一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法及其产品的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：i)在宿主菌细胞内转入编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；ii)在宿主菌细胞内转入编码γ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；iii)敲除宿主菌细胞的γ-谷氨酰转肽酶基因；iv)敲除宿主菌细胞的肌醇-3-磷酸合酶基因；所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基因工程菌；本发明还涉及所制得的基因工程菌；本发明提供的用于合成谷胱甘肽的基因工程菌不仅高效合成谷胱甘肽，也可以大大提高外源半胱氨酸的转化效率，可用于生产谷胱甘肽。
【专利说明】一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法及其产品
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制 备方法及其产品。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽（Glutathione, GSH)，即γ -L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是一 种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的，广泛存在于生物体内的生物活性三肽化 合物（Meister A, Anderson ME. Glutathione.Annu Rev Biochem, 1983,52:711 - 760)。 在所有生物中，谷胱甘肽以两种存在形式，即还原型谷胱甘肽（GSH)和氧化型谷胱甘 肽（GSSG)，其中在机体内起主要作用的还原型谷胱甘肽占多数（Akerboom TP，Bilizer MM，Sies H. The relationship of biliary GSSG efflux and intracellular GSSG content in perfused rat liver. J Biol Chem，1982,257:4248 - 4252)。谷胱甘肤 在体内具有抗氧化、清除自由基、抑制HIV等功能（Carmel H0，Storz G. Roles of the glutathione and thioredoxin-dependent reduction systems in the Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stress. Annu Rev Microbiol，2000, 54:439 - 461 ;Jahoor F，Jackson A, Gazzard B，et al. Erythrocyte glutathione deficiency in symptom-free HIV infection is associated with decreased synthesis rate. J Am J Physio, 1999, 276(1) :E205_E211)。目前，已被广泛的 应用于医药、化妆品、食品加工等领域。
[0003] 谷胱甘肽作为重要的生物活性物质，目前文献报道在生物体内主要有3条生物合 成途径：
[0004] I.标准途径
[0005] 在大多数真核细胞和革兰氏阴性细菌中，谷胱甘肽的生物合成主要通过两步 依赖于 ATP 的酶催化反应（Meister A. Glutathione metabolism and its selective modification. J Biol Chem, 1988, 263:17205 - 17208)：
[0006] (1)L-谷氨酸和L-半胱氨酸在Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶 (gamma-glutamylcysteine synthetase, γ-GCS, or GSH I)的作用下合成 γ-谷氨酰半胱 氨酸；
[0007] (2) γ -谷氨酰半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase, GS, or GSH II)的作用下，与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。两步反应如下：
[0008] L-Glutamate+L-cysteine+ATP - L- γ -Glutamyl-L-cysteine+ADP+Pi (反应 1)
[0009] L- γ -Glutamyl-L-cysteine+glycine+ATP - GSH+ADP+Pi (反应 2)
[0010] 在谷胱甘肽的合成过程中，Y-GCS受到终产物GSH的反馈抑制，以避免过度 积累，且Y-GC的形成为该途径的限速步骤（Murata K，Kimura A. Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cells. Biotechnol Adv, 1990, 8:59 - 96)〇
[0011] II.双功能酶途径
[0012] 在一些致病性的革兰氏阳性细菌中，如无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)、李斯特菌（Listeria Monocytogenes)、巴斯德氏菌（Pasteurella multocida)存在一种谷胱甘肽合成酶一 γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶 (Y -GCS-GS，Gshf)，该酶为一个双功能酶，同时具有γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘 肽合成酶的催化活性，可以单独催化谷胱甘肽的生成（Gopal S，Borovok l，0fer A，et al.A multidomain fusion protein in Listeria monocytogenes catalyzes the two primary activities for glutathione biosynthesis. J Bacteriol, 2005, 187:3839 - 3847 ； Janowiak BE, Griffith Off. Glutathione synthesis in Streptococcus agalactiae. One protein accounts for gamma-glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase activities. J Biol Chem, 2005, 280:11829 - 11839 ；Vergauwen B, De Vos D, Van Beeumen JJ. Characterization of the bifunctional gamma-glutamate-cysteine ligase/glutathione synthetase (GshF)of Pasteurella multocida. J Biol Chem, 2006, 281:4380 - 4394)。γ -GCS-GS功能蛋白的大小与γ -GCS和GS这两个酶的酶蛋 白大小之和类似。因此，在生物进化上存在着一定的进化关系；但该酶对GSH的反馈抑制不 敏感，GSH生物合成的反应过程也类似于上述2个独立的功能蛋白酶催化的反应过程。
[0013] III.替代途径
[0014] 大多数好氧性细菌中不含有谷氨酰半胱氨酸合成酶U-GCS)的功能基因， 但其仍能完成谷胱甘肽的生物合成，满足生命活动的需要。因此，在其体内必定含有另 外一条谷胱甘肽合成途径。最近有文献报道，参与脯氨酸生物合成的第一个功能蛋白酶 ProB ( γ -谷氨酸-5-磷酸激酶），该酶编码的功能蛋白能以谷氨酸为底物形成γ -谷氨 酰焦磷酸，谷氨酰焦磷酸能与半胱氨酸发生亲核反应合成谷氨酰半胱氨酸，即能 完成由Y-GCS催化合成的功能反应，再经过GS催化合成谷胱甘肽（Veeravalli K，Boyd D, Iverson BL, et al.Laboratory evolution of glutathione biosynthesis reveals natural compensatory pathways. Nature Chemical Biology, 2010, 7:101-105) 〇 该途径 虽可合成GSH，但反应机制不同，称之为谷胱甘肽生物合成的替代途径。
[0015] 谷胱甘肽的主要生产方法有化学合成法、固定化细胞（或酶）法和发酵法。化学 合成法生产谷胱甘肽工艺已经成熟，但存在成本高、反应步骤多，需要化学拆分且存在环境 污染等问题；酶法生产谷胱甘肽需要获得相关的催化酶系，需要消耗ATP，导致成本高；目 前国内外发酵法合成谷胱甘肽的菌种主要是酿酒酵母、产朊假丝酵母等，而生产菌株主要 依靠传统的诱变育种方法获得。
[0016] 利用基因工程方法构建谷胱甘肽高产菌株的研究报道较多，主要是将谷胱甘肽标 准生物合成途径的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH I)和谷胱甘肽合成酶（GSH II)或双 功能酶gshF基因在宿主细胞中过量表达，提高工程细胞中谷胱甘肽合成酶的活性进而提 高谷胱甘肽的合成水平，这2个途径的谷胱甘肽合成酶已经分别在巴斯德毕赤酵母、酿酒 酵母和大肠杆菌中获得成功表达：
[0017] 大肠杆菌为宿主的基因工程改造：在大肠杆菌中过量表达大肠杆菌的谷 氨酰半胱氨酸合成酶（也称为GSH A)和谷胱甘肽合成酶（也称为GSH B)，重组菌 JM109 (pVB303)谷胱甘肽的水平达到 34. 8mg/g 湿菌体（Liao XY，Shen W，Chen J，et al. Improved glutathione production by gene expression in Escherichia coli. Lett Appl Microbiol, 2006, 43(2) :211-214.);李华钟等人也构建了 GSH A和GSH B基因的质粒 转化大肠杆菌，通过发酵处理使得谷胱甘肽分泌到胞外，发酵产量高达7g/L。虽然所构建的 工程菌发酵生产谷胱甘肽的水平有了较大提高，但发酵过程添加甲苯等有毒化合物，不利 于工业化生产（李华钟，林金萍等.具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成 反应过程·微生物学报，2001，41:16-23)。中国专利申请号201110003488. X公开了嗜热 链球菌（Streptococcus thermophilus)的双功能谷胱甘肽合成酶gshF的重组大肠杆菌细 胞BL21/PET28a-GshF和JM109pTrc99a-GshF进行诱导表达，三种氨基酸采用一次性加入、 多次分批加入或缓慢流加，在不同的碳源培养中谷胱甘肽的产量与对照相比都有较大的提 高，例如以葡萄糖为碳源三种氨基酸单次加入的谷胱甘肽产量为3. 4g/L，而分批发酵的谷 胱甘肽产量为4. 5g/L。
[0018] 巴斯德毕赤酵母为宿主的基因工程改造：中国专利申请号200810039695. 9和 201110343872. 4分别公开了大肠杆菌的GSH A和GSH B在巴斯德毕赤酵母中利用组成 型启动子GAP提高这2个酶蛋白的表达，与对照菌株相比提高了工程菌株合成谷胱甘肽 的水平；同样中国专利申请号为 200710036487. 9、200710192345. U200810039695. 9 和 200910176777. 2也分别公开了酿酒酵母的GSH I和GSH II在巴斯德毕赤酵母中利用组成 型启动子GAP提高这2个酶蛋白的表达，与对照菌株相比也大幅度地提高了工程菌株合成 谷胱甘肽的水平；但在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，虽然也可以达到一定 的产量，但是依然存在半胱氨酸转化率低的问题。其主要原因是在细胞代谢池内谷氨酸、 半胱氨酸、甘氨酸及其中间体谷氨酰半胱氨酸存在化学小分子的渗透过程，难以实现 GSH I和GSH 112步催化反应的快速地高效偶联，导致催化效率较低。而具有2个催化活性 的谷胱甘肽双功能合成酶gshF的2个两个功能域γ -GCS和GS在空间结构上十分接近，两 步催化衔接更加紧密，理论上催化效率应当更高，中间前体应当更少；能实现GSH I和GSH 112步催化反应的偶联，有克服细胞代谢池内因甘氨酸和γ -谷氨酰半胱氨酸等分子之间 渗透导致的催化偶联效率低的潜力；但中国专利申请号201110369992. 1公开了单增李斯 特菌（Listeria monocytogenes)的双功能酶GshF基因在巴斯德毕赤酵母中的表达，重组 菌在摇瓶条件下谷胱甘肽产量是野生型毕赤酵母菌株的4. 13倍，GSH产量为190mg/L，对照 GS115 野生菌 GSH 产量仅为 46mg/L(Ge SL，Zhu TC, Li Y. Expression of Bacterial GshF in Pichia pastoris for Glutathione Production. Appl Environ Microbiol, 2012, 78 (1 5) :5435-5439)。而酿酒酵母的GSH I和GSH II在重组的巴斯德毕赤酵母GS115 (pAGPZHGSH) 表达并进行高密度发酵，菌体浓度达98. 15g(干重）/L，GSH的浓度达到4. 15g/L(Fei Lff, Yang Y, Chen SX. Improved glutathione production by gene expression in Pichia pastoris. Bioprocess Biosyst ENG, 2009, 32:729-735)。可见，双功能酶 GshF 在巴斯德毕 赤酵母中的表达对谷胱甘肽的提升水平远低于酿酒酵母的GSH I和GSHII在巴斯德毕赤酵 母中的表达时谷胱甘肽的产量，这说明双功能酶GshF的催化活性较低。
