一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤：（1）将裂殖壶菌活化培养成裂殖壶菌种子液；（2）将裂殖壶菌种子液接入发酵罐进行培养，培养条件：25至28摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，同时流加补料，包括碳源、氮源以及甘油，维持甘油浓度在0至10.0克/升；（3）发酵稳定期，控制温度在18至23摄氏度之间，通气并保持恒定转速搅拌；（4）当发酵液中碳源浓度低于5.0克/升时结束发酵，收集湿菌体得到富含二十二碳六烯酸的油脂。本发明应用于大规模发酵生产二十二碳六烯酸，能提高裂殖壶菌的生物量和DHA含量，使DHA油脂产品品质大大提高，进一步提高油脂品质，降低能量消耗及生产成本。
【专利说明】一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵领域，更具体地，涉及一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法。
【背景技术】
[0002]二十二碳六烯酸(DHA)属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。DHA大量存在于人体视网膜及大脑皮层的神经组织中，有促进脑部及视力发育，提高智力，改善记忆力和视力的作用；此外，它还能阻止胆固醇在血管壁上沉积，预防或减轻动脉粥样硬化及冠心病的发生。[0003]传统DHA的生产途径主要来源于深海鱼油的提取纯化，而深海鱼油资源十分有限，生产成本高，品质不稳定，产量远不能满足市场需求，且近年来海洋环境遭到严重破坏，使其安全性受到严重质疑，迫切需要寻找一种可规模化生产DHA的新途径。目前，已发现一些低等海洋细菌、海洋真菌和微藻类，如希瓦氏菌(Shewanella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、寇氏隐甲藻(Crythecodinium cohnii)等都能合成DHA。由于微生物，具有生长快、营养要求低、且易于进行大规模培养等特点，成为规模化生产DHA的首选途径。尤其是裂殖壶菌，生长周期短，生物量及油脂含量高，目标产物DHA生产率较高，在DHA生产上得到广泛应用
[0004]然而目前利用裂殖壶菌生产DHA的方法DHA，DHA含量不超过50%，进一步提高DHA含量，将大幅提高产品品质，从而在不增加成本的情况下大幅增加收益。同时，现有技术为维持菌体正常生长，因此需要维持发酵罐大量通气，能耗较大。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其目的在于通过甘油诱导裂殖壶菌增加DHA的合成量，由此进一步提高DHA产量，使DHA油脂产品品质大大提高，降低DHA生产成本。
[0006]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤:
[0007]( I)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液；
[0008](2)将裂殖壶菌种子液按照体积百分比2%至4%接入发酵罐进行培养，培养温度25摄氏度至28摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，同时流加补料，所述补料包括碳源、氮源以及甘油，维持甘油浓度在O至10.0克/升的范围内；
[0009](3)进入发酵稳定期后，即溶氧度不再下降后，控制发酵温度在18摄氏度至23摄氏度之间，通气并保持恒定转速搅拌；
[0010](4)当发酵液中碳源浓度低于5.0克/升时结束发酵，收集湿菌体从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
[0011]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其所述步骤(2)中流加补料是根据发酵液中碳源浓度水平分批次流加，所述碳源优选为葡萄糖和/或麦芽糖，所述氮源优选为酵母粉和/或谷氨酸钠。
[0012]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其所述步骤(2)分三次流加补料，每次流加补料，当发酵液中碳源浓度下降至20.0克/升至30.0克/升范围内时开始流加，当发酵液中碳源浓度在30.0克/升至40.0克/升之间，氮源浓度在2.0克/升至4.0克/升之间，且甘油浓度在5.0克/升至10.0克/升时停止流加。
[0013]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其所述裂殖壶菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp) S056，于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M2013459。
[0014]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其步骤(2)控制通气量在10立方/小时至50立方/小时之间，步骤(3)控制通气量在10立方/小时至30立方/小时之间。
[0015]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其所述步骤(1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液，包括以下子步骤:
