在温育1小时后完全降解。冋样地，图4B中对照siRNA在温育60分钟时显不降 解产物，而包封于Gagomer内的siRNA甚至在180分钟后仍被保护。
[0152] 图4C所示结果还显示包封于Gagomer内的siRNA(使用交替2-0-甲基化化学修 饰的siRNA)甚至在温育48小时后在人血清中仍被保护。结果还显不，完整Gagomer颗粒 结构（即，包含脂质组合物和HA的Gagomer结构）提供最好的保护，而仅包含脂质组合物 但无HA的颗粒不同样有效保护siRNA。
[0153] 实施例5-确定改进的Gagomer组合物中siRNA对脂质的重量比
[0154] 向NCI/ADR-RES细胞引入了各种Gagomer-siRNA组合物并确定了pGP(MDRl)的表 达水平。图5中所示结果显示了细胞在各种实验条件下的FACS分析。
[0155] 测试了若干Gagomer组合物，各具有不同的脂质对siRNA重量比。令人惊讶的结 果显示，在更高脂质对siRNA比下，观察到siRNA对祀位点的改进的效应。如图5所示，以 具有1:10的siRNA对脂质比的Gagomer组合物，可见pGP蛋白的表达的最高减少（上图）， 而以具有1:2的siRNA对脂质比的Gagomer组合物观察到pGP的表达的最小减少（下图）。
[0156] 实施例6-由改进的Gagomer-siRNA组合物介导的各种基因的表达的减少。
[0157] 向NCI/ADR-RES细胞系（NAR)转染了Gagomer-siRNA组合物，其中siRNA分子针 对Ahal或Kifl1。转染了 100个相关的siRNA后24小时，收获细胞并通过使用实时RT-PCR 方法确定Ahal和KifllmRNA的表达水平。将样品针对PIP(亲环蛋白B(Cyclophilin B))基因表达水平进行标准化。示于图6A-B中的结果来自两个独立的实验。结果显示由 Gagomer-siRNA(分别，siAhal和siKifll)产生的Ahal(图 6A)和Kifll(图 6B)的表达相 对减少。阴性对照是以包封针对萤光素酶基因的siRNA(siLuc)的Gagomer转染的细胞，其 能够靶向萤光素酶基因，萤光素酶基因仅内源表达于萤火虫细胞。作为阳性对照，为了证明 测试的siRNA是活性的，使用商购可得siRNA转染试剂（Lipofectamine，获自Invitrogen) 以转染针对Ahal和Kifll的siRNA(分别，Luc+siAhal和Luc+siKifll)。
[0158] 实施例7-由改进的Gagomer-siRNA组合物介导的各种基因的表达的减少-siRNA 的剂量响应效应。
[0159] 实验基本上如实施例6中描述的来进行。将包封各种量的相关siRNA组合物的相 关Gagomer-siRNA组合物转染至细胞，并确定对Ahal(图8A)和Kifl1 (图8B)的表达的减 少的效应。示于图8A-B中的结果显示，在转染进细胞的siRNA的量和由siRNA产生的生物 效应之间不存在直接相关性。如图7A所示，10nMAhalsiRNA的转染导致Aha1的表达的最 高减少，然而增加相同siRNA的量对Ahal的表达的减少具有减弱效应。有趣地，siRNA的最 高量（200nM)显示了对Ahal的表达的最低siRNA效应。如图7B所示，100nMKifllsiRNA 的转染导致Kif11的表达的最高减少，然而增加相同siRNA的量至200nM导致siRNA对 Kif1的表达的显著减弱的效应。
[0160] 图7C中还显示了由Gagomer组合物递送进B16F10细胞的GeneAsiRNA的剂量响 应效应。结果显示了高达100nMsiRNA的有效浓度范围。
[0161] 实施例8-由改进的Gagomer-Ahal-siRNA组合物介导的Ahal在各种细胞系中的 表达的减少。
[0162] 实验基本上如实施例6中描述的来进行。B16F10小鼠黑色素瘤细胞系用以下来 转染：Gagomer-AhalsiRNA(siAhasal)、Lipofectamine+AhalsiRNA(siAhsal+Lipofectamin e)和Gagomer-LucsiRNA(si萤光素酶）。确定了Ahal的相对表达。结果不于图8A中的 柱状图。LLC-D122 人细胞系用以下来转染：Gagomer-AhalsiRNA(siAhasal)和Lipofectam ine+AhalsiRNA(siAhsal+Lipofectamine)。确定了Ahal的相对表达。结果不于图 8B中的 柱状图。示于图8A-B中的结果显示Gagomer-siRNA组合物有效减少了相关mRNA在小鼠和 人细胞系中的表达。