[0019] 酿酒酵母为宿主的基因工程改造：Kiriyama等利用PGK启动子在酿酒酵母YPH499 细胞中高表达自身的GSH I和GSH II，在摇瓶培养的条件下谷胱甘肽的产量是5.4mg/l/ 0D,而对照为 L 83mg/l/0D (Kiriyama K, Hara KY, Kondo A. Extracellular glutathione fermentation using engineered Saccharomyces cerevisiae expressing a novel glutathione exporter. Appl Microbiol Biotechnol，2012, 96 (4) :1021-1027) ;Fan 等在 酿酒酵母YSF-31细胞仅高表达自身的GSH I，谷胱甘肽的产量为13. lmg/g干细胞，与对照 相比提高了 1.5 倍（Fan X，He X，Guo X，Qu N, Wang C, Zhang B. Increasing glutathione formation by functional expression of the gamma-glutamylcysteine synthetase gene in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Lett, 2004, 26 (5):415-417)〇
[0020] 上述文献报道的主要是针对谷胱甘肽标准生物合成途径在不同宿主细胞中的高 表达，从而提高细胞内谷胱甘肽合成酶的活性，进而提高细胞合成谷胱甘肽的水平；但始终 没有解决GSH I和GSH II两步催化反应快速地高效偶联的难题，同时也没有解决添加外源 半胱氨酸转化效率低的问题。不仅如此，大肠杆菌本身在生长过程中产生致热源，为发酵合 成谷胱甘肽和后续纯化工艺带来困难，增加了生产成本。而巴斯德毕赤酵母作为蛋白表达 系统展现出其可高密度发酵和提高目的产物产量的优势，但它有很强需氧生长的偏好，不 利于还原型谷胱甘肽的合成。
【发明内容】
[0021 ] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有高效生物合成谷胱甘 肽的基因工程菌，可以极大程度地提高谷胱甘肽的合成效率，大大提高原料利用效率，降低 生产成本。
[0022] 为实现上述目的，本发明提供了一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方 法，包括：
[0023] i)在宿主菌细胞内转入编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成 酶融合蛋白的基因，并使其高表达；
[0024] ii)在宿主菌细胞内转入编码Y -谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋 白的基因，并使其商表达；
[0025] iii)敲除宿主菌细胞的Y -谷氨酰转肽酶基因；
[0026] iv)敲除宿主菌细胞的肌醇-3-磷酸合酶基因；
[0027] 所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基 因工程菌；
[0028] 所述i)和ii)中连接肽由6-34个氨基酸残基组成，其通式为：G-X-G-Y-G-Z，其中 G为甘氨酸，X、Y、Z分别为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸组成的1?10 个氨基酸残基。
[0029] 优选的，所述1)、^)、1^)、"）中的宿主菌为酿酒酵母。
[0030] 优选的，所述编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋 白和Y-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因由组成型启动子和/或诱 导型启动子启动表达，所述组成型启动子为GAP、PGK、ADH1、TEF、CYC1、TPI中任一种，所述 诱导型启动子为 Gall、Gal2、Gal3、Gal5、Gal7、Gall0、CUPl、MET25 中任一种。
[0031] 优选的，所述编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋 白和Y -谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因由组成型启动子GAP启动 表达。
[0032] 优选的，编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和 γ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因通过整合型方式高表达。
[0033] 优选的，所述整合型方式高表达通过使用酵母高拷贝的整合位点δ序列或λ DNA 实现。
[0034] 优选的，所述谷氨酰半胱氨酸合成酶具有SEQ ID Ν0. 2所示的氨基酸序列，其 优选由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列编码。
[0035] 优选的，所述谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID N0. 4或SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序 列，其中SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列优选由SEQ ID N0. 3的核苷酸序列编码；SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列优选由SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列编码。
[0036] 优选的，所述Y -谷氨酸激酶具有SEQ ID N0. 8或SEQ ID N0. 10所示的氨基酸序 列，其中SEQ ID N0. 8所示的氨基酸序列由SEQ ID N0. 7所示的核苷酸序列编码；SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列优选由SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列编码。
[0037] 优选的，所述连接肽具有SEQ ID N0. 12所示的氨基酸序列，其优选由SEQ ID NO. 11所示的核苷酸序列编码。
[0038] 优选的，所述谷氨酰转肽酶基因通过基因同源重组进行敲除，其中基因同源 重组使用具有SEQ ID N0. 13所示DNA序列的同源双交换整合框。
[0039] 优选的，所述肌醇-3-磷酸合酶基因通过基因同源重组进行敲除，其中基因同源 重组使用具有SEQ ID N0. 14所示DNA序列的同源双交换整合框。
[0040] 用于合成谷胱甘肽的基因工程菌。
[0041] 本发明中，获得两株用于合成谷胱甘肽的基因工程菌，拉丁文名为Saccharomyces 。6代￥丨8丨36，保藏编号分别为06110：勵.8932和0610：勵.8933，已于2014年03月18日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0042] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0043] 1.本发明通过谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的 高表达打破宿主细胞谷胱甘肽生物合成的转录调控，使胞内谷胱甘肽合成酶活性增强，从 而提高谷胱甘肽的产量；
[0044] 2.本发明通过谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的高表达促进 添加外源半胱氨酸的转化率，进而提高谷胱甘肽的产量；
[0045] 3.本发明通过敲除Y -谷氨酰转肽酶基因降低胞内谷胱甘肽的分解代谢，同时还 敲除肌醇-3-磷酸合酶基因，改善细胞膜的结构，促进谷胱甘肽的胞外分泌；
[0046] 4.使用本发明的方法获得基因工程菌，能大大提高原料利用效率，降低生产成本， 适用于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0047] 图1为含有融合基因 GSH II-GSH I阳性克隆的PCR鉴定；其中，Μ为DNA分子量 标准（Trans2K Plus II DNA Marker)，l 为 W303-1B，2 为 W303-1B/G17#，3 为 W303-1B/G20#， 4 为 W303-1B/G26#，5 为 W303-1B/G30# ;
[0048] 图 2 为 HPLC 法分析 ABD-F 衍生化后 GSH、γ -Glu-Cys、Cys ;
[0049] 图3为SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白ProB/T120I-Gsh B ;其中，1为上样流出液， 2为20mM咪唑洗脱样品，3为50mM咪唑洗脱样品，4为lOOmM咪唑洗脱样品，5为300mM咪 唑洗脱样品，Μ为蛋白分子量标准；
[0050] 图4为融合蛋白ProB/T120I-Gsh Β催化合成GSH的HPLC分析；其中，1为GSH标 准品，2为融合蛋白ProB/T120I-Gsh B催化合成的GSH ;
[0051] 图5为琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增大肠杆菌Gsh Bm突变体基因的DNA片段，其 中泳道1-13是不同引物对的PCR扩增产物，1为GSHB1_7/GSHB1_8, 2为GSHB1_6/GSHB1_9， 3 为 GSHB1_5/GSHB1_10,4 为 GSHB1_4/GSHB1_11，5 为 GSHB1_3/GSHB1_12,6 为 GSHB1_2/ GSHB1_13,7 为 GSHB2_6/GSHB2_7,8 为 GSHB2_5/GSHB2_8,9 为 GSHB2_4/GSHB2_9，10 为 GSHB2_3/GSHB2_10，11 为 GSHB2_2/GSHB2_11，12 为 GSHB2_1/GSHB2_12，13 为 GSHB1_1/ GSHB2_12，M 为 DNA 分子量标准（Trans2K Plus II DNA Marker);
[0052] 图6为整合融合基因 Pr〇Bm_Gsh Bm工程菌的PCR鉴定；其中，M为DNA分子量标准 (Trans2K Plus II DNA Marker)，l 为阴性对照W303-1B/G;2-13 为阳性克隆W303-1B/GP分 另ij 1#，2#，3#，4#，7#，9 #，10#，14#，16#，19#，22 #，24# ;
[0053] 图7为谷氨酰转肽酶基因敲除工程菌株的PCR鉴定；其中，Μ为DNA分子 量标准（Trans2K Plus II DNA Marker)，1为阴性对照W303-1B/G，2为阳性质粒对照 pGT2345-Trpl，3 为 W303-1B/G/Gr24#，4 为 W303-lB/GP/Gr3#，5 为 W303-lB/GP/Gr4# ;
[0054] 图8为肌醇-3-磷酸合酶基因敲除工程菌株的PCR鉴定；其中，Μ为DNA分 子量标准（Trans2K Plus II DNA Marker) ; 1为阴性对照W303-1B/G，2为阳性质粒 pIN02345-Ade2,3 为 W303-lB/G/GrincTl#，4 为 W303-lB/G/GrincT2#，5 为 W303-1B/ G/Grino-3#，6 为 W303-lB/G/Grino-4#，7 为 W303-lB/GP/GrincTl#，8 为 W303-1B/GP/ Grino-2#，9 为 W303-lB/GP/Grino-3#，10 为 W303-lB/GP/Grino-4# ;
[0055] 图9为整合融合基因 Prol-Gsh Bm的工程菌的PCR鉴定；其中，Μ为DNA分 子量标准（Trans2K Plus II DNA Marker)，1为阴性对照W303-1B/G，2为质粒对照 TyR14-UG6-PGAP_rc-Prol-Gsh 为阳性克隆 W303-lB/GPlGrino-l# ;
[0056] 图10为工程菌株利用YH)培养基在摇瓶发酵水平添加氨基酸对GSH产量的影响。
【具体实施方式】
[0057] 本发明提供了一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：
[0058] i)在宿主菌细胞内转入编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成 酶融合蛋白的基因，并使其高表达；
[0059] ii)在宿主菌细胞内转入编码Y -谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋 白的基因，并使其商表达；
[0060] iii)敲除宿主菌细胞的γ-谷氨酰转肽酶基因；
[0061] iv)敲除宿主菌细胞的肌醇-3-磷酸合酶基因；
[0062] 所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基 因工程菌；
[0063] 所述i)和ii)中连接肽由6-34个氨基酸残基组成，其通式为：G-X-G-Y-G-Z，其中 G为甘氨酸，X、Y、Z分别为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸组成的1?10 个氨基酸残基。
[0064] 本发明中采用的宿主菌可以是大肠杆菌、酵母细胞（如酿酒酵母，巴斯德毕赤酵 母）和丝状真菌等微生物细胞，优选为酿酒酵母。
[0065] 本发明中，所述编码Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合 蛋白和Y-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因由组成型启动子和/或 诱导型启动子启动表达，所述组成型启动子为GAP、PGK、ADH1、TEF、CYC1、TPI中任一种，所 述诱导型启动子为 Gall、Gal2、Gal3、Gal5、Gal7、Gall0、CUPl、MET25 中任一种。
[0066] 本发明中，分别使用酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的组成型启动子GAP驱动编码 Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和Y-谷氨酸激酶-连接 肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因在宿主细胞中共同高表达。
[0067] 所述编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和 Y-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因通过整合型方式高表达。本发 明中，所述编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和谷 氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因整合到酵母S序列中，其中δ序列 在酵母基因组中存在约425个拷贝，将基因整合到这个位点，能实现其多拷贝的稳定整合， 进而达到提商基因表达的目的。