[0016](a)种子培养:
[0017]向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为1%至5%，在摇床转速150转/分钟至220转/分钟、培养温度22摄氏度至28摄氏度的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液；
[0018](b)种子扩大培养:
[0019]将步骤(a)得到的摇瓶种子液接入种子培养罐中的种子扩大培养基进行扩大培养，接种量体积百分比为1%至5%，搅拌转速150转/分钟至300转/分钟，通气量0.2立方/小时至15立方/小时，培养温度22摄氏度至28摄氏度的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。
[0020]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其所述步骤(a)中的种子培养基组分:葡萄糖30.0克/升至60.0克/升，酵母粉5.0克/升至10.0克/升，蛋白胨1.0克/升至5.0克/升，硫酸镁0.5克/升至2.0克/升，磷酸二氢钾1.0克/升至3.0克/升。
[0021]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其步骤(b)中种子培养罐内的种子扩大培养基组分:葡萄糖30.0克/升至60.0克/升，酵母粉5.0克/升至10.0克/升，大豆饼粉O至3.0克/升，硝酸钠1.0克/升至2.0克/升，硫酸镁0.5克/升至2.0克/升，磷酸二氢钾1.0克/升至3.0克/升。
[0022]优选地，所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其步骤(a)中种子液的培养周期为20-24小时，步骤(b)中，种子扩大培养的培养周期为20-24小时。
[0023]按照本发明的另一方面，提供了一种应用，甘油应用于诱导裂殖壶菌增加二十二碳六烯酸合成量。
[0024]总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果:
[0025](I)本发明所提供的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，通过综合优化裂殖壶菌培养条件，能提高裂殖壶菌的生物量，从而提高DHA产量。[0026](2)本发明可应用于10吨以上大规模发酵罐发酵，在大规模量产的情况下，仍能维持裂殖壶菌高生物产量。
[0027](3)本发明通过甘油诱导裂殖壶菌增加二十二碳六烯酸的合成量，大规模发酵期间，添加甘油并维持在合适浓度，从而诱导裂殖壶菌增加合成二十二碳六烯酸，在生物量一定的情况下，进一步提高了二十二碳六烯酸的含量，从而提高二十二碳六烯酸的产量，使DHA油脂广品品质大大提闻。
[0028](4)本发明提供的方法，通过优化工艺参数和选择菌种，与现有技术相比大幅降低了发酵时的通气量，仅为现有技术通气量的十分之一左右，从而降低了用于通气的能量成本和经济成本，环境友好且生产成本大幅降低。
[0029](5)本发明通过综合后期低温发酵、降低通气量和流加补料的等发酵条件，进一步提闻了 碳TK稀酸的广量，使DHA油脂广品品质大大提闻
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是本发明提供的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法流程图。
【具体实施方式】
[0031]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0032]本发明提供的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤:
[0033](I)将裂殖壶菌活化培养成裂殖壶菌种子液；所述裂殖壶菌优选为裂殖壶菌(Schizochytrium sp) S056，于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为 CCTCC M2013459。
[0034](2 )将裂殖壶菌种子液按照体积百分比2%至4%接入发酵罐进行培养，培养温度25摄氏度至28摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，同时分三次流加补料，所述补料包括碳源、氮源以及甘油，碳源优选为葡萄糖和/或麦芽糖，更优选为葡萄糖；氮源优选为酵母粉和/或谷氨酸钠，更优选为酵母粉，维持甘油浓度O至10克/升的范围内。每次流加补料，当发酵液中碳源浓度下降至20.0克/升至30.0克/升范围内时开始流加，当发酵液中碳源浓度在30.0克/升至40.0克/升之间，氮源浓度在2.0克/升至4.0克/升之间，且甘油浓度在5.0克/升至10.0克/升时停止流加。
[0035](3)进入发酵稳定期后，即溶氧度不再下降后，控制发酵温度在18摄氏度至23摄氏度之间，控制通气量在10立方/小时至100立方/小时之间，保持恒定转速搅拌。
[0036](4)当发酵液中碳源浓度低于5.0克/升时结束发酵，收集湿菌体从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
[0037]所述步骤(1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液，包括以下子步骤:
[0038](a)种子培养:
[0039]向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为1%至5%，在摇床转速150转/分钟至220转/分钟、培养温度22.0摄氏度至28.0摄氏度的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液。所述种子培养基优选组分:葡萄糖30.0克/升至60.0克/升，酵母粉5.0克/升至10.0克/升，蛋白胨1.0克/升至5.0克/升，硫酸镁0.5克/升至2.0克/升，磷酸二氢钾1.0克/升至3.0克/升。
[0040](b)种子扩大培养:
[0041]将步骤(a)得到的摇瓶种子液接入种子培养罐中的种子扩大培养基进行扩大培养，接种量体积百分比为1%至5%，搅拌转速150转/分钟至300转/分钟，通气量0.2立方/小时至15.0立方/小时，培养温度22.0摄氏度至28.0摄氏度的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。所述种子培养罐内的种子扩大培养基优选组分:葡萄糖30.0克/升至60.0克/升，酵母粉5.0克/升至10.0克/升，大豆饼粉O至3.0克/升，硝酸钠1.0克/升至2.0克/升，硫酸镁0.5克/升至2.0克/升，磷酸二氢钾1.0克/升至3.0克/升。
[0042]以下为实施例:
[0043]实施例1
[0044]一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤:
[0045](I)将裂殖壶菌(Schizochytrium sp) S056,活化培养成裂殖壶菌种子液。
[0046](2)将裂殖壶菌种子液按照体积比2%接入发酵罐进行培养，培养温度28摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，通气量10立方/小时至50立方/小时，同时流加补料，所述补料包括碳源、氮源以及甘油，维持甘油浓度在O至10克/升。所述碳源为葡萄糖，所述氮源为酵母粉。流加补料，分三次流加，每次流加，当发酵液中碳源浓度下降至20.0克/升至30.0克/升范围内时开始流加，当发酵液中碳源浓度在30.0克/升至40.0克/升，氮源浓度在
2.0克/升至4.0克/升之间，且甘油浓度在5.0克/升至10.0克/升时停止流加。
[0047](3)进入发酵稳定期后，即溶氧度不再下降后，控制发酵温度在23摄氏度，控制通气量在10立方/小时至30立方/小时之间，保持恒定转速搅拌。
[0048](4)当发酵液中葡萄糖浓度为0.0克/升时结束发酵，收集湿菌体从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
[0049]所述步骤(1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液，包括以下子步骤:
[0050](a)种子培养:
[0051]向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为1%，在摇床转速220转/分钟、培养温度22摄氏度的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液。所述种子培养基优选组分:葡萄糖30克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨3克/升，硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾2克/升。
[0052](b)种子扩大培养:
[0053]将步骤(a)得到的摇瓶种子液接入种子培养罐中的种子扩大培养基进行扩大培养，接种量体积百分比为1%，搅拌转速300转/分钟，通气量0.2立方/小时至0.5立方/小时，培养温度28摄氏度的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。所述种子培养罐内的种子扩大培养基优选组分:葡萄糖30克/升，酵母粉8克/升，大豆饼粉O克/升，硝酸钠1.6克/升，硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾2克/升。
[0054]发酵结果，即发酵生物量、DHA含量及DHA产量见表1。[0055]实施例2
[0056]一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤:
[0057](I)将裂殖壶菌活化培养成裂殖壶菌种子液。所述裂殖壶菌，按照以下方法获取:取一定量的水样，将其涂布于高盐的YPD固体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L,琼脂20.0g/L,海水晶10.0 g/L)上，25.0摄氏度培养48小时，获得大量单菌落，挑取单菌落于液体培养基中，在摇床转速180转/分钟、培养温度25.0摄氏度的条件下进行摇瓶培养72小时后，分别对菌体进行染色，显微镜观察，筛选得到产油量高的菌株，利用气相色谱仪对以上菌株油脂的脂肪酸组分进行分析，选取脂肪酸组分中含有DHA且含量较高的一株，进一步通过菌落形态及显微结构观察，以及18s rDNA的分子进化分析，鉴定该囷株为裂殖亚囷。
