一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
【专利摘要】本发明提供了一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法和一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒及其构建方法和应用。本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒包括胱氨酸转运系统底物结合蛋白基因fliY序列和一段合适的载体片段；这种方法的原理在于：通过在合适时间添加诱导剂使fliY表达而提高半胱氨酸利用率；最终发酵产物中谷胱甘肽的合成量显著高于原始菌株，提高了原料利用率，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法及思路可以用于其他因原料利用率低限制产量提高的目的产物，为生产有价值的产品提供了新的思路。
【专利说明】一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体地说，是关于一株提高半胱氨酸利用率的菌株高产谷胱甘肽的方法。
【背景技术】
[0002]谷胱甘肽(Y-L-glutamyl-cysteinyl-glycine, GSH)是细胞内重要的抗氧化剂和主要的非蛋白巯基化合物。在大部分动物、植物和微生物的细胞与组织中，谷胱甘肽以氧化型和还原型两种形式存在，两者通过谷胱甘肽还原酶保持动态平衡从而使还原型谷胱甘肽发挥有效的生化反应。例如:谷胱甘肽通过还原，共轭或与其他非酶抗氧化剂协同以发挥抗氧化作用，清除内生或外源的氧化物质和亲电子体，维持内环境氧化还原稳态并起到细胞保护作用；作为辅酶参与氨基酸转运与代谢(如Y-谷氨酰基循环)，保持抗坏血酸复位状态并形成脱氧核糖核酸类物质和一些小分子化合物(如半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸)；此外，谷胱甘肽间接调控DNA的合成，从而调节细胞乃至组织的生长和死亡，进而对抗或诱发肿瘤，免疫缺陷，心血管疾病，肝肾疾病或神经性疾病。鉴于此，谷胱甘肽大量应用于医药保健，护肤美容，食品添加等行业。
[0003]目前GSH的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法和生物酶催化法和生物发酵法。相比之下，生物发酵法具有反应条件温和、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优势，是今后生产谷胱甘肽的主要趋势，但目前大部分研究还停留在实验室阶段，实现商业化生产的国家主要是日本。
[0004]近年来基于发酵法对GSH产量提高的方法渐渐由传统的育种策略，培养条件优化和控制转向对代谢的调控和分子机制的研究，一些数理知识的引入在发酵条件优化，发酵过程控制及动力学模型的建立上起着重要作用，近来分子生物学的发展也为研究者从分子水平探究、提高GSH产量提供了新思路。L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前体氨基酸之一，细胞内L-半胱氨酸的供应不足严重影响了谷胱甘肽的合成速度及产量。因此可以采用分子生物学方法使L-半胱氨酸大量进入细胞，最终使细胞内谷胱甘肽的合成量增加。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒，以用于构建表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的菌株。
[0006]本发明还有一个目的在于，提供一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒的构建方法。
[0007]本发明还有一个目 的在于，提供一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒的应用。
[0008]本发明还有一个目的在于，提供一种过表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白生物合成谷胱甘肽的方法。
[0009]本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒包括胱氨酸转运系统底物结合蛋白基因fliY序列和一个合适的载体片段；所述序列fliY如NCBI上Gene ID为948833的序列所不。
[0010]根据本发明的一个优选实施例，在胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒中，fliY连接在一个合适的载体上，通过合适的诱导剂诱导，从而使fliY过量表达，进而使合成谷胱甘肽的前体氨基酸之一半胱氨酸可以大量的进入细胞，最终使细胞内谷胱甘肽的合成量增加。
[0011]根据本发明的另一个优选实施例，所述胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒包括一个卡那霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。
[0012]本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法包括以下步骤:
[0013]A)PCR扩增获得fliY序列；
[0014]B)将 fliY 序列克隆入 pET28a。
[0015]本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒可用于构建表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的菌株。
[0016]本发明提供的方法可用于合成谷胱甘肽。
[0017]本发明提供的合成谷胱甘肽的方法通过发酵培养本发明提供的胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组菌株，合成谷胱甘肽。