[0068] 本发明中提供了 SEQ ID Ν0. 3、SEQ ID Ν0. 11、SEQ ID NO. 1所示的分别编码酵母 谷胱甘肽合成酶（GSH II)、连接肽、酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH I)的DNA片段 克隆方法，然后通过基因亚克隆的方式获得融合基因 GSH II-GSH I，即同源整合表达载体 TyRH-HgyB/P^i/GSffi-GSHl/T^，其中使用酿酒酵母的组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因 启动子GAP启动其表达；结果是所表达的GSH II和GSH I之间融合了 7个氨酸残基（SEQID N0. 12所示的氨基酸序列），使得2个催化酶结构域空间上十分靠近，从而有效地提高这2 步级联催化反应的效率，所构建的工程菌与对照相比谷胱甘肽产量提高2. 3倍。
[0069] 本发明还提供了分别编码大肠杆菌谷氨酸激酶突变体（Pr〇Bm)(见SEQ ID NO. 7)、连接肽、大肠杆菌谷胱甘肽合成酶（Gsh Bm)(见SEQ ID NO. 5)的DNA片段克隆方法， 然后通过基因亚克隆的方式获得融合基因 ProBm-Gsh Bm，即同源整合表达载体TyR14-UG6/ PeAP_rc/Pr〇Bm-Gsh Bm/TrcK，使用巴斯德毕赤酵母组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子GAP 启动其表达；结果是所表达的ProB"^P Gsh Bm之间也融合了 7个氨酸残基（SEQ ID NO. 12 所示的氨基酸序列），使得2个催化酶结构域空间上十分靠近，所构建的工程菌提高了半胱 氨酸的转化效率和谷胱甘肽的产量。
[0070] 同样，在本发明中获得了编码酿酒酵母谷氨酸激酶（Ρι·〇1)(见SEQ ID N0. 9) 与大肠杆菌谷胱甘肽合成酶（Gsh Bm)的融合基因 Prol-Gsh Bm，即同源整合表达载体 TyR14-UG6/PeAP_rc/Pr〇l-Gsh Bm/TrcK，也使用巴斯德毕赤酵母高表达的组成型三磷酸甘油醛 脱氢酶基因启动子GAP启动其表达，所构建的工程菌提高了半胱氨酸的转化效率和谷胱甘 肽的产量。
[0071] 本发明提供了在谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶之间或谷氨酸 激酶和谷胱甘肽合成酶之间引入连接肽（见SEQ ID N0. 12)的PCR方法，增加2个酶蛋白 功能域的柔性结构，使二者不因为形成融合蛋白导致空间结构的改变，达到提高级联催化 反应效率的目的。
[0072] 本发明提供了通过同源重组敲除谷氨酰转肽酶基因的技术方案，其中所使用 的敲除谷氨酰转肽酶基因的同源双交换整合框具有SEQ ID NO. 13的DNA序列，含有2 个长度分别为1153bp和431bp的γ-谷氨酰转肽酶基因片段，还含有一个长度为1163bp 营养互补筛选标记Trpl ;通过敲除γ-谷氨酰转肽酶降低因细胞内谷胱甘肽浓度高而诱发 的分解代谢，进而提高工程菌谷胱甘肽的产量。
[0073] 本发明还提供了通过同源重组敲除肌醇-3-磷酸合酶基因的技术方案，其中所使 用的敲除肌醇-3-磷酸合酶基因的同源双交换整合框具有SEQ ID N0. 14的DNA序列，含有 2个长度分别为866bp和784bp的肌醇-3-磷酸合酶基因片段，还含有一个长度为2516bp 营养互补筛选标记Ade2 ;通过敲除肌醇-3-磷酸合酶降低肌醇的合成效率，到达改变细胞 膜结构，促进谷胱甘肽的向胞外渗透的效率，从而提高谷胱甘肽的合成水平。
[0074] 在本发明中，获得两株用于合成谷胱甘肽的基因工程菌，保藏编号分别为 CGMCCN0. 8932和CGMCC N0. 8933,已于2014年03月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所。
[0075] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。本领域的技术人员应该理 解，这些实施例只是用于说明目的，而不限制本发明的范围，在不背离权利要求书范围的条 件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进 也属于本发明的保护范围。除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领 域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得，所用方法均为本领域技术人员公 知的常规方法。
[0076] 实施例1酵母基因组DNA的提取
[0077] 利用 YPD 培养基（2% Peptone，1 % Yeast Extract，2% Glucose，固体培养基加入 1.5%琼脂）培养酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母，采用北京康为世纪生物科技有限公司的酵 母基因组DNA提取试剂盒（Cat.No. CW0569)提取其基因组DNA，具体操作步骤如下：
[0078] 1.取l_5ml酵母培养物，12000rpm离心1分钟，收集菌体沉淀，弃上清。
[0079] 2.酵母细胞壁的去除：向菌体中加入600 μ 1 Lyticase Working Buffer (使用前 检查加入β -巯基乙醇，使其终浓度为〇. 1 % )，并加入5 μ 1 Lyticase (10U/μ 1)，充分混 匀。30°C处理30分钟。4000rpm离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
[0080] 3.向沉淀中加入200 μ 1 Buffer GTL，加入40mg玻璃珠 （Glass Beads)，润旋5分 钟，12000rpm离心5分钟，将上清移到一个新的离心管中。
[0081] 4.加入20 μ 1 Proteinase K，混匀。55°C振荡水浴，温育期间每20-30分钟颠倒混 匀一次；然后加入4 μ 1浓度为100mg/ml的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
[0082] 5. 13000rpm离心5分钟，小心吸取上清至新离心管中。
[0083] 6.加入200 μ 1 Buffer GL，充分混匀。70°C孵育10分钟，其间颠倒混匀数次。
[0084] 7.加入200 μ 1无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。短暂离心，使 管壁和管盖上的液体集中到管底。
[0085] 8.将步骤7所得溶液和沉淀全部加入到已装入收集管（Collection Tube)的吸附 柱（Spin Column DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。lOOOOrpm离心1分钟，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0086] 9.向吸附柱中加入500μ 1 Buffer GW1，lOOOOrpm离心1分钟，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0087] 10.向吸附柱中加入500 μ 1 Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇）， lOOOOrpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0088] 11. 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻 底晾干。
[0089] 12.将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50_200μ 1 Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，lOOOOrpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20°C保存 DNA。
[0090] 实施例2GSH I-GSH II同源整合表达载体的构建
[0091] 1.同源整合片段δ DNA片段的克隆
[0092] 根据酿酒酵母S288C(GenBank注册号为U20865)的δ DNA序列设计合成4条引物 (引物核苷酸序列见SEQ ID Ν0. 15-18):
[0093] TY_R1:5' -AATGCGGTACCGCGGCCGCGAGCTGAGAAATTTGTGGGT-3，
[0094] TY_R2:5; -TGTAATAGGGATATCCACCTAAGTCTCGAGTCTAGAACTAGTGGATCCCC-3 ;
[0095] TY_R3:5' -ACTTAGGTGGATATCCCTATTACA-3'
[0096] TY_R4:5' -AAGCTGGAGCTCGCGGCCGCCCGCGGCCGCTATAATGTTG-3，；
[0097] 以酵母基因组DNA为模板，分别用2组引物TY_R1/TY_R2和TY_R3/TY_R4进行 PCR扩增（95°C，5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，30S，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)， 得到长度分别为315bp和199bp的DNA片段，利用多功能DNA纯化回收试剂盒（北京百泰 克生物技术有限公司）从琼脂糖凝胶电泳后的含有目的条带的凝胶中回收DNA片段，然后 各取 2μ1(约 lOOng)与 PyroBest Taq DNA polymeraselU、2yl reaction bufTer、lyl dNTPs (lOmM)、ddH20等试剂组成20 μ 1的反应体系，进行DNA片段的补平反应（95°C，2min ; 95°C，30S，50°C，40S，72°C，30S，7cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)。再利用补平反应后的 DNA片段产物为模板，利用引物TY_R1/TY_R4进行PCR扩增（95°C，5min ;95°C，30S，45°C， 40S，72°C，35S，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)，得到长度为 490bp 的 DNA 片段；利用限 制性内切酶Κρη I和Sac I酶切并亚克隆到用相同内切酶处理的克隆质粒EZ-T(北京康 润诚业生物科技有限公司）中，经DNA测序验证与预期的结果一致，核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示，即得到中间质粒EZ-TyR14 ;酵母基因组中δ DNA有425个拷贝，通过转化可以 实现高拷贝的目的基因整合。
[0098] 2.含G418和潮霉素抗性筛选标记的克隆载体构建
[0099] 首先利用基因定点突变的方法消除在载体pUG6 (GenBank注册号为AF298793)上 表达框kanMX中的限制性内切酶位点Pst I、Nru I和Hind III，然后利用Hind III和 EcoR V限制性内切酶亚克隆SEQ ID N0. 20所示的DNA片段到质粒EZ-TyR14中，即得到载 体 TyR14-UG6。
[0100] 依据表达载体pAN7-l (GenBank注册号为Z32698)上编码潮霉素磷酸转移酶基因 (hygromycin B phosphotransferase，HgyB)的DNA序列为基础设计合成14条引物（引物 核苷酸序列见SEQIDN0·21-34)，如表1所示。首先利用引物AN7_1/AN7_2、AN7_3/AN7_4、 AN7_5/AN7_6、AN7_7/AN7_8、AN7_9AN7_10 进行 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，45S，50°C，50S， 72°C，30S，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)，分别扩增出 289bp、lllbp、117bp、155bp、 204bp的DNA片段，利用多功能DNA纯化回收试剂盒回收DNA片段，然后各取2μ 1(约 lOOng)与含 Taq DNA 聚合酶的 ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组成 20μ 1 的反 应体系，进行 DNA 片段的补平反应（95°C，2min ;95 °C，45S，45 °C，50S，72 °C，45S，7cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物AN7_1/ AN7_10 进行 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，45S，43°C，50S，72°C，45S，30cycles ;72°C，lOmin ; 4°C，lOmin)，得到长度为791bp的DNA片段；回收DNA片段，利用限制性内切酶Nco I和Spe I酶切并亚克隆771bp的编码框到用相同内切酶处理的克隆pUG6,即得到质粒pUG6-ANl ; 同时利用引物 AN7_11/AN7_12、AN7_13/AN7_14 进行 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，45S，50°C， 50S，72°C，30S，30cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，分别扩增出 281bp、354bp 的 DNA 片 段，回收DNA片段，然后各取2 μ 1 (约lOOng)与含Taq DNA聚合酶的ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组成20μ 1的反应体系，进行DNA片段的补平反应（95°C，2min ;95°C， 45S，45°C，50S，72°C，30S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用补平反应后的 DNA 片段产物为模板，再利用引物AN7_11/AN7_14进行PCR扩增（95°C，5min ;95°C，45S，43°C， 50S，72°C，30S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，得到长度为 606bp 的 DNA 片段；纯化回 收DNA片段，再利用限制性内切酶Bgl II和Not I酶切并亚克隆含有部分HgyB编码框的 576bp DNA片段到用BamH I和Not I酶切处理的克隆pUG6-ANl中，即得到质粒pUG6-AN2。 因此，利用PCR的方法突变了 HgyB编码框中的限制性内切酶位点EcoR I、Pst I、Nco I、Nde I、Bgl II ;最后再利用Hind III和EcoR V限制性内切酶亚克隆SEQ ID NO. 35所示的DNA 片段到质粒EZ-TyR14中，即得到载体TyR14-HgyB。