[0163] 实施例9-改进的Gagomer-siRNA组合物对细胞的免疫毒性效应的缺乏。
[0164] 测试了PBMC细胞以检测改进的Gagomer-siRNA组合物对细胞的免疫毒性效应。作 为免疫毒性效应的阳性对照，使用了lmg/ml的浓度下的LPS。将PBMC细胞与不同浓度的 AhalsiRNA-Gagomer组合物温育，并且测量了免疫应答（如通过细胞因子或干扰素应答来 测试）。使用从3个不同供体分离的PBMC重复测定（基于ELISA的商业试剂盒9-PLEX人细 胞因子试剂盒，Quansys)。对于PBMC基于Ficoll的分离，血液从MagenDavidAdornBlood Bank获得。使用的siRNA-Gagomer的不同浓度是10、100、500nM，表示有效剂量（ED)(体外 敲低），EDx10 和EDx50。
[0165] 如图9A-D中柱状图所示的结果显示了在所有情形中，PBMC与siRNA-GAG的温育 不引起任何显著免疫应答（未观察到细胞因子或干扰素应答）。结果显示了具有测试的起 源于人供体的内在变异性的细胞因子的不同基线水平的各供体具有相同趋势。图9A显示 了IL6表达中的变化；图9B显示了IL10表达中的变化；图9C显示了INFY表达中的变 化；且图9D显示了TNFa表达中的变化。对于各时间点，图9A-D的每个的柱状图表示以下 处理（从左至右）：100nMsiRNA-Gagomer、500nMsiRNA-Gagomer;1000nMsiRNA-Gagomer; lmg/mlLPS;对照，未处理的细胞（PBMC)。
[0166] 实施例10-在包含DOTAP作为阳离子脂质的Gagomer颗粒与包含DOTMA作为阳离 子脂质的Gagomer颗粒之间的比较。
[0167] 测试了由包含D0TAP作为阳离子脂质的Gagomer颗粒组合物（"D0TAP颗粒"） 或用包含D0TMA作为阳离子脂质的Gagomer颗粒组合物（"D0TMA颗粒"）在人外周血单 核细胞（PBMC)中的细胞因子诱导。各组合物由相同量的脂质（总计：luM)和相同量的 siRNA(lOOnM)以l:10siRNA:脂质的恒定比组成。将HA涂层外壳定量为60iigHA/iimol 脂质。
[0168] 从6名健康志愿者分离PBMC，并将细胞以一式三份进行温育（在24孔板中 200, 000个细胞/孔）。向细胞加入D0TAP颗粒（100nMsiRNA，1iig脂质）、D0TMA颗粒 (100nMsiRNA和liig脂质）。阴性对照为培养基中未经处理的PBMC。LPS(liig/mL)用 作阳性对照。温育后2小时和6小时，对细胞进行IL-6 (炎症的全局标志物）、TNF-a和 IFN-y的ELISA。结果分别示于图10A-C中。
[0169] 如图10A中显示，早在与D0TMA颗粒温育后2h即可鉴定牢固的IL-6诱导。4h后 观察到IL-6浓度的进一步增加。相比之下，与D0TAP颗粒的温育不引起IL-6表达（浓度） 中的任何此类诱导。
[0170] 同样地，如图10B中显示，用D0TMA颗粒处理细胞诱导TNF-a的高水平，甚至在温 育2小时后，然而用D0TPA颗粒的处理不诱导此类反应。如图10C中还显示，用D0TMA颗粒 处理细胞诱导IFN-Y的高水平，甚至在2小时后，然而用D0TAP颗粒的处理不诱导此类反 应。
[0171] 总之，结果令人惊奇地显示，当D0TMA被用作Gagomer颗粒组合物中的阳离子脂质 时，其诱导免疫毒性，然而阳离子脂质D0TAP不诱导此类反应。
[0172] 实施例11-携带siRNA的改进的Gagomer组合物体内时间依赖性生物分布。
[0173] 为了测试siRNA-Gagomer在幼稚和黑色素瘤荷瘤小鼠中的时间依赖性生物分布 研究，使用Cy5-突光标记的siRNA。将包封于改进的Gagomer组合物内的Cy5标记的siRNA 注射进幼稚和荷瘤小鼠中，并且在1、6、24、48和72小时后的不同时间点收获器官（肝、肾、 脾、肺和相关的组中的肿瘤）。使用共聚焦显微镜对冰冻切片制品观察荧光。
[0174] 诱导模型（皮下接种B16F10):将小鼠用B16F10细胞的105个细胞/小鼠皮下注 射进右胁（在注射前约48小时剪切），0. 2ml/小鼠（使用具有29G针头的0. 3ml胰岛素注 射器）。