[0018]使用本发明提供的质粒可以构建合成谷胱甘肽大肠杆菌，可以明显地提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生产量，降低了成本和能耗，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法构建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率低限制产量提高的目的产物，为生`产有价值的产品提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是PCR扩增获得的fliY的凝胶电泳检测结果，其中泳道I为fliY。
[0020]图2是BL21_f IiY质粒双酶切的凝胶检测结果，其中泳道I中5350bp左右的条带为质粒
[0021]pET-28a(+)的DNA片段，800bp左右的条带为基因fliY的DNA片段。
[0022]图3是质粒pET28a_fliY的结构示意图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0024]以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆:实验室手册》(New York:CoLd Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。
[0025]在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自生工生物公司。
[0026]在本发明的下述实施例中，使用的pMD-19TSimpLe Vector,Hind III,EcoR I,TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，DNA Marker,均购自TAKARA公司。
[0027]在本发明的下述实施例中，使用的表达载体pET28a、菌种E.coli BL21(DE3)、菌种E.coli K12、E.coli DH5 α，为中国药科大学生命中心实验室保存，其中菌种E.coliBL21 (DE3)的 ATCC 编号为 BAA-1025?。
[0028]在本发明的下述实施例中，使用的E.coli BL21(DE3)感受态细胞、E.coli DH5 α感受态细胞，购自天根生化科技有限公司。
[0029]在本发明的下述实施例中，使用的LB培养基的配方为:1%胰蛋白栋，0.5%酵母浸粉，1% NaCl ;使用的摇瓶发酵培养基的配方为:1%胰蛋白栋，0.5%酵母浸粉，i%NaCl。配置固体LB平板培养基时，按照上述配方添加2%琼脂粉。
[0030]在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照《分子克隆:实验室手册》提供的方法进行。
[0031]实施例1表汰质粒的构律
[0032]1.1引物设计
[0033]根据NCBI报道的fliY序列，设计以下2条引物:
[0034]fIiYUP:GAGGAATTCATGAAATTAGCACATCTGGGA ；
[0035]fIiYDOffN:GCCAAGCTTTTATTTGGTCACATCAGCAC。
[0036]其中fliYUP和fliYDOWN用于扩增fliY编码区；fliYUP、fIiYDOWN上的下划线表示在fliYUP、fIiYDOWN上分别引入的EcoR1、Hind III酶切位点。
[0037]1.2PCR 扩 增 fliY 序列
[0038]抽提得到大肠杆菌E.coli K12基因组。
[0039]以大肠杆菌E.coli K12基因组为模板，分别以步骤1.1中设计的fliYUP和fliYDOffN为引物对，进行PCR扩增，具体如下:
[0040]扩增fliY 的反应体系均为:10XPCR Buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMgS042 y L，上下游引物(10 μ M)各 lyL’E.coli BL21(DE3)基因组 DNAl μ L，Taq DNA 聚合酶I μ L，加入去离子水，至体系总体积为50 μ L。
[0041]扩增fliY 的反应条件:95°C 4min ；95 °C 30s，56°C 40s, 72 °C lmin，34 个循环；72°C IOmin。
[0042]PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。根据图1的结果，获得的产物的大小为801bp，符合fliY产物的预期大小。
[0043]1.3表达载体的构建
[0044]1.3.1构建预处理
[0045]使用胶回收试剂盒纯化步骤1.2中获得的PCR产物，然后和pMD-19T SimpLe载体，用T4DNA连接酶，于16°C连接过夜，反应体系如下:
[0046]4 μ L 的 PCR 产物，I μ LpMD-19Τ SimpLe 载体，5 μ L T4DNA 连接酶。
[0047]连接产物转化大肠杆菌DH5 α并涂布含有50 μ g/mL氨苄青霉素的固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E.coli DH5a是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有氨苄青霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了 pMD-fIiY质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得质粒pMD-fliY。
[0048]质粒pMD-fIiY经测序验证，包含fliY编码区(fliY编码区序列分别如SQ ID N0.1所示)，而且编码区无氨基酸残基突变。
[0049]1.3.2表达载体的构建[0050]将1.3.1中双酶切产物fliY凝胶回收纯化，分别与EcoR I/Hind III双酶切的表达载体pET28a连接，将连接产物分别转化入宿主菌E.coli DH5 α，并涂布含有100 μ g/mL卡那霉素固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E.coli DH5 α是无卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了 pET28a-fliY质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得质粒pET28a-fliY0