[0101] 表1合成潮霉素磷酸转移酶基因使用的PCR反应引物
[0102] 引物名称 減基序列方向（) AN7J GTCCAACCATGGCTGAACTCACCGCGACGTCT AN7_2 TGTGCTCTGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTAAATTCCCC AATGTCAAGC AN7-3 TTGCATCTCCCGCAGAGCACAGGGTGTCACGTTGC AN7_4 TCGGCCGCAGCGATTGCATCCATAGCCTCCGCGACCGGTTGCAGAAC AGCGGGCAGT AN7_5 TGGATGCAATCGCTGCGGCCGATCTTAGCC AN7_6 GGGGATCAGCAATCGCGCAAATGAAATCACGCCATGTAG AN7_7 TTGCGCGATTGCTGATCCC AN7-8 TGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGAACGAGGTGCCGGACTTCG AN7_9 CACGCGGATTTCGGCTCCAACA AN7-10 AGGCCAACTAGTGGATCCTGCAAGCTCCGGA AN7_11 CTTGCAAGATCTCCACGGCTCCGGGCGTATATG AN7_12 CTTTTTATTGTCAGTACTGACTATTCCTTTGCCCTCGGA AN7-13 GTCAGTACTGACAATAAAAAG AN7_14 TATAGGGAGACCGGCAGATCC
[0103] 3.酿酒酵母PGK1终止子的克隆
[0104] 根据酿酒酵母S288C的三磷酸甘油酸激酶基因 （Phosphoglycerate kinase PGK)(GenBank注册号为J01342)序列设计合成4条引物（引物核苷酸序列见SEQ ID NO. 36-39)，如表2所示，以基因组DNA为模板，用引物PGK1_T1/PGK1_T4进行第一轮PCR反 应（95DC，5min ;95DC，45S，50DC，50S，72DC，30S，30cycles ;72DC，lOmin ;4DC，lOmin)。再利 用第一轮PCR产物为模板，用引物PGK1_T2/PGK1_T3进行巢式PCR反应（Nested-PCR)扩 增（95 DC，5min ;95 DC，45S，50 DC，50S，72 DC，30S，30cycles ;72 DC，lOmin ;4 DC，lOmin)，得到 一条长约为332bp的DNA片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后用限制性内切酶 Xba I和Hind III酶切，再亚克隆SEQ ID N0. 40所示的315bp DNA片段到用相同限制性 内切酶酶切处理的载体TyR14-UG6和TyR14-HgyB中，分别得到质粒载体TyR14-UG6/T rcK和 TyR14-HgyB/TPGK〇
[0105] 表2扩增终止子PGK的PCR反应引物
[0106] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') PGK1_T1 TAAGGAATTGCCAGGTGTTGC PGK2-T2 AGATCGGCTAGCATTGAATTGAATTGAAATCGAT PGK3T3 TCCTTCTCGAAAGCTTTAACG PGK4T4 GGCTTCAAGCTTACACAACACGG
[0107] 4.巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母GAP启动子的克隆
[0108] 依据巴斯德毕赤酵母三磷酸甘油醒脱氢酶（Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)基因（GenBank注册号为FN392320)设计合成4条引物（引物核苷酸序列 见SEQ ID N0. 41-44)，如表3所示，以基因组DNA为模板，用引物GAP_PC1/GAP_PC4进行 第一轮 PCR 反应（95°C，5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，45S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物GAP_PC2/GAP_PC3进行Nested-PCR扩增 (95°C，5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，45S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，得到一 条长约为886bp的DNA片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后用限制性内切酶Xba I和BamH I酶切，再亚克隆如SEQ ID NO. 45所示的874bp DNA片段到用相同限制性内切酶 酶切的载体TyR14-UG6/TrcK中，得到质粒载体TyRH-UGe/WP^f
[0109] 利用合成的引物GAP_SCP1/GAP_SCP2 (引物核苷酸序列见SEQ ID NO. 46-47)，如 表3所示，和质粒pRS434GAP(GenBank注册号为AB304854)为模板进行PCR扩增（95°C， 5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，45S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，得到一条长约 为715bp的DNA片段。从琼脂糖凝胶中纯化目的DNA片段，然后用限制性内切酶Xba I和 BamH I酶切，再亚克隆SEQ ID NO. 48所示的703bp DNA片段到用相同限制性内切酶酶切的 载体 TyR14-HgyB/TrcK 中，得到质粒载体 TyR14-HgyB/PeAP_sc。
[0110] 表3扩增巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母GAP启动子的PCR反应引物
[0111] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') GAPPC1 CTTG AGCATGCCTACTAGG AAC GAPPC2 CTTTAATCTAGACGAACTGTGGGGTTGCAGACAG GAPPC3 GATAGCGGATCCTTGACTCCATATGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTG A GAPPC4 AGACGTCCAATACGTCCGAAACC GAPSCP1 GAATTCTCTAGATTTATCATTATCAATACTGC GAPSCP2 GATAGCGGATCCAGGATATCCATATGTTTGTTTGTTTATGTGTG
[0112] 5.酿酒酵母GSH II基因的克隆
[0113] 为方便基因片段的亚克隆和融合蛋白的表达，根据酿酒酵母S288C谷胱甘肽合成 酶（GSH II )基因（GenBank注册号为NC_001147)的序列设计合成16条引物（引物核苷酸 序列见SEQ ID N0. 49-64)，如表4所示，通过PCR反应进行定点突变，消除DNA序列中的限 制性内切酶位点Hind III、Κρη I和Spe I，整个基因片段分成3个片段进行拼接。
[0114] GSH 115'-端DNA片段F1的PCR扩增：以基因组DNA为模板，用引物GSH2_1/ GSH2_2 进行第一轮 PCR 反应（95°C，5min ;95°C，50S，5(TC，50S，72t：，1. 5min，30cycles ; 72 °C，lOmin ;4 °C，lOmin)。再利用第一轮PCR产物为模板，用引物GSH2_3/GSH2_4进行 Nested-PCR扩增（95°C，5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，45S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin)，得到GSH25'-端的长度为665bp的DNA片段，通过"TA"克隆到EZ-T载体上进行 测序验证，得到质粒EZ-GSH2-F1。
[0115] GSH II中间的DNA片段F2的PCR扩增：利用引物GSH2_5?GSH2_12进行连续 重叠 PCR扩增合成，首先采用引物GSH2_8/GSH2_9进行DNA片段的补平反应（95°C，4min ; 95 °C，20S，45 °C，30S，72 °C，10S，7cycles ;72 °C，lOmin ;4 °C，lOmin);然后利用补平反应 后的DNA片段产物为模板，利用引物GSH2_7/GSH2_10进行第一轮PCR扩增（95°C，4min ; 95°C，30S，45°C，40S，72°C，15S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin);其扩增产物作为下一 组引物GSH2_6和GSH2_11进行PCR扩增反应的模板，再进行第二轮PCR扩增反应（95°C， 5min ;95°C，30S，45°C，40S，72t：，20S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin);随后再利用引 物 GSH2_5 和 GSH2_12 进行第三轮 PCR 扩增反应（95 °C，5min ;95 °C，30S，45 °C，40S，72 °C， 25S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin);扩增得到 GSH II 中间 288bp 的 DNA 片段 F2。
[0116] GSH II基因 :Τ -端DNA片段F3的扩增：以上述引物GSH2_1/GSH2_2所扩增的 PCR 产物为模板，利用 2 组引物 GSH2_13/GSH2_14、GSH2_15/GSH2_16 进行 Nested-PCR 扩 增（95 °C，5min ;95 °C，30S，50 °C，40S，72 °C，35S，30cycles ;72 °C，lOmin ;4 °C，lOmin)，PCR 扩增得到2个长度分别为199bp和391bp的DNA片段；利用多功能DNA纯化回收试剂盒 回收DNA片段，然后各取2μ1(约lOOng)与含Taq DNA聚合酶的ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组成20μ 1的反应体系，进行DNA片段的补平反应（95°C，2min ;95°C， 40S，45°C，50S，72°C，40S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用补平反应后的 DNA 片 段产物为模板，再利用引物GSH2_13和GSH2_16进行PCR扩增（95°C，5min ;95°C，40S，43°C， 50S，72°C，40S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，得到长度为 590bp 的 DNA 片段 F3。
[0117] GSH II基因中间片段F2和3'-端DNA片段F3的拼接：利用多功能DNA纯化回 收试剂盒回收DNA片段，然后取中间片段F2和3'-端DNA片段F3各2 μ 1 (分别约50ng 和 lOOng)与含 Taq DNA 聚合酶的 ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix (2 X)试剂组成 20μ 1 的 反应体系，进行 DNA 片段的补平反应（95°C，2min ;95°C，40S，45°C，50S，72°C，45S，7cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用补平反应后的DNA片段产物为模板，再利用引物GSH2_5 和 GSH2_16 进行 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，40S，43 °C，50S，72°C，45S，30cycles ;72°C， lOmin ;4°C，lOmin)，得到长度为864bp的DNA片段；通过"ΤΑ"克隆到EZ-T载体上进行测 序验证，得到质粒EZ-GSH2-F23。最后利用内切酶EcoR V和Spel酶切EZ-GSH2-F1并利用 琼脂糖凝胶电泳分离和回收5'-端DNA片段F1，然后亚克隆到经内切酶EcoR V和Nhe I 处理的EZ-GSH2-F23中，最终得到SEQ ID NO. 3所示的GSH II基因，即质粒命名为EZ-GSH II，该基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO. 4。在合成GSH II基因的过程中可利用引物 GSH2_16通过PCR扩增的方法在其3'-端引入SEQ ID NO. 11所示的核苷酸序列，即编码的 连接肽氨基酸序列是SEQ ID NO. 12并与GSH II氨基酸序列C-端融合，目的是增加与GSH I形成融合蛋白后的柔性结构，保持融合蛋白能催化合成谷胱甘肽的酶活性。
[0118] 表4扩增谷胱甘肽合成酶（GSHII)基因的PCR反应引物