[0175] IV注射：根据标准程序经由尾静脉IV注射siRNAGagomer复合物（102. 5iil/25g 小鼠）。简言之，将小鼠放置在加热灯下5分钟，放置于限制器中，并使用具有G30针头的 lml胰岛素注射器将gagomer缓慢注射进尾静脉中。
[0176] 收获的器官的荧光显微镜评价：将收获的器官（肿瘤、肝、肺、脾和肾）室温下在 10%中性福尔马林缓冲液中后固定过夜，然后4°C下在30%蔗糖（ICNBiomedicals，Inc.， 目录号190271)中冷冻保护过夜。然后将器官转移至用于包埋的O.C.T.化合物 (Tissue-Tek，目录号4583) 4 °C下避光保护过夜。将5iim厚冰冻组织切片使用低温恒 温器（LeicaCM3050)在新鲜的0CT中来切割，用包含水性封固介质Fluoroshield的 DAPI(Sigma)在SuperfrostPlusslides(ThermoScientific,目录号J1800AMNZ)上固定。 切片使用共聚焦显微镜（OlympusFluoview300和LSMZeiss710)来评估，并且图像使用 ZEN2009软件来获得。只要组织学（显微镜）检查在特定细胞或结构中显示清晰荧光信号， 组织碎片就被认为是阳性的（即，发生成功GAG-Cy5LucsiRNA转移/细胞内掺入）。背景 DAPI染色协助鉴定组织结构。使用对照（未处理的）组织定义Cy5自发荧光信号，并且图 像使用该阈值标准化。
[0177] 现参考图11A，其显示了在施用包封Cy5_标记的siRNA的Gagomer后的指定的时 间点下收获的幼稚或荷瘤小鼠的肝切片的共焦显微象形图。图11A所示结果显示了，发现 所有观察到的Cy5-siRNA在血管内，在相邻细胞中未见荧光。还注意到幼稚和荷瘤小鼠之 间的荧光水平的显著差异。
[0178] 现参考图11B，其显示了肝切片的高分辨率光谱显微镜图。结果显示了，发现所有 观察到的Cy5-siRNA在血管和血窦内，在相邻细胞中未见荧光。图片在Cy5-siRNA施用后6 小时来采集。上图表示显示形态上相关区域的肝的H&E染色的切片。下图显示细胞核（DAPI 染色（虚线箭头）和荧光siRNA(实心箭头）。
[0179] 现参考图11C，其显示了在施用包封Cy5_标记的siRNA的Gagomer后的指定的时 间点下收获的幼稚或荷瘤小鼠的脾切片的共焦显微象形图。图11C所示结果显示了，发现 所有观察到的Cy5_siRNA在红质（redmatter)的血管内，在细胞或白质（whitematter) 中未见荧光。还注意到幼稚和荷瘤小鼠之间的荧光水平的显著差异。
[0180] 现参考图11D，其显示了脾切片的高分辨率光谱显微镜图。结果显示了，发现所有 观察到的Cy5-siRNA在红髓内，在相邻细胞中未见荧光。图片在Cy5-siRNA施用后6小时 来采集。上图表示显示形态上相关区域的脾的H&E染色的切片。下图显示细胞核（DAPI染 色（虚线箭头）和荧光siRNA(实心箭头）。
[0181] 现参考图11E，其显示了在施用包封Cy5_标记的siRNA的Gagomer后的指定的时 间点下收获的幼稚或荷瘤小鼠的肾切片的共焦显微象形图。图11E中所示结果显示了未观 察到荧光。
[0182] 现参考图11F，其显示了肾切片的高分辨率光谱显微镜图。结果显示了未检测到荧 光。图片在Cy5-siRNA施用后6小时来采集。左侧图表示显示形态上相关区域的肾的H&E 染色的切片。右侧图显示了细胞核（DAPI染色（虚线箭头））。
[0183] 现参考图11G，其显示了在施用包封Cy5_标记的siRNA的Gagomer后的指定的时 间点下收获的幼稚或荷瘤小鼠的肺切片的共焦显微象形图。图11G所示结果显示了，发现 所有观察到的Cy5-siRNA在红质的血管内，在相邻细胞中未见荧光。还注意到幼稚和荷瘤 小鼠之间的荧光水平的显著差异。
[0184] 现参考图11H，其显示了肺切片的高分辨率光谱显微镜图。结果显示了，发现所有 观察到的Cy5-siRNA在血管内，在相邻细胞中未见荧光。图片在Cy5-siRNA施用后6小时 来采集。上图表示显示形态上相关区域的肺的H&E染色的切片。下图显示细胞核（DAPI染 色（虚线箭头）和荧光siRNA(实心箭头）。
[0185] 现参考图12A，其显示了在注射包含Cy5标记的siRNA的Gagomer组合物后在不同 的时间点（1小时、6小时、和24小时）下从荷瘤小鼠获得的各种肿瘤/肿瘤区域的冰冻切 片的共聚焦显微镜图。图12A中所示结果显示了，在血管和肿瘤细胞中发现Cy5-siRNA，在 约1小时后具有递送峰值。
