超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法
【专利摘要】本发明公开了超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法，其特征在于在细丽毛壳菌在培养基中培养时，采用频率20-40KHZ，功率80-120W的超声作用，频率为40-80分钟/次，每次作用时间40-80秒。出乎本领域技术人员的合理预期，本发明通过在低频低功率超声条件下，采用细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法，提高了细胞的生长速率，同时葡聚糖酶的酶活提高了215%。
【专利说明】超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物和生物学【技术领域】，具体而言，涉及在超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法。
【背景技术】
[0002]葡聚糖(dextran)又称右旋糖酐，为一种多糖，存在于某些微生物在生长过程中分泌的粘液中。葡聚糖具有较高的分子量，主要由D—葡萄吡喃糖以α，1 —6键连接，支链点有I — 2、I — 3、I — 4连接的。随着微生物种类和生长条件的不同，葡聚糖结构也有差别。精糖生产过程中，甘蔗夹带的肠膜明串珠菌等微生物会分泌蔗糖转化酶来消耗蔗糖，生成大量葡聚糖，俗称“蔗饭”。葡聚糖的积累除造成糖分的损失外，还导致糖液粘度增大、旋光度偏高、结晶及过滤困难等一系列问题，给糖厂的大规模生产及糖品质量提高带来诸多不利影响。
[0003]目前国内很多学者采取多种措施来减少或者消除糖液中的葡聚糖，主要分为物理法、化学法以及生物法等。物理法使用澄清、膜过滤等方法，其技术成本较高，难以广泛推广。化学法主要加入漂白粉等杀菌剂以及青霉素、金霉素等抗生素来抑制微生物的生长。相对而言，化学法价格低廉，不需要额外设备，但化学药品的残留可能会对人体造成危害，而且对已形成的葡聚糖起不到降解的作用。生物法主要是使用酶解法，采用葡聚糖酶对糖汁中所含的葡聚糖进行降解，能够快速高效的清除糖汁中的葡聚糖，达到提高原糖产率、降低糖液粘度等目的 。然而，当前食品用的安全级别来源的葡聚糖酶较为稀缺，极大的限制了生物法在制糖工业中的广泛应用。因此，开发一种安全来源的葡聚糖酶，成为目前制糖工业所面临的一项主要问题之一。
[0004]细丽毛壳菌是美国及欧盟认可的一种食品安全性菌株，在其发酵过程中能够分泌α-葡聚糖酶。目前国内对于利用细丽毛壳菌发酵产α-葡聚糖酶的研究较少，主要研究集中于利用细丽毛壳菌制备α-葡聚糖酶粗酶的方法与步骤，葡聚糖酶产量较低，难以达到工业化应用水平。
[0005]因此，如何提高细丽毛壳菌发酵制备α -葡聚糖酶的产量和活性，达到工业化应用水平是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，提供一种在超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法，提高α-葡聚糖酶的产量和活性。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0007]本发明一方面涉及超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α -葡聚糖酶的方法，其特征在于在细丽毛壳菌在培养基中培养时，采用频率20-40ΚΗΖ (优选25-35ΚΗΖ)，功率80-120W(优选为90-110W)的超声作用，频率为40-80分钟/次(优选为50-70分钟/次)，每次作用时间40-80秒(优选为50-70秒)。[0008]在本发明的一个优选实施方式中,所述的发酵培养基成分及培养条件:1.5%葡聚糖，1.0%酵母浸膏，0.5%磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，0.1%硫酸镁；用lmol/L氢氧化钠溶液调节培养基PH至6.0，灭菌，在培养基中加入一定量灭菌碳酸钙，以2%的接种量将细丽毛壳菌接入到培养基中，于转速为200rpm的摇床中30°C恒温培养3_4天。
[0009]在本发明的一个优选实施方式中，超声处理之后继续将培养体系放入摇床培养。
[0010]在本发明的一个优选实施方式中，在细丽毛壳菌培养12h之后启动超声。