[0119] 引物名称 碱基序列方向（5W) GSH2_i GATCCTCCAAAGGTAGCAAAGTG GSH2_2 AAGTTCTAGCATCATCTTCCTAGC GSH2_3 AAGGATATCATATGGCACACTATCCACCTTCC GSH2-4 AGGATCACTAGTTGTAGAAGAACTT GSH2_5 TCTACGGCTAGCGATCCTATTGTCGCATTCATT GSH2_6 CCTATTGTCGCATTCATTGTGCAAAGAAACGAGAGAAATGTGT TTGATCAAAAGGTCTT GSH2_7 GTTTGATCAAAAGGTCTTGGAATTGAATttaTTGGAAAAATTCGG TACtAAATCTGTTA GSH2_8 TCGGTACiAAATCTGTTAGGTTGAQTTTGATGATGTTAAlGATA AATTGTTtATTGAT GSH2-9 TCCTGCTCTGTGTCCCTAATGAATAATTTTCCAGTTTTATCATCA ATAAACAATTTATC GSH2_10 CAGTGGTTGTGTAACCCGTTCTGTAATAAACCACCGCTATTTCC TGCT'C 丁 GTGTC'CCTA GSH2_iL CAAGAATAGTCTTGCCTCCCAGTCCTTTTCAGAAGTGTAATCAG TGGTTGTGTAACCCG GSH2J2 TGCGAAACTTTTTTCCAAGAATAGTCTTGCCTCC GSH2_13 TCTTGGAAAAAAGTTTCGCAATAAAGGCCCCAGATTTATTGAC TCAATTA丁CTGGCTCC GSH2J4 CTCTTGCCTTCCCTGCCAAGTTTCGTATCATCCAAGGGATA GSH2_i5 ACTTGGCAGGGAAGGCAAGAG GSH2J6 TACACGGGATCCGCCACCTCCACCTCCGTAAAGAATAATACTG _TCCAAA_
[0120] 6.酿酒酵母GSH I基因的克隆
[0121] 为方便基因片段的亚克隆和融合蛋白的表达，根据酿酒酵母S288C γ -谷氨酰半 胱氨酸合成酶（GSH1)基因（GenBank注册号为Χ85021)的序列设计合成16条引物（引物 核苷酸序列见SEQ ID N0. 65-80)如表5所示，通过PCR反应进行定点突变，消除DNA序列 中的限制性内切酶位点BamH I、EcoR I、Nco I、Nde I和Ssp I，整个基因片段分成3个片 段进行拼接。
[0122] GSH 15'-端DNA片段F1的PCR扩增：以基因组DNA为模板，用引物GSH1_1/ GSH1-16 进行第一轮 PCR 反应（95DC，5min ;95DC，50S，50DC，50S，72DC，2. 5min，30cycles ; 72 DC，lOmin ;4 °C，lOmin)。再利用第一轮PCR产物为模板，分别用引物GSH1_2/GSH1_3 和 GSH1-4/GSH1-5 进行 Nested-PCR 扩增（95 DC，5min ;95 DC，45S，50 DC，50S，72 DC，30S， 30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到其 5'-端的长度分别为 231bp、323bp 的 DNA 片段，利用多功能DNA纯化回收试剂盒回收DNA片段，然后各取2μ 1(约lOOng)与含Taq DNA聚合酶的ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组成20μ1的反应体系，进行DNA 片段的补平反应（95°C，2min ;95°C，40S，45°C，50S，72°C，40S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin)。再利用补平反应后的DNA片段产物为模板，再利用引物GSH1_2和GSH1_5进行 PCR扩增（95°C，5min ;95°C，40S，43°C，50S，72t：，40S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)， 得到长度为536bp的DNA片段，通过"TA"克隆到EZ-T载体上进行测序验证，得到质粒 EZ-GSH1-F1。
[0123] GSH I中间DNA片段F2的PCR扩增：以引物GSH1_1/GSH1_16的第一轮PCR产物 为模板，分别用引物 GSH1_6/GSH1_7 和 GSH1_8/GSH1_9 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ; 95°C，45S，50°C，50S，72 °C，35S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到其中间的 长度分别为283bp、442bp的DNA片段，利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后各 取 2μ1(约 lOOng)与含 Taq DNA聚合酶的 ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组 成20μ 1的反应体系，进行DNA片段的补平反应（95°C，2min ;95°C，40S，45°C，50S，72°C， 45S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用 引物 GSH1_6/GSH1_9 进行 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，40S，43°C，50S，72°C，45S，30cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，得到长度为705bp的DNA片段，通过"ΤΑ"克隆到EZ-T载体上进 行测序验证，得到质粒EZ-GSH1-F2。
[0124] GSH I基因 :V -端DNA片段F3的扩增：以引物GSH1_1/GSH1_16的第一轮PCR 产物为模板，分别用引物 GSH1_10/GSH1_11、GSH1_12/GSH1_13 和 GSH1_14/GSH1_15 进行 Nested-PCR扩增（95°C，5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，35S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin)，扩增得到3'-端DNA的长度分别为235bp、137bp、510bp的DNA片段，利用多功能 DNA纯化回收试剂盒回收DNA片段，然后各取2μ 1(分别约75ng、50ng和lOOng)与含Taq DNA聚合酶的ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix (2 X)试剂组成20 μ 1的反应体系，进行DNA 片段的补平反应（95°C，2min ;95°C，40S，45°C，50S，72°C，50S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin)。再利用补平反应后的DNA片段产物为模板，再利用引物GSH1_10/GSH1_15进行 PCR扩增（95°C，5min ;95°C，40S，43°C，50S，72t：，50S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)， 得到长度为853bp的DNA片段，通过"TA"克隆到EZ-T载体上进行测序验证，得到质粒 EZ-GSH1-F3。
[0125] GSH I全长基因的拼接：利用限制性内切酶Ssp I和Xba I酶切质粒EZ-GSH1-F3， 纯化回收其3'-端847bp的DNA片段，亚克隆到用Sma I和Xba I酶切处理的质粒 EZ-GSH1-F2,转化大肠杆菌筛选阳性克隆，即得到质粒EZ-GSH1-F23 ;再利用EZ-T载体上内 切酶位点EcoR I和其5'-基因片段内的内切酶位点Bgl II进行酶切，纯化回收其5'-端 523bp的DNA片段，亚克隆到用BamH I和EcoR I酶切处理的质粒EZ-GSH1-F23,转化大肠 杆菌筛选阳性克隆，即得到质粒EZ-GSH I;最终得到SEQ ID NO. 1所示的GSH I基因，其编 码的氨基酸序列是SEQ ID NO. 2。
[0126] 表5扩增γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH I)基因的PCR反应引物
[0127] 引物名称 碱基序列方向（5?) GSH1_1 GAGC'AGATTTAGTATAGGGCTAC GSHL_2 ATTCCAGGATCCATGGGATTGTTAGCTTTGGGCACGCCTTTGC GSHI_3 CTTGTCATGGCAAACGTCCAACATAGAATTTCTCTCCTT GSH1-4 GACGTTTGCCATGACAAGATATTAACTGAGCTTAATAT GSH 1_5 AGCGGAAGATCTTTAATGTTAATAAAGTCGGGGC
[0128] GSH1_6 CATTAAGGATCCGTGGAATCAT GSH17 GCCCATGCCAAAACCCATAGAATCCATATAAATGAAAC GSH1_8 CTATGGGTTTTGGCATGGGC GSH1_9 GATATCCCCGGGGCCTTATCATTCTCTAATAGTCTTCCTAATAC TTTTTCATT GSH1_10 GATATCAATATTGGACTATGATCTTGCTAAACATTTTGCGCATT TGTACATAAGAGATC GSH1」1 CACTTCAAATGGTCTGAACTCCACTCTCCAACCAGGAG GSH1J2 AGTTCAG ACCATTTGAAGTG GSHI_13 TTCCCATACTTTGGACATGTGAATATATGCGTTGATATTATCGG AAAAGGTC GSH1_14 CACATGTCCAAAGTATGGGAA GSH1J5 TCTAGAACTAGCTTAACATTTGCTTTCTATTGAAG GSH1_16 CAATCACCGTGTCACCCAAATCG
[0129] 7. GSH I-GSH II同源整合表达载体的构建
[0130] 利用限制性内切酶Nde I和BamH I酶切质粒EZ-GSH II，纯化回收1494bp的DNA 片段，亚克隆到用Nde I和BamH I酶切处理的质粒载体TyRH-HgyB/P^j。，转化大肠杆菌 筛选阳性克隆，即得到质粒TyR14-HgyB/PQAP_ sc/GSH2 ;再利用内切酶BamH I和Xba I酶切质 粒EZ-GSH I，纯化回收其2053bp的DNA片段，亚克隆到用BamH I和Nhe I酶切处理的质粒 TyR14-HgyB/P&AP_se/GSH2,转化大肠杆菌筛选阳性克隆，即得到含有融合的GSH II-GSH I融 合基因并用于酿酒酵母的同源整合和表达的质粒TyR14-HgyB/PQAP_se/GSH II-GSH I。
[0131] 实施例3酿酒酵母的转化、工程菌株的筛选鉴定和代谢产物分析
[0132] (1)酵母感受态细胞的制备
[0133] ①用接种环挑取保存于4°C的YPD平板上的W303-1B单菌落，转接于新的YPD平 板，30°C培养2-3d，直至长出单菌落，活化菌种；
[0134] ②挑取YPD平板上的新活化的《303-1Β单菌落接种至装有30ml YH)培养基的 250ml三角瓶中，30°C，200rpm培养，至菌液0D_为1. 0-1. 2 ;
[0135] ③菌液4000rpm离心lmin，弃上清；
[0136] ④用30ml预冷的无菌ddH20洗漆菌体，4000rpm离心lmin，弃上清，重复3次；
[0137] ⑤加入30ml预冷的无菌1M山梨醇溶液洗漆菌体，4000rpm离心lmin，弃上清，重 复2次；
[0138] ⑥加入15ml预冷的无菌1M山梨醇溶液，混勻，分装于EP管，每管80 μ 1,置于冰上 备用，也可置于_80°C保存。
[0139] (2)酵母的电转化
[0140] ① 10 ?20 μ g表达载体 TyR14-HgyB/PeAP_sc/GSH II-GSH I 经内切酶Not I 酶切线 性化后，抽提沉淀，溶于20 μ 1无菌ddH20中；
[0141] ②将上述20 μ 1线性化质粒加入到80 μ 1感受态细胞酿酒酵母W303-1B中，轻轻 地混合后转入预冷的电转杯中，冰浴5min ;
[0142] ③电击转化；
[0143] ④迅速加入lmL冰上预冷的1M山梨醇，轻柔混匀后，转入EP管中，30°C孵育lh ;
[0144] ⑤取300 μ 1涂布于YPD平板上，置于30°C培养2-3d，直至长出单菌落。
[0145] (3)阳性菌株的筛选
[0146] 转化后的YH)平板上长出单菌落，再将单菌落转接到潮霉素 B浓度为4mg/ml的 YPD平板上，培养2-3d;为了检测GSH II-GSH I融合基因是否整合入酿酒酵母W303-1B中， 则挑取抗性平板上长出的菌株，用康为世纪酵母基因组DNA提取试剂盒提取筛选转化子的 酵母基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，利用引物GAP_SCP1/PGK1_T3进行第一轮扩增 (95°C，5min ;95°C，50S，5(TC，50S，72t：，4min ;30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，以第一 轮产物为模板，引物 GSH2_5/GSH1_15 进行第二轮 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，50S，50°C， 50S，72°C，3min ;30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)，得到 2900bp 的 DNA 片段，回收目的片 段进行测序鉴定获得正确菌株W303-1B/G(G代表PeAP_s。-GSHII-GSH I-TrcK表达框）17#、20#、 26#(见图 1)。
[0147] (4)高产谷胱甘肽菌株的获得
[0148] ①挑选工程菌株，接种至含有30ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm过 夜培养；
[0149] ②取上述菌液0. 5ml转接到装有50ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm 过夜培养；
[0150] ③再将步骤②的菌液转接到装有100ml YH)培养基的500ml三角瓶中，控制初始 0D6(IQ = 0· 15,十层纱布塞密封，30°C，200rpm培养。
[0151] ④每隔24h取样，以W303-1B菌株作为对照，对工程菌株合成的谷胱甘肽进行定量 分析，最终获得高产谷胱甘肽的工程菌株。
[0152] 实施例4GSH的定量方法
[0153] 实验测量酵母细胞内GSH含量的方法为HPLC柱前衍生化法：
[0154] ①胞内谷胱甘肽的提取：乙醇提取法。取1ml菌液,4000rpm离心lmin,弃上清，菌 体用蒸馏水反复洗涤2次。向洗净的菌体中加入lml40%的乙醇，置于30°C条件下2h，然后 4000rpm离心lmin，取500 μ 1上清于新EP管。重复操作1次。最后得到lml的菌体萃取 液。