[0186] 现参考图12B，其显示了从荷瘤小鼠获得的肿瘤的切片的H&E组织染色。H&E染色 分离的肿瘤以观察形态学上相关区域。在肿瘤内未观察到坏死的迹象，由此最小化EPR效 应。
[0187] 现参考图12C，其显示了从荷瘤小鼠获得的肿瘤的切片的高分辨率光谱荧光显微 图。施用6小时后，在肿瘤血管内以及在相邻的黑素细胞两者中观察到Cy5-siRNA的荧光。 图显示细胞核（DAPI，虚线箭头）和荧光siRNA(实心箭头）。
[0188] 实施例12-体内施用包封siRNA的改进的Gagomer组合物的毒性效应的确定。
[0189] 为了确定体内施用包封siRNA分子的改进的Gagomer组合物的毒性效应（通过静 脉内（IV)施用），40只8-10周龄的C57BL小鼠分为6个实验组，各组具有5只小鼠，和具 有10只小鼠的一个对照组，如表2中描述的。在第0天时，实验组I-VI用快速灌注方式IV 注射进尾静脉来施用。以基于单独体重的恒定体积剂量进行施用。来自实验组VII的动物 被用作完整正常对照。
[0190] 试验材料的说明：针对Ahal的双链化学修饰的siRNA。在无菌条件下，将20mg的 siRNA粉末溶解于lml无菌双蒸水中，以取得澄清的20mg/ml溶液。将溶液储存于-80°C直 到使用。将2. 5ill的20mg/mlsiRNA储备溶液（50iig)与来自10mg/ml储备液的100ill 脂质组合物溶液（50yl(500yg);和50yl(100yg)的活化的（2mgEDC)透明质酸混合， 以取得100U1WFI中最终浓度50iig的siRNA。
[0191] 参数测试：将来自处死的动物的末端血分为2管，一管用于血浆，且一管用于血 清。血楽被用于使用16-重细胞因子试剂盒（Quansys)测试诱导的细胞因子水平。血清被 用于检测肝酶水平（SGPT/ALT、SGOT/AST)，以及胆固醇、甘油三酯和HDL水平。将器官（肝、 脾、肺和肾）收集并在多聚甲醛中固定且包埋于石蜡块中以及用染色并固定于载玻片上 后进行组织学分析。此外，进行处理的对未处理的动物的体重变化。
[0192]表 2
[0193]
【权利要求】
1. 一种组合物，所述组合物包括包含形成颗粒脂质组合物的多个脂质的水不溶性脂化 糖胺聚糖颗粒和包封于所述颗粒内的核酸，其中所述核酸与脂质的重量比小于1:1。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多个脂质包括阳离子脂质和具有伯氨基基团 的脂质。
3. 如权利要求2所述的组合物，其中所述阳离子脂质选自：单阳 离子脂质N-[l-(2,3-二油酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙烷（DOTAP)、 BCAT (〇- (2R-12-双-〇- (I ' Z, 9' Z-十八碳二稀基）-甘油）-3-N-(二 _2_ 氛乙基）-氛基 甲酸酯）、BGSC (双-胍盐-亚精胺-胆固醇）、BGTC (双-胍盐-三氨乙基胺-胆固醇）、 CDAN(N'_胆固醇基氧羰基-3, 7-二氮杂壬烷-1，9-二胺）、CHDTAEA(胆固醇基半二硫代二 甘醇基三（氨（乙基）胺）、DCAT(0-(1，2-二-0-(9'2-十八碳烯基）-甘油）-34-(双-2-氨 乙基）-氨基甲酸酯）、〇〇〇 1〇1(30-[^(^，^-二甲基氨（乙基）氨基甲酰基胆固醇）、 DLKD (0, 0'-二月桂基N-赖氨酰天冬氨酸酯）、DMKD (0, 0'-二肉豆蘧基N-赖氨酰天冬氨酸 酯）、D0G (二油基甘油、DOGS (二（十八碳烯基）酰氨基甘氨酰基精胺）、D0GSDS0 (1，2-二油 酰基-sn-甘油-3-琥珀酰基-2-羟乙基二硫鸟氨酸）、D0PC (1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷 酸胆碱）、D0PE (1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、D0SN(二油基琥珀酰乙基硫代新 霉素）、D0SP (二油基琥珀酰巴龙霉素 ）、DOST (二油基琥珀酰妥布霉素）、D0TAP (1，2-二油 酰基-3-三甲基铵丙烷）、DPPES (二棕榈酰磷脂酰乙醇酰氨基精胺）、DDAB和D0DAP。