[0058](2)将裂殖壶菌种子液按照体积比4%接入发酵罐进行培养，培养温度25摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，通气量120立方/小时至150立方/小时，同时流加补料，所述补料包括碳源、氮源以及甘油，维持甘油浓度在O至10克/升的范围内。所述碳源为麦芽糖，所述氮源为谷氨酸钠。流加补料，分三次流加，当发酵液中碳源浓度下降至20.0克/升至30.0克/升范围内时开始流加补料，当发酵液中碳源浓度在30.0克/升至40.0克/升之间，氮源浓度在2.0克/升至4.0克/升之间，且甘油浓度在5.0克/升至10.0克/升时停止流加补料。
[0059](3)进入发酵稳定期后，即溶氧度不再下降后，控制发酵温度在19摄氏度，控制通气量在80立方/小时至100立方/小时之间，保持恒定转速搅拌。
[0060](4)当发酵液中碳源浓度低于5.0克/升时结束发酵，收集湿菌体从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂 。
[0061]所述步骤(1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液，包括以下子步骤:
[0062](a)种子培养:
[0063]向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为3%，在摇床转速180转/分钟、培养温度26摄氏度的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液。所述种子培养基优选组分:葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨I克/升，硫酸镁1.2克/升，磷酸二氢钾I克/升。
[0064](b)种子扩大培养:
[0065]将步骤(a)得到的摇瓶种子液接入种子培养罐中的种子扩大培养基进行扩大培养，接种量体积百分比为5%，搅拌转速220转/分钟，通气量12立方/小时至15立方/小时，培养温度22摄氏度的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。所述种子培养罐内的种子扩大培养基优选组分:葡萄糖60.0克/升，酵母粉10克/升，大豆饼粉2克/升，硝酸钠I克/升，硫酸镁I克/升，磷酸二氢钾I克/升。
[0066]发酵结果，即发酵生物量、DHA含量及DHA产量见表1。
[0067]实施例3
[0068]一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤:
[0069](I)将裂殖壶菌活化培养成裂殖壶菌种子液。所述裂殖壶菌，按照以下方法获取:
[0070]将实施例2中采集的裂殖壶菌经多次紫外线-亚硝基胍复合诱变，诱变方法为，利用0.5mL PBS缓冲液(100mM,pH7.0)制成裂殖壶菌菌悬液,再加入0.5mL2.5mg/mL亚硝基胍溶液，30摄氏度处理I小时；无菌条件下离心上述处理液，用蒸馏水洗涤菌体使其菌液OD65tl达到0.4至0.6后，倒入培养皿，使该菌液成为厚度Imm至5mm的薄层液体，再于25W紫外灯下，40mm距离处照射30秒，在无菌条件下离心经上述紫外处理的菌体，并将其重新悬浮与ImL液体YPD培养基中，涂布于固体YPD平板，于25°C条件下黑暗培养48小时至长出单菌落，诱变后长出的单菌落大小不等，筛选其中细胞直径较大的裂殖壶菌菌株，以此作为高产菌株形态特征进行快速筛选，分别接入含1.5mL液体YPD培养基的96孔高通量筛选设备中，在摇床转速200转/分钟的条件下震荡培养72小时，离心获得生物量较高的菌株。
[0071](2)将裂殖壶菌种子液按照体积比3%接入发酵罐进行培养，培养温度26摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，通气量60立方/小时至80立方/小时，同时流加补料，所述补料包括碳源、氮源以及甘油，维持甘油浓度在O至10克/升的范围内。所述碳源为葡萄糖和麦芽糖质量比1:1的混合物，所述氮源为酵母粉和谷氨酸钠质量比1:1的混合物。流加补料，分三次流加，每次流加，当发酵液中碳源浓度下降至20.0克/升至30.0克/升范围内时开始流加，当发酵液中碳源浓度在30.0克/升至40.0克/升之间，氮源浓度在2.0克/升至4.0克/升之间，且甘油浓度在5.0克/升至10.0克/升时停止流加。
[0072](3)进入发酵稳定期后，即溶氧度不再下降后，控制发酵温度在18摄氏度，控制通气量在50立方/小时至70立方/小时之间，保持恒定转速搅拌。
[0073](4)当发酵液中碳源浓度低于3.0克/升时结束发酵，收集湿菌体从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
[0074]所述步骤(1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液，包括以下子步骤:
[0075](a)种子培养:
[0076]向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为5%，在摇床转速150转/分钟、培养温度28摄氏度的 条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液。所述种子培养基优选组分:葡萄糖60克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨5克/升，硫酸镁2克/升，磷酸二氢钾3克/升。
[0077](b)种子扩大培养:
[0078]将步骤(a)得到的摇瓶种子液接入种子培养罐中的种子扩大培养基进行扩大培养，接种量体积百分比为3%，搅拌转速150转/分钟，通气量8立方/小时至10立方/小时，培养温度26摄氏度的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。所述种子培养罐内的种子扩大培养基优选组分:葡萄糖50.0克/升，酵母粉5克/升，大豆饼粉3克/升，硝酸钠2克/升，硫酸镁2克/升，磷酸二氢钾3克/升。
[0079]发酵结果，即发酵生物量、DHA含量及DHA产量见表1。
[0080]实施例4
[0081]对于实施例1、实施例2、实施例3，分别进行了空白对照试验；使用相同的裂殖壶菌，按照相同的发酵方法，仅补料为相应碳源、氮源，而不包括甘油为对照，实施例1、实施例
2、实施例3的空白对照发酵结果见表1。对照结果显示，对与三种裂殖壶菌，在添加甘油后，生物量、DHA含量、DHA产量等见表1，显示甘油能诱导裂殖壶菌增加二十二碳六烯酸的合成。
[0082]表1发酵结果[0083]
【权利要求】
1.一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液； (2)将裂殖壶菌种子液按照体积百分比2%至4%接入发酵罐进行培养，培养温度25摄氏度至28摄氏度，通气并保持恒定转速搅拌，同时流加补料，所述补料包括碳源、氮源以及甘油，维持甘油浓度在O至10.0克/升的范围内； (3)进入发酵稳定期后，即溶氧度不再下降后，控制发酵温度在18摄氏度至23摄氏度之间，通气并保持恒定转速搅拌； (4)当发酵液中碳源浓度低于5.0克/升时结束发酵，收集湿菌体从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
2.如权利要求1所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中流加补料是根据发酵液中碳源浓度水平分批次流加，所述碳源为葡萄糖和/或麦芽糖，所述氮源为酵母粉和/或谷氨酸钠。
3.如权利要求2所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)分三次流加补料，每次流加补料，当发酵液中碳源浓度下降至20.0克/升至30.0克/升范围内时开始流加，当发酵液中碳源浓度在30.0克/升至40.0克/升之间，氮源浓度在2.0克/升至4.0克/升之间，且甘油浓度在5.0克/升至10.0克/升时停止流加。
4.如权利要求1所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp) S056,于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2013459。
5.如权利要求4所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，步骤`(2)控制通气量在10立方/小时至50立方/小时之间，步骤(3)控制通气量在10立方/小时至30立方/小时之间。
6.如权利要求1所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)将裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液，包括以下子步骤: (a)种子培养: 向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为1%至5%，在摇床转速150转/分钟至220转/分钟、培养温度22摄氏度至28摄氏度的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液； (b)种子扩大培养: 将步骤(a)得到的摇瓶种子液接入种子培养罐中的种子扩大培养基进行扩大培养，接种量体积百分比为1%至5%，搅拌转速150转/分钟至300转/分钟，通气量0.2立方/小时至15立方/小时，培养温度22摄氏度至28摄氏度的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。
7.如权利要求6所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的种子培养基组分:葡萄糖30.0克/升至60.0克/升，酵母粉5.0克/升至10.0克/升，蛋白胨1.0克/升至5.0克/升，硫酸镁0.5克/升至2.0克/升，磷酸二氢钾1.0克/升至3.0克/升。
8.如权利要求6所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，步骤(b)中种子培养罐内的种子扩大培养基组分:葡萄糖30.0克/升至60.0克/升，酵母粉5.0克/升至10.0克/升，大豆饼粉O至3.0克/升，硝酸钠1.0克/升至2.0克/升，硫酸镁，0.5克/升至2.0克/升，磷酸二氢钾1.0克/升至3.0克/升。
9.如权利要求6所述的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，步骤Ca)中种子液的培养周期为20-24小时，步骤(b)中，种子扩大培养的培养周期为20-24小时。
10 .甘油应用于诱导裂殖壶菌增加二十二碳六烯酸合成量。
【文档编号】C12P7/64GK103882072SQ201410097063
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】余龙江, 朱圆敏, 陈伟, 周蓬蓬, 金文闻, 余金龙, 钱凯 申请人:武汉华士特工业生物技术开发有限公司, 华中科技大学, 湖北欣和生物科技有限公司