[0155] ②GSH的衍生化反应：取25μ 1的菌体萃取液和25μ 1的Solution 1(1 %磺 基水杨酸（SSA)，lmM EDTA)置于EP管中，漩涡混匀，经短暂离心使液体集中于管底； 35°C，避光孵育5分钟；向EP管中加入30μ1的Solution II[lmg/ml ABD-F(4-(氨磺 酰）-7-氟-2, 1，3-苯并恶二唑）和100 μ 1的硼酸盐缓冲液（0. 1M硼酸盐，ImM EDTA， pH9. 3)]，漩涡混匀，经短暂离心使液体集中于管底；35°C，避光孵育10分钟；加入50μ 1的 2Μ HC1终止反应。
[0156] ③反应液经0. 2 μ m的滤膜过滤，进行HPLC分析。分析柱为YMC-Pack 0DS-A250 X 4. 6mm. D. S-5 μ m，30nm。固定相（A 相）为 0· 1M 乙酸缓冲液，ρΗ4· 0 ;流动相 B 为 100% 乙腈；分析条件为 0-15min，8% Β 相；16-20min，8% -90% Β 相，21-25min90% Β 相； 26-30min，90 % -8 % B相流速lml mirT1，如图2所示该方法可以利用紫外检测器很好的分离 GSH、γ -GC、Cys衍生化产物，保证GSH含量测定的准确性。最终获得含有高表达融合基因 GSH II-GSH I的工程菌W303-1B/G在摇瓶发酵水平上培养72h谷胱甘肽的产量为206. 7mg/ L，而对照菌株W303-1B谷胱甘肽产量为89mg/L。
[0157] 实施例5大肠杆菌ProB-Gsh B融合蛋白的表达和活性鉴定
[0158] 为了检测谷氨酸激酶（ProB)-谷胱甘肽合成酶（Gsh B)融合蛋白的催化活性， 首先构建大肠杆菌ProB-Gsh B融合蛋白表达载体，进行融合蛋白的诱导表达纯化，建立体 外的酶促催化反应体系，确定了 ProB的Thr 120突变为lie的突变体融合蛋白具有催化合 成谷胱甘肽的活性，具体的过程如下：
[0159] 1.大肠杆菌基因组DNA提取：参照天根生化（北京）有限公司的细菌基因组提取 试剂盒提取大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA，具体步骤如下 ：
[0160] (1)取细菌培养液l_5ml，lOOOOrpm离心lmin (分钟），去上清。
[0161] (2)向菌体沉淀中加入200 μ 1缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；加入4μ 1 RNase A (100mg/ml)溶液，振荡15sec (秒），室温放置5min。
[0162] (3)向管中加入20 μ 1 Proteinase K溶液，混匀。
[0163] (4)加入220μ 1缓冲液GB，振荡15sec，70°C放置10min，溶液变清亮，简短离心以 去除管盖内壁的水珠。
[0164] (5)力口 220 μ 1无水乙醇,充分振荡混勻15sec。
[0165] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0166] (7)向吸附柱CB3中加入500μ 1缓冲液⑶，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸 附柱CB3放入收集管中。
[0167] (8)向吸附柱CB3中加入600μ 1漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附 柱CB3放入收集管中。
[0168] (9)重复操作步骤（8)。
[0169] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0170] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，即获 得基因组DNA，-20°C保存备用。
[0171] 2.大肠杆菌ProB基因的克隆
[0172] 根据大肠杆菌BL21(DE3) γ-谷氨酸激酶基因（GenBank注册号为AM946981)的 序列设计合成8条引物（引物核苷酸序列见SEQ ID N0.81-88)，如表6所示。以基因 组 DNA 为模板，用引物 PR0B_1/PR0B_4 进行第一轮 PCR(95°C，5min ;95°C，50S，50°C，50S， 72°C，1. 5min，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用第一轮 PCR 产物为模板，分别用 引物 PR0B_2/PR0B_3 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，45S，5(TC，50S，72t：，lmin， 30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)，扩增得到长度为1144bp的DNA片段，利用多功能DNA 纯化试剂盒回收DNA片段，然后利用限制性内切酶Nde I和Hind III酶切DNA片段，然后 亚克隆到用相同内切酶处理的载体pET-28a中，即获得质粒pET28-Pr〇B，测序验证与预期 的结果一致。为获得Thrl20突变为lie的突变体，以质粒pET28-Pr 〇B为模板，利用引物 PR0B_5/PR0B_6 和 PR0B_7/PR0B_8 进行 PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，45S，50°C，50S，72°C， 30S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度分别为 143bp、279bp 的 DNA 片段， 利用多功能DNA纯化回收试剂盒回收DNA片段，然后各取2μ 1 (分别约为50ng和lOOng)与 含Taq DNA聚合酶的ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组成20μ 1的反应体系，进 行DNA片段的补平反应（95°C，2min ;95°C，40S，45°C，50S，72°C，40S，7cycles ;72°C，lOmin ; 4°C，lOmin)。再利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物PR0B_5/PR0B_8进行PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，40S，43°C，50S，72t：，40S，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)，得 到长度为400bp的DNA片段，利用限制性内切酶Sal I和Stu I酶切，置换质粒pET28-Pr〇B 中相应的DNA片段，获得SEQ ID NO. 89所示的ProB第120位苏氨酸突变为异亮氨酸的 突变体基因（T120I)，即得到质粒pET28-Pr〇B/T120I。该基因的合成过程中也可利用引物 Pr〇B_3通过PCR扩增在其编码的氨基酸序列C-端引入SEQ ID NO. 12所示的连接肽氨基酸 序列。
[0173] 表6扩增γ -谷氨酸激酶（ProB)基因的PCR反应引物
[0174] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') PROBJ GGCAACCGACGACAGTCCTGCT PROB2 GAATTCCATATGAGTGACAGCCAGACGCT ProB_3 GCGATCGAAGCTTGGATCCGCCC.CCACCGCCACCACGGGTAATCAT GTCAT ProB_4 TACGAGGCTTGCTTCGCGGCAA ProB_5 GGCAGAGTCGACTGATTCAACTGTGGGAACAACTGTTTTCGATTTA TGGCAT ProB_6 ATCGAGCAACGCACGCAGAATGTCGCGGGCGTTCAGGA ProB_7 CATTCTGCGTGCGTTGCTCGAT ProB_8 CCAGTTCCGAGGCCTGAAACGC
[0175] 3.野生型大肠杆菌Gsh B基因的克隆和融合基因 ProB/T120I-Gsh B的构建
[0176] 根据大肠杆菌BL21(DE3)谷胱甘肽合成酶（Gsh B)基因（GenBank注册号为 NP_417422)的序列设计合成4条引物（引物核苷酸序列见SEQIDN0.90-93)，如表7所示。 以基因组DNA为模板，用引物GSH2_E1/GSH2_E4进行第一轮PCR反应（95 °C，5min ;95 °C， 50S，50°C，50S，72°C，lmin，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用第一轮 PCR 产物为 模板，分别利用引物 GSH2_E2/GSH2_E3 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，45S，50°C， 50S，72°C，lmin，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度为 972bp 的 DNA 片段， 利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，利用限制性内切酶Bgl II和Xho I酶切DNA片 段，然后亚克隆到用内切酶BamH I和Xho I酶切处理的载体pET28-Pr〇B/T120I中，获得 SEQ ID NO. 94所示的编码大肠杆菌Gsh B基因，获得质粒pET28-ProB/T120I-Gsh B，测序 验证与预期的结果一致。
[0177] 表7扩增大肠杆菌谷胱甘肽合成酶（Gsh B)基因的PCR反应引物
[0178] 引物名称 碱基序列方向（5'-3") GSH2E1 ACGGAGAAGAATAATGATCAAGCTCG GSH2E2 TATCCAAGATCTATCAAGCTCGGCATCGTGAT GSH2E3 GATCTCCTCGAGTTACTGCTGCTGTAAACGTGC GSH2E4 GTCACTCAGAGTCTCAACGAGATCC
[0179] 4.大肠杆菌ProB/T120I-Gsh B融合蛋白的表达纯化 [0180] 融合蛋白的诱导表达：
[0181] 用CaCl2转化法将质粒pET28-ProB/T120I-Gsh B转化大肠杆菌BL21 (DE3)中，在 含有卡那霉素（50 μ g/ml)的LB固体培养基平板上培养过夜，挑取单克隆接种到含有卡那 霉素（50yg/ml)的30ml LB培养基中，在37°C、200rpm培养至006。。到1.0左右；按1%的接 种量转接到l〇〇ml含有卡那霉素和氨苄青霉素钠的LB培养基中，在37°C、200rpm继续培 养至〇D 6(l(l到0· 6左右，加入终浓度ImM IPTG诱导剂在16°C低温诱导表达18小时，8000rpm 离心lmin将收集菌体，弃培养基。
[0182] 融合蛋白质的纯化：
[0183] (1)样品处理：向收集菌体的30ml离心管中加入25ml裂解缓冲液（0. 2M PBS，ImM PMSF，pH8. 0)，用干净的玻璃棒将菌体搅匀，置于冰中，进行超声破碎，12, 000rpm4°C离心15 分钟，将上清转移至新的1. 5ml微量离心管中，16000rpm离心20分钟，将上清取出经0. 2um 的滤膜过滤，除去杂质，便可进行亲和层析纯化；
[0184] (2)镍亲和层析柱的处理：用5-10倍柱体积的双蒸水洗柱，再用5-10倍柱体积的 裂解缓冲液进行平衡，准备上样；
[0185] (3)将蛋白样品缓慢的贴壁加入到柱内，小心避免将镍胶悬起，影响结合效率，以 0. 5ml/min的流速放出上样流出液；
[0186] (4)咪唑梯度洗脱：分别以 5mM，10mM，15mM，20mM，50mM，100mM，300mM 的咪唑浓度 脱洗层析柱各l〇〇ml，收集各洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测（见图3)，结果表明纯化获得 的样品纯度较高，与预期的融合蛋白分子76kDa的相符合。
[0187] 5.大肠杆菌ProB/T120I-Gsh B融合蛋白的体外催化活性分析
[0188] 含有咪唑的洗脱样品用透析袋透析过夜，透析缓冲液为0. 2M PBS(pH8. 0)，利用 Bio-Rad蛋白定量试剂盒（Cat No. 500-0006)进行蛋白定量，取100μ1(约500yg)与 100 μ 1的氨基酸和ATP混合物混匀[氨基酸和ATP的混合体系配置：ATP (60mM)，谷氨酸 (60mM)，甘氨酸（60mM)，半胱氨酸（40mM)，PBS缓冲液（0. 2M PH = 8)]，37°C反应6小时。反 应结束后，将反应样品加热煮沸变性，12000rpm离心2min，经0. 2 μ m的滤膜过滤，进行HPLC 分析（HITACHI L-2000) oGRACE VYDAC蛋白多肽分析型C18柱（250_X4. 6_，5 μ m, 30nm)进 行梯度洗脱；紫外检测：210nm;流速：lml/min ;柱温：25°C，溶剂为固定相A(0.05% TFA，v/ v)，流动相B (乙腈ACN90 %，0. 05 % TFA (三氟乙酸），v/v)，色谱条件为2 % B相洗脱15min。 经HPLC分析结果如图4所示利用纯化的融合蛋白ProB/T120I-Gsh B建立的催化体系具有 催化合成GSH的活性。
[0189] 实施例6大肠杆菌突变型Pr〇Bm_Gsh Bm同源整合表达载体的构建
[0190] 由于大肠杆菌和酿酒酵母基因编码存在偏好性，差别很大，为实现大肠杆菌融合 基因 ProB/T120I-Gsh B酿酒酵母中的高表达，将这个融合基因全突变为适合酵母表达的编 码框。
[0191] 1.大肠杆菌Gsh B基因酵母偏好编码的优化
[0192] 根据大肠杆菌BL21(DE3)谷胱甘肽合成酶（Gsh B)基因（GenBank注册号为 NP_417422)序列为蓝本设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQIDN0.95-119)，如表8所 示，通过连续重叠 PCR方法来合成，具体方法如下，将整个DNA片段分成前后两个部分分别 合成：
[0193] Gsh B突变基因的5'-端DNA片段：首先采用引物GSHB1_7/GSHB1_8进行DNA 片段的补平反应（95°C，4min ;95°C，10S，45°C，30S，72°C，10S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin);然后利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物GSHB1_6/GSHB1_9进行第 一轮 PCR 扩增（95°C，4min ;95°C，30S，45°C，40S，72t：，15S，30cycles ;72°C，10min ;4°C， + °〇 );其扩增产物作为下一组引物GSHB1_5/GSHB1_10进行PCR扩增反应的模板，再进行 第二轮 PCR 扩增反应（95°C，5min ;95°C，30S，45°C，40S，72°C，20S，30cycles ;72°C，10min ; 4°C，lOmin);随后依次进行 PCR 扩增的引物为 GSHB1_4/GSHB1_11、GSHB1_3/GSHB1_12、 GSHB1_2/GSHB1_13 ;每延长一组引物的PCR扩增反应，其PCR反应的延伸时间增加5S，经过 5轮PCR扩增反应，扩增得到约508bp的DNA片段，命名为GSHB1_213。