4. 如权利要求2所述的组合物，其中所述具有伯氨基基团的脂质选自：1，2-二月桂 酰基-L-磷脂酰乙醇胺（DLPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1，2-二 植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhPE)、1，3-二棕榈酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1-棕榈酰基-3-油酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-P0PE)、生物素-磷脂 酰乙醇胺、1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE)、和二棕榈酰基磷脂酰乙醇 胺（DPPE)。
5. 如权利要求2所述的组合物，其中所述多个脂质还包括膜稳定化脂质。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述膜稳定化脂质选自：胆固醇、磷脂、脑磷脂、鞘 月旨、和甘油糖脂。
7. 如权利要求1所述的组合物，其中所述糖胺聚糖选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮 肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、其盐、及混合物。
8. 如权利要求7所述的组合物，其中所述透明质酸包括高分子量透明质酸。
9. 如权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒脂质组合物具有10_200nm的粒径。
10. 如权利要求1所述的组合物，其中所述核酸包括DNA、RNA、其修饰形式、及其组合。
11. 如权利要求10所述的组合物，其中所述RNA选自811?嫩、11^嫩、8111^、反义1^及 其组合。
12. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多个脂质和所述核酸之间的重量比是10:1。
13. 如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括靶向部分。
14. 如权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒适合于递送所述核酸至靶位点。
15. 如权利要求1所述的组合物，其中所述靶位点选自细胞、组织、器官、以及微生物。
16. 如权利要求1所述的组合物，所述组合物包括包含单阳离子脂质N-[l-(2, 3-二油 酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙烷（D0TAP)的阳离子脂质、包含1，2_二月桂酰基-L-磷脂 酰乙醇胺（DLPE)的具有伯氨基基团的脂质、以及包含胆固醇的膜稳定化脂质。
17. 以冷冻干燥的颗粒的形式的根据权利要求1-16的任一项的组合物。
18. -种药物组合物，所述药物组合物包含以适合于经由选自口服、肠胃外和局部的途 径施用的剂型的根据权利要求1-17的任一项的颗粒。
19. 一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用权利要求1-17的 任一项的组合物、或权利要求18的药物组合物的步骤。
20. -种用于制备包封核酸的脂化的糖胺聚糖组合物的方法，所述方法包括以下步 骤： a) 形成颗粒脂质组合物，包括以下步骤： i) 将一种或更多种脂质在有机溶剂中以期望的比混合并且形成均匀的脂质混合物； ii) 在水性缓冲液中悬浮所述脂质混合物并通过在加热的脂质挤压机中连续过滤脂质 悬浮液获得期望的粒径； b) 活化糖胺聚糖，包括以下： i)将糖胺聚糖溶解于酸性缓冲液中，并加入交联剂，以形成活化的糖胺聚糖；以及 c) 由以下步骤形成所述脂化的糖胺聚糖组合物： i) 将步骤a)中的脂质组合物与所述核酸温育；以及 ii) 将步骤b)中的活化的糖胺聚糖加入至混合物。
21. 如权利要求20所述的方法，其中所述脂质颗粒具有10-200nm的粒径。
22. 如权利要求20所述的方法，其中所述有机溶剂从所述脂质混合物蒸发以形成脂质 膜。
23. 如权利要求20所述的方法，所述方法还包括冷冻干燥所述脂质颗粒。