[0011]出乎本领域技术人员的合理预期，本发明通过在低频低功率超声条件下，采用细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法，提高了细胞的生长速率，同时葡聚糖酶的酶活提高了 215%。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1超声处理对菌体干重的影响；
[0013]图2超声处理对菌体自絮凝现象的影响；
[0014]图3超声条件处理对细丽毛壳菌发酵生产α -葡聚糖酶酶活的影响；
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。
[0016]—、发酵培养基成分及培养条件:1.5%葡聚糖，1.0%酵母浸膏，0.5%磷酸氢二钾(磷酸二氢钾)，0.1%硫酸镁。用lmol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH至6.0，灭菌，在培养基中加入一定量碳酸钙(灭菌)，以2%的接种量将细丽毛壳接入到25mL培养基中，于转速为200rpm的摇床中30°C恒温培养3_4天。
[0017]超声处理条件:发酵12h后开始超声处理，频率30KHZ，功率100W，超声作用频率为I小时/次，每次作用时间lmin。然后放入摇床培养，培养条件同上。
[0018]二、α-葡聚糖酶酶活的测定
[0019]实验仪器:分光光度计、恒温水浴锅、电磁炉、移液枪、25cm比色管
[0020]实验材料:DNS试剂、α -葡聚糖酶、2.0%葡聚糖底物
[0021]葡聚糖酶活测定:取900 μ L质量分数为2.0%的葡聚糖溶液，置于50°C恒温水浴中保温5min，随即加入100 μ L酶液，准确反应lOmin，立即加入2mL的DNS以终止反应，于沸水浴5min,迅速将其冷却,用蒸懼水定容至25mL,于波长540nm处测定吸光值。从葡萄糖标准曲线的回归方程求得相对应的葡萄糖的量，并折算出酶活。酶活定义为:在上述条件下，每分钟从葡聚糖底物中释放出I μ mol还原糖所需的酶量为I个酶活单位，以U/mL表示。
[0022]1.超声处理对细丽毛壳菌菌体生长情况的影响:
[0023]本发明考察了超声处理对细丽毛壳菌菌体生长情况的影响，结果证实，低频超声处理能够明显提高菌体干重(图1)。
[0024]2.超声处理对细丽毛壳菌自絮凝现象的影响:
[0025]本发明考察了低频超声处理对细丽毛壳菌自絮凝现象的影响(图2)，证实低频超声处理能够有效降低菌体自絮 凝现象。
[0026]3.超声处理对α -葡聚糖酶酶活的影响:
[0027]实验比对了超声条件与普通摇床培养时，细丽毛壳菌发酵生产α-葡聚糖酶活性变化(图3)。
[0028]研究结果证实，在细丽毛壳菌发酵过程中，使用低频超声技术处理发酵液，能够显著提高菌体分散性，降低自絮凝现象的发生。同时，发酵液酶活性较普通摇床培养提高215%。以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1.超声条件下细丽毛壳菌发酵制备α-葡聚糖酶的方法，其特征在于在细丽毛壳菌在培养基中培养时，采用频率20-40ΚΗΖ (优选25-35ΚΗΖ)，功率80-120W (优选为90-110W)的超声作用，频率为40-80分钟/次(优选为50-70分钟/次)，每次作用时间40-80秒(优选为 50-70 秒)。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的发酵培养基成分及培养条件:1.5%葡聚糖，1.0%酵母浸膏，0.5%磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，0.1%硫酸镁；用lmol/L氢氧化钠溶液调节培养基PH至6.0，灭菌，在培养基中加入一定量灭菌碳酸钙，以2%的接种量将细丽毛壳菌接入到培养基中，于转速为200rpm的摇床中30°C恒温培养3_4天。
3.根据权利要求2`所述的方法，超声处理之后继续将培养体系放入摇床培养。
【文档编号】C12N9/46GK103865906SQ201410097002
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】刘继栋, 李凯, 杭方学, 陆海勤, 谢彩锋, 梁欣泉, 陆登俊, 张泽栋 申请人:广西大学