[0194] Gsh B突变基因的3'-端DNA片段：首先采用引物GSHB2_6/GSHB2_7进行DNA 片段的补平反应（95°C，4min ;95°C，10S，45°C，30S，72°C，10S，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin);然后利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物GSHB2_5/GSHB2_8进行第 一轮 PCR 扩增（95°C，4min ;95°C，30S，45°C，40S，72t：，15S，30cycles ;72°C，10min ;4°C， + °〇 );其扩增产物作为下一组引物GSHB2_4/GSHB2_9进行PCR扩增反应的模板，再进行 第二轮 PCR 扩增反应（95°C，5min ;95°C，30S，45°C，40S，72°C，20S，30cycles ;72°C，lOmin ; 4 °C，lOmin);随后依次进行 PCR 扩增的引物为 GSHB2_3/GSHB2_10、GSHB2_2/GSHB2_11、 GSHB2_1/GSHB2_12 ;每延长一组引物的PCR扩增反应，其PCR反应的延伸时间增加5S，经过 5轮PCR扩增反应，扩增得到约484bp的DNA片段，命名为GSHB2_112。
[0195] 全长基因的拼接：利用多功能DNA纯化回收试剂盒回收GSHB1_213和 GSHB2_112DNA片段，然后各取2μ1(约为100ng)与含Taq DNA聚合酶的ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂组成20μ 1的反应体系，进行DNA片段的补平反应（95°C， 2min ;95°C，40S，45°C，50S，72t：，lmin，7cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用补平反 应后的DNA片段产物为模板，再利用引物GSHB1_1/GSHB2_12进行PCR扩增（95°C，5min ; 95DC，40S，43DC，50S，72DC，lmin，30cycles ;72DC，lOmin ;4DC，lOmin)，得到长度为 977bp 的 DNA片段（见图5)，通过ΤΑ克隆到载体EZ-T上进行测序验证，得到质粒EZ-Gsh Bm ;结果获 得SEQ ID NO. 5所示的大肠杆菌谷胱甘肽合成酶基因突变体（Gsh Bm)，其编码的氨基酸序 列是 SEQ ID NO. 6。
[0196] 表8大肠杆菌谷胱甘肽合成（Gsh B)酵母偏好编码基因的PCR反应引物
[0197] 引物名称 減基序列方向（S'-S') GSHB1J GATATCAAGATCTATGATTAAATTGGG GSHB1-2 AAGATCTATGATTAAATTGGGTATTGTTATGGACCCAATCGCTA ATATTAATATTAAGA GSHB1_3 CTAATATTAATATTAAGAAAGATTCTTCTTTTGCTATGTTGTTA GAAGCACAAAGAAGA GSHB1_4 TTAGAAGCACAAAGAAGAGGTTATGAATTGCATTATATGGAAA TGGGTGATTTGTATTT GSHB1_5 AATGGGTGATTTGTATTTGATTAATGGTGAAGCTAGAGCACAT ACTAGAACTTTGAATG GSHB1_6 ATACTAGAACTTTGAATGTTAAACAAAATTATGAAGAGTGGTT TTCTTTCGTTGGTGAA GSHB1_7 TTTTCTTTCGTTGGTGAACAAGATTTGCCATTGGCTGATTTAGA TGTTATTTTGATGAG GSHB1_8 AGTAGCATAAATAAATTCAGTATCAAAAGGTGGATCTTTTCTC ATCAAAATAACATCTA GSHB1_9 ACAATCAAAGTACCTTTCTCTTCAGCTCTTTCCAAAATATAAGT AGCATAAATAAATTC GSHB1J0 ACAATTTTTCATTACAATCTCTCAAAGATTGTGGTTTATTAACA ATCAAAGTACCTTTC：
[0198] GSHB1_11 ACCAATGTTTCTGGAGTTAAATCAGAAAACCAAGCAGTAAACA ATTTTTCATTACAATC GSHB1-12 GTTTTTCCCAAAAAGCCTTTAATTGAGCTTTATTTCTAGTAACC AATGTTTCTGGAGTT GSHB1_13 TCCACCCATACCATCCAATGGTTTCAAAATTATATCAGAATGTT TTTCCCAAAAAGCCT GSHB2_1 CCATTGGATGGTATGGGTGGAGCTTCAATTTTTAGAGTTAAAG AAGGTGATCCAAATTT GSHB2_2 AGAAGGTGATCCAAATTTGGGTGTTATTGCTGAAACTTTGACT GAACATGGTACTAGAT GSHB2_3 CTGAACATGGTACTAGATATTGTATGGCTCAAAATTArTTGCCA GCTATTAAAGATGGT GSHB2 4 CCAGCTATTAAAGATGGTGATAAAAGAGTGTTGGTTGTAGATG GTGAACCAGTTCCATA GSHB2_5 TGGTGAACCAGTTCCATATTGTTTGGCTAGAATACCACAAGGT GGAGAAACTAGAGGTA GSHE32_6 GTGGAGAAACTAGAGGTAATTTGGCTGCCGGTGGTAGAGGTGA ACCAAGACCATTGACT GSHB2 7 AAAGTTGGACCAATTTGTCTAGCAATTTTCCAATCAGATTCAGT CAATGGTCTTGGTTC GSHB2_8 TATAATATCCAAACCAACAAAAATCAAACCTTTTTCTTTCAAAG TTGGACCAATTTGTC GSHE32_9 CATGTTGGAGAAGTAACATTAATTTCAGTCAATCTATCACCTAT AATATCCAAACCAAC GSHB2J0 CAGTAATAGAAACTGGAAATTCTGCTTCAATTTCTCTAATACAT GTTGGAGAAGTAACA GSHB2J1 TTGCTGTTGTAATCTTGCTTCAATAGCATCCATTAACATTCCAG TAATAGAAACTGGAA GSHB2_12 GAATTCGGCTAGCTTATTGCTGTTGTAATCTTGCTTC
[0199] 2.大肠杆菌ProB突变体基因酵母偏好编码的优化
[0200] 根据大肠杆菌BL21 (DE3) γ -谷氨酸激酶（Ρι?Β)基因（GenBank注册号为 AM946981)序列为蓝本设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID N0. 120-147)，如表9所 示，通过连续重叠 PCR方法来合成，具体实验操作方法如下，将整个DNA片段分成两个片段 分别合成：
[0201] ProB突变基因的5'-端DNA片段：首先采用引物Ρι?Β1_5/Ρι?Β1_6进行DNA 片段的补平反应（95DC，4min ;95DC，10S，45DC，30S，72DC，10S，7cycles ;72DC，10min ;4DC， lOmin);然后利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物Ρι?Β1_4/Ρι?Β1_7进行进行 第一轮 PCR 扩增（95DC，4min ;95DC，30S，45DC，40S，72DC，15S，30cycles ;72DC，10min ;4DC， +…）；其扩增产物作为下一组引物ΡγοΒ1_3/Ρι?Β1_8进行PCR扩增反应的模板，再进行 第二轮 PCR 扩增反应（95DC，5min ;95DC，30S，45DC，40S，72DC，20S，30cycles ;72DC，10min ; 4DC，lOmin);随后依次进行 PCR 扩增的引物为 ProBl_2/ProBl_9、ProBl_l/ProBl_10 ;每延 长一组引物的PCR扩增反应，其PCR反应的延伸时间增加5S，经过4轮PCR扩增反应，扩增 得到约408bp的DNA片段；纯化回收DNA片段，然后通过ΤΑ克隆到载体EZ-T上进行测序 验证，得到质粒EZ-ProBl。
[0202] ProB突变基因的3 '-端DNA片段：首先采用引物ProB2_9/ProB2_10进行 DNA 片段的补平反应（95°C，4min ;95°C，10S，45°C，30S，72°C，10S，7cycles ;72°C，lOmin ; 4°C，lOmin);然后利用补平反应后的DNA片段产物为模板，利用引物Pr〇B2_8/Pr 〇B2_ll 进行进行第一轮 PCR 扩增（95 °C，4min ;95 °C，30S，45 °C，40S，72 °C，15S，30cycles ;72 °C， lOmin ;4°C，+ ^ );其扩增产物作为下一组引物ProB2_7/ProB2_12进行PCR扩增反应的 模板，再进行第二轮 PCR 扩增反应（95°C，5min ;95°C，30S，45°C，40S，72°C，20S，30cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin);随后依次进行 PCR 扩增的引物为 ProB2_6/ProB2_13、ProB2_5/ ProB2_14>ProB2_4/ProB2_15>ProB2_3/ProB2_16>ProB2_2/ProB2_17>ProB2_l/ProB2_18 ； 每延长一组引物的PCR扩增反应，其PCR反应的延伸时间增加5S，经过8轮PCR扩增反应，扩 增得到约735bp的DNA片段；纯化回收DNA片段，然后通过TA克隆到载体EZ-T上进行测序 验证，得到质粒EZ-Pr 〇B2。最后利用载体上内切酶位点Hind III和DNA片段3'-端的内 切酶位点Hpa I进行酶切质粒EZ-ProBl，纯化回收DNA片段，然后与经内切酶Hind III和 Stu I酶切处理的载体质粒EZ-Pr〇B2进行连接，转化大肠杆菌筛选获得阳性克隆EZ-Pr〇B m， 测序验证，即获得SEQ ID NO. 7所示的适合于酵母细胞表达的ProBm突变体，其编码的氨基 酸序列是SEQ ID N0.8。该基因的合成过程中也可利用引物Pr〇B2_18通过PCR扩增在其编 码的氨基酸序列C-端引入SEQ ID N0. 12所示的连接肽氨基酸序列，目的是增加与GSH Bm 形成融合蛋白后的柔性结构，保持融合蛋白能催化合成谷胱甘肽的酶活性。
[0203] 表9 γ -谷氨酸激酶（ProB)酵母偏好编码基因的PCR反应引物
[0204] 引物名称 碱基序列方向（5'D ProBl_l GGTATCCATATGTCAGACTCTCAGACTTTGGTGGTAAAATTAG GTACTTCAGTTTTAAC ProBl_2 AGGTACTTCAGTTTTAACAGGCGGATCAAGACGTTTGAACAGA GCTCATATCGTTGAAT ProBI_3 GAGCTCATATCGTTGAATTAGTTAGACAATGCGCTCAATTACA 丁 GCTGCCGGTCATAGG ProBl_4 CATGCTGCCGGTCATAGGATTGTTATTGTGACTTCTGGCGCAAT TGCAGCTGGAAGAGA ProBl_5 AATTGCAGCTGGAAGAGAACACTTGGGTTACCCAGAATTGCCA GCIACTATCGCCTCGA ProBl_6 TCiAATCAATCTTGATTGACCTACAGCTGCCAACAATTGTTTCGA GGCGATAGTAGCTGG ProBl-7 CGACATGAATGCCATAAATAGAAAACAACTGTTCCCACAATTG AATCAATCTTGATTGA ProBl_8 TTCTCTGTCTTCCATATCAGCTCTGGTCAACAACATTTGACCGA CATGAATGCCATAAA ProBI_9 TCTA AC AA AGCTCTC A A A ATATCTCT AGCGTTC A AG AACCTTTC TCTGTCTTCCATATC ProBl_10 TCCATGGTTAACGATATTGTTATCTAACAAAGC 下 CTCAA ProB2_l TCTAGAAGGCCTGTAATTAATGAAAACGATGCTGTTGCTACAG
[0205] CAGAAA 丁丁 AAGG 丁 CGG ProB2_2 AGCAGAAATTAAGGTCGGTGATAACGATAATTTGTCTGCTTTG GCTGCAATTTTGGCTG ProB2_3 TGGCTGCAATTTTGGCTGGTGCTGATAAATTATTGTTATTGACC GATCAAAAAGGTTTG ProB2_4 ACCGATCAAAAAGGTTTGTATACCGCTGATCCAAGATCAAATC CACAGGCAGAA丁丁 GAT ProB2_5 TCCACAGGCAGAATTGATTAAAGATGTTTACGGCATTGATGAC GCATTGAGAGCTATTG ProB2_6 ACGCATTGAGAGCTATTGCTGGTGAT丁 CTG 丁1TCAGGCTTAGGA ACTGGTGGCATGTCA ProB2_7 GGAACTGGTGGCATGTCAACTAAATTGCAGGCCGCTGACGTGG CTTGCCGTGCTGGTA ProB2_8 TGGCTTGCCGTGCTGGTATCGACACTATTATTGCCGCTGGTTCT AAGCCAGGTGTTATT ProB2_9 TCTAAGCCAGGTGTTATTGGTGATGTGATGGAAGGCA1T丁 CTGT TGGTACGTTGTTCCA ProB2_10 AAATCCATCTTTTTCTGTTTTCTAATGGAGTAGCCTGAGCATGG AACAACGTACCAACA ProB2J 〖 CTTCATCTACAGTGATTTCACCAGCAGGTGGAGCACCGAAAAT CCATCTTTTTCTGTTT ProB2_12 CAACAAAGATGAACCTCTTTCCAAAA 丁 AGCGGCAGTTGCACCT TCATCTACAGTGATTT ProB2_13 CCTCTTGAAAAATTACCAGTCACAGATTTAATACCTTTTGGCAA CAAAGATGAACC丁C丁 ProB2_14 CGATGTCTCTACCTTCCAAGTTACAAATTCTAATAACTTCACCT CTTGAAAAATTACCA ProB2_15 TCTCCTTAATGCATCAGAATTA 丁 ATCTTGAGACGCCATGAGCGA TGTCTCTACCTTCCA ProB2_16 CCCAAAATTGCATCAATTTCTTGAGAGTGATGTCCGGCAATTCT CCTTAATGCATCAGA ProB2_17 TCATGTCATCTCTATGAACAGCAACTGGGCCGTATTCATATCCC AAAATTGCATCAATT ProB2_18 GAATTCATGGATCCGCCGCCACCGCCACCTCTGGTAATCATGTC _ATCTCTATGAAC_