[0051]质粒pET28a_fliY的双酶切鉴定:提取阳性克隆的质粒pET28a_fliY，并用EcoRI/Hind III 进行双酶切，酶切体系为:EcoR Il μ L, Hind IIIl μ L，质粒 pET28a_fliY8 μ L，IOXK Buffer2yL，补水至20yL。37°C酶切4小时，将酶切产物凝胶电泳，结果如图2。根据图2的结果，获得的产物的大小分别为800bp和5350bp的DNA片段，符合fliY产物的预
期大小。
[0052]质粒pET28a_fliY经测序,并对测序结果进行分析获得pET28a_fliY质粒的结构示意图，结果如图3所示。该质粒中包含fliY编码区(fliY编码区序列SQ ID N0.1所示)，其中fliY编码区置于T7启动子、Lac操纵子之下，而且编码区无氨基酸残基突变。
[0053]实施例2表达质粒转化合成谷胱甘肽细菌株
[0054]将1.3.2中得到的带有质粒pET28a_fliY的大肠杆菌，抽提质粒并转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)，并涂布含有60μg/mL卡那霉素的固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E.coli BL21 (DE3)是无卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了 pET28a-f IiY质粒的大肠杆菌。
[0055]分别随机挑取若干含pET28a_fliY质粒的转化子，摇瓶发酵培养，并选取一株谷胱甘肽合成量较高的大肠杆菌菌株，命名为BL21-fliY。
[0056]抽提BL21-f I iY的质粒DNA，分别以引物f I iYUP和f I iYDOffN对上述抽提物进行PCR扩增，获得了长度为0.Skb的片段。经测序验证，fliY的表达框已插入质粒pET28a-fliY0
[0057]根据上述结果，质粒pET28a_fliY已成功转化入宿主菌E.coli BL21 (DE3)，命名为 BL21-fliY0
[0058]实施例3BL21_fliY和E.coli BL21 (DE3)摇瓶发酵谷胱甘肽
[0059]将于37°C固体LB平板上生长过夜的BL21-fliY和E.coli BL21(DE3)(原始菌，命名为BL21)的单菌落，分别接入液体LB培养基中，摇瓶培养过夜。
[0060]分别取适量菌液转接入摇瓶发酵培养基，培养llh。其中，在适当时间加入诱导剂；适时添加合适浓度的半胱氨酸并于发酵的Ilh取样，检测发酵产物中谷胱甘肽的合成量，结果表明本发明构建的BL21-fliY工程菌产谷胱甘肽达522.7mg/L发酵液，远远高于对照组E.coli BL21 (DE3)产谷胱甘肽193.7mg/L发酵液。
[0061]综上所述，使用本发明提供的质粒可以转化累积谷胱甘肽的原始细菌株，获得的重组菌发酵培养，发酵产物中谷胱甘肽合成量显著高于合成谷胱甘肽的原始细菌株
E.coliBL21 (DE3)。这说明采用本发明提供的生物合成方法，可以明显的提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生产量，降低了成本和能耗，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法构建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率不高限制产量提高的目的产物，为生产有价值的产品提供了新的思路。[0062]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，`均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种胱氨酸转运系统底物结合蛋白重组质粒，其特征在于，重组质粒由胱氨酸转运系统底物结合蛋白基因fliY序列和一段合适的载体片段连接而成，所述fliY序列如NCBI上Gene ID为948833的序列所示，载体片段为pET28a。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述fliY序列分别置于T7启动子、Lac操纵子之下。
3.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述fliY序列为来源于E.coli K12的fliY基因。
4.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包括一段抗性基因片段一卡那霉素抗性基因。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: A)PCR扩增获得fliY序列； B)将fliY序列克隆到合适的表达载体。
6.如权利要求1-4中任一项所述的重组质粒用于转化合成谷胱甘肽的原始细菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的应用。
7.一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1-4中任一项所述的重组质粒转化合成谷胱甘肽原始细菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。·
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过发酵培养所述重组菌，并在发酵培养一定时间后，用诱导剂乳糖诱导胱氨酸转运系统底物结合蛋白基因fliY的表达，提高半胱氨酸利用率，进一步提高谷胱甘肽的合成量。
【文档编号】C12N1/21GK103849639SQ201410116362
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】许激扬, 卞筱泓, 刘荣, 赵玉成, 沃龙飞, 张雪霞 申请人:中国药科大学