24. 如权利要求20所述的方法，其中所述脂质包括阳离子脂质和具有伯氨基基团的脂 质。
25. 如权利要求24所述的方法，其中所述阳离子脂质选自：单阳 离子脂质N-[l-(2,3-二油酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙烷（DOTAP)、 BCAT (〇- (2R-12-双-〇- (I ' Z, 9' Z-十八碳二稀基）-甘油）-3-N-(二 _2_ 氛乙基）-氛基 甲酸酯）、BGSC (双-胍盐-亚精胺-胆固醇）、BGTC (双-胍盐-三氨乙基胺-胆固醇）、 CDAN(N'_胆固醇基氧羰基-3, 7-二氮杂壬烷-1，9-二胺）、CHDTAEA(胆固醇基半二硫代二 甘醇基三（氨（乙基）胺）、DCAT(0-(1，2-二-0-(9'2-十八碳烯基）-甘油）-34-(双-2-氨 乙基）-氨基甲酸酯）、〇〇〇 1〇1(30-[^(^，^-二甲基氨（乙基）氨基甲酰基胆固醇）、 DLKD (0, 0' -二月桂基N-赖氨酰天冬氨酸酯）、DMKD (0, 0' -二肉豆蘧基N-赖氨酰天冬氨酸 酯）、D0G (二油基甘油、DOGS (二（十八碳烯基）酰氨基甘氨酰基精胺）、D0GSDS0 (1，2-二油 酰基-sn-甘油-3-琥珀酰基-2-羟乙基二硫鸟氨酸）、D0PC (1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷 酸胆碱）、D0PE (1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、D0SN(二油基琥珀酰乙基硫代新 霉素）、D0SP (二油基琥珀酰巴龙霉素 ）、DOST (二油基琥珀酰妥布霉素）、D0TAP (1，2-二油 酰基-3-三甲基铵丙烷）、DPPES (二棕榈酰磷脂酰乙醇酰氨基精胺）、DDAB和D0DAP。
26. 如权利要求24所述的方法，其中所述具有伯氨基基团的脂质选自：1，2-二月桂酰 基-L-磷脂酰乙醇胺（DLPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1,2-二 植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhPE)、1，3-二棕榈酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1-棕榈酰基-3-油酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-POPE)、生物素-磷脂 酰乙醇胺、1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE)、和二棕榈酰基磷脂酰乙醇 胺（DPPE)。
27. 如权利要求24所述的方法，其中所述脂质还包括膜稳定化脂质。
28. 如权利要求25所述的方法，其中所述膜稳定化脂质选自：胆固醇、磷脂、脑磷脂、鞘 月旨、和甘油糖脂。
29. 如权利要求20所述的方法，其中所述糖胺聚糖选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮 肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、其盐、及混合物。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述透明质酸包括高分子量透明质酸。
31. 如权利要求20所述的方法，其中所述核酸与所述脂质颗粒的重量比小于1:1。
32. 如权利要求20所述的方法，其中所述核酸包括DNA、RNA、其修饰形式、及其组合。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述RNA选自siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、及 其组合。
【文档编号】C12N15/88GK104271749SQ201380020641
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年4月18日
【发明者】丹·培尔, 伊芙吉尼娅·阿尔佩特 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司, 奎尔特治疗有限公司