[0206] 3.突变型基因 PiOBm-Gsh Bm的酵母同源整合表达载体构建及酵母转化
[0207] 首先用限制性内切酶Bgl II和Nhe I酶切质粒EZ-Gsh Bm，纯化回收编码大肠杆 菌Gsh Bm阅读框961bp的DNA片段，与相同酶切处理的载体TyR14-UG6/TrcK/P QAP_rc中，得 到质粒载体TyR14-UG6/TrcK/P &AP_rc/Gsh Bm。然后再利用内切酶Nde I和BamH I酶切质粒 EZ-Pix)Bm，纯化回收含有大肠杆菌Pix)Bm阅读框和编码连接肽的核苷酸1121bp的DNA片段 与经Nde I和Bgl II酶切处理的质粒载体TyRH-UGe/T^/P^pe/Gsh 8"1进行连接，转化大 肠杆菌筛选得到阳性克隆TyRH-UGe/T^/P^i/ProBm-Gsh Bm，即获得适合于酿酒酵母表达 的融合基因 ProBm-Gsh Bm突变体，二者之间融合了 SEQ ID NO. 12所示的连接肽，增强两个 不同催化活性的功能域ProBI^PGsh Bm的柔性结构，同时能使二者空间结构邻近，提高级联 催化反应的效率。
[0208] 酵母转化：采用LiAc转化法转化整合有酵母的融合基因 GSH II-GSH I工程菌 株W303-1B/G17#(G代表PeAP_s。-GSH II-GSH I-TrcK表达框），先利用内切酶Not I把质粒 IVRH-UGe/T^/P^i/ProBm-Gsh Bm酶切线性化，转化过程如下：
[0209] (1)挑单克隆接菌于25ml液体YH)培养基中，30°C，250rpm培养16-18h至0D6QQ约 为 0· 8-1. 0。
[0210] (2) 1500rpm离心5min收获细胞（1. 5ml EP管），750 μ 1灭菌水清洗后1500rpm离 心5min,弃上清。
[0211] (3)每管用 30μ 1, lOOmM LiAc 重悬，12000rpm 离心 15s，弃上清，50μ 1, lOOmM LiAc重悬即为感受态细胞。
[0212] (4) lml单链鲑鱼精载体DNA(SS carrier DNA)2mg/ml煮沸5min,迅速置于冰上冷 却。
[0213] (5)感受态细胞 12000rpm 离心 15s,弃 LiAc。·
[0214] (6)按顺序加入 240μ 1500g/L PEG(PEG3350) ;36μ 1 LiAc(lM) ;25μ 1 ssDNA ; 50 μ 1线性化质粒（10-20 μ g)，漩涡剧烈混匀lmin。
[0215] (7)30°C静置孵育30min，42°C水浴热击60min，颠倒混匀数次。
[0216] (8)离心弃上清，加入YPD培养基复壮2h，涂于含有100 μ g/ml G418的YPD筛选 平板，30°C培养3d。然后挑取单克隆到4mg/ml G418的YH)筛选平板上进行高拷贝整合的 阳性克隆复筛。
[0217] 4.整合突变型基因 Pr〇Bm_Gsh Bm的工程菌株筛选和代谢产物分析
[0218] 将生长在高浓度G418的YPD平板上的单克隆，利用YH)液体培养基进行培养，进 行筛选。利用酵母基因组DNA纯化试剂盒提取其基因组DNA，然后进行PCR鉴定，首先利用引 物 ProBl_l/GSHB2_10 进行第一轮 PCR 反应（95°C，5min ;95°C，50S，5(TC，lmin，72°C，2min， 30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，分别用引物ProBl_2/ GSHB2_9 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，50S，5(TC，lmin，72°C，2min，30cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，理论上能扩增得到长度为1956bp的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳分 析结果如图6,与预期的结果相符合，所筛选的12个克隆都是整合有融合基因 Pr〇Bm-Gsh Bm 的阳性克隆，工程菌株命名为W303-1B/GP(G代表PeAP_sc-GSH II-GSH I-TrcK表达框，P代表 Pgap-pc_ ProBm-Gsh Bm-TrcK 表达框）。
[0219] 挑取阳性克隆进行YH)液体培养，首先进行在摇瓶水平分析谷胱甘肽的产量：
[0220] ①挑选工程菌株，接种至含有30ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm过 夜培养；
[0221] ②取上述菌液0. 5ml转接到装有50ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm 过夜培养；
[0222] ③再将步骤②的菌液转接到装有100ml YH)培养基的500ml三角瓶中，控制初始 0D6(IQ = 0· 15,十层纱布塞密封，30°C，200rpm培养。
[0223] ④每隔24h取样，对工程菌株合成的谷胱甘肽进行定量分析，实验结果表明在摇 瓶发酵水平发酵培养72h含有高表达融合基因 GSH II-GSH I和ProBm-Gsh 工程菌 W303-1B/GP谷胱甘肽的产量为309. 46mg/L，说明ProBm-Gsh Bm高表达依然能促进谷胱甘肽 的合成。
[0224] 实施例7 γ -谷氨酰转肽酶基因敲除同源整合框的构建
[0225] 1. 谷氨酰转肽酶基因同源整合片段的克隆
[0226] 根据酿酒酵母Y -谷氨酰转肽酶基因（GenBank注册号为U17243)的序列设计合 成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID N0. 148-153)，如表10所示。以基因组DNA为模板， 用引物 GT_1/GT_6 进行第一轮 PCR 反应（95 °C，5min ;95 °C，50S，50 °C，50S，72 °C，2. 5min， 30cycles ;72 °C，lOmin ;4 °C，lOmin)。再利用第一轮PCR产物为模板，分别用引物GT_2/ GT_3 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，50S，5(TC，50S，72°C，lmin，30cycles ;72°C， lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度为SEQ ID NO. 154所示的1181bp的Y-谷氨酰转肽酶 基因5'-端DNA片段，利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后利用限制性内切酶 Κρη I和BamH I酶切DNA片段，然后亚克隆到用相同内切酶处理的载体EZ-T中，测序验证 得到，即获得质粒EZ-GT23。
[0227] 同样利用引物GT_1/GT_6的第一轮PCR产物为模板，利用GT_4/GT_5进行 Nested-PCR扩增（95°C，5min ;95°C，50S，5(TC，50S，72t：，30S，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C， lOmin)，扩增得到长度为SEQ ID NO. 155所示的Y-谷氨酰转肽酶基因3'-端478bp DNA 片段，利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后利用限制性内切酶BamH I和Sac I 酶切DNA片段，然后亚克隆到用相同内切酶处理的载体EZ-GT23中，测序验证得到，即获得 质粒 EZ-GT2345。
[0228] 表10 谷氨酰基因的PCR反应引物
[0229] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') GT_1. GACACTTGCGGAAATCTAGTGTTC GT_2 AATGCGGTACCGCGGCCGCCTGTACTCAGCGGCTGTGCCTGTT G GT-3 AAGCTTAGCTGGGATCCTCTAGAATACAAACGACCAATCTTCC TTC GT_4 AGAGGATCCCAGCTAAGCTTACTAGTGTCGACTCGCGAATCAA TAACCCGCATGGAAC GT_5 AAGCTGGAGCTCGCGGCCGCAGCTTTCCAGTTCTATGCGG GT_6 GAGAGTGCTTAGTACGGCTTTACC
[0230] 2.筛选标记Trpl的克隆和同源整合载体的构建
[0231] 根据宿主细胞W303-1B的基因型，选取筛选标记Trpl基因作为谷氨酰转肽酶 基因敲除的筛选标记，设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID NO. 156-157)，如表11所 示，利用引物Trpl_l/Trpl_2和含有该筛选标记的质粒为pGBKT7模板进行PCR扩增获得如 SEQ ID NO. 158所示的1195bp DNA片段。利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后用 内切酶BamH I和Sal I酶切DNA片段，然后亚克隆到用相同内切酶处理的载体EZ-GT2345 中，得到敲除谷氨酰转肽酶基因的同源双交换整合框，测序验证得到如SEQ ID NO. 13 所示的DNA序列结构，即获得质粒EZ-GT2345-Trp 1。
[0232] 表11筛选标记Trpl基因的PCR反应引物
[0233] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') Trpl」 ACCTCTGGGATCCCCAGCTAAGCTT'ATCTCGAGACACATGCAG CTCCCGGAGA Trpl_2 TCATCGATGTCGACGATCGGCAAGTGCACAAACA
[0234] 实施例8 Y -谷氨酰转肽酶基因敲除和代谢产物分析
[0235] 采用LiAc转化法转化整合了融合基因 GSH II-GSH I工程菌株W303-1B/G(G代表 PeAP_s。-GSH II-GSH I-TrcK 表达框）和整合了融合基因 GSH II-GSH KProB^-Gsh 工程菌 株 W303-1B/GP(G 代表 PeAP_s。-GSH II-GSH I-TrcK 表达框，Ρ 代表 P^m-ProB^-Gsh 8111-1'1?表 达框）。
[0236] 先利用内切酶Not I把质粒EZ-GT2345_Trpl酶切线性化，转化过程如下：
[0237] ⑴挑单克隆接菌于25ml液体YH)培养基中，30°C，250rpm培养16-18h至0D_约 为 0· 8-1. 0。
[0238] ⑵1500rpm离心5min收获细胞（1. 5ml EP管），750 μ 1灭菌水清洗后1500rpm离 心5min,弃上清。
[0239] ⑶每管用 30μ 1, lOOmM LiAc 重悬，12000rpm 离心 15s，弃上清，50μ 1, lOOmM LiAc 重悬即为感受态细胞。
[0240] (4) lml SS carrier DNA2mg/ml 煮沸 5min，迅速置于冰上冷却。
[0241] (5)感受态细胞 12000rpm 离心 15s，弃 LiAc。.
[0242] (6)按顺序加入 240 μ 1500g/L PEG(PEG3350) ;36 μ 1 LiAc (1M) ;25 μ 1 ssDNA ; 50 μ 1线性化质粒（10-20 μ g)，漩涡剧烈混匀lmin。
[0243] (7) 30°C静置孵育30min，42°C水浴热击60min，颠倒混匀数次。离心弃上清，加入 YH)培养基复壮2h。
[0244] (8)离心去上清，然后用SC Trp^营养缺陷型培养基漂洗2次，再用SC Trp^营养缺 陷型培养基重悬，涂于SC Trp^营养缺陷型固体培养基筛选平板上，30°C培养3d。然后挑取 单克隆培养，利用酵母基因组DNA提取试剂盒纯化其基因组DNA，利用PCR方法进行敲除菌 株的鉴定。
[0245] (9)利用谷氨酰转肽酶基因同源区设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID N0. 159-162)，如表 12 所示，利用引物 GT_T1/GT_T4 进行第一轮扩增（95°C，5min ;95°C， 50S，5(TC，50S，72°C，1. 5min，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)。再利用第一轮 PCR 产物 为模板，分别用引物 GT_T2/GT_T3 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，50S，50°C，50S， 72°C，lmin，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度为 1315bp 的 DNA 片段，而对 照菌株仅能扩增出692bp的DNA片段，结果如图7所示两种工程菌株均获得γ -谷氨酰转 肽酶基因的敲除 W303-1B/G/Gr 和 W303-lB/GP/Gr。
[0246] 挑取阳性克隆进行YH)液体培养，首先进行在摇瓶水平分析谷胱甘肽的产量分 析：
[0247] ①挑选工程菌株，接种至含有30ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm过 夜培养；
[0248] ②取上述菌液0. 5ml转接到装有50ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm 过夜培养；
[0249] ③再将步骤②的菌液转接到装有100ml YH)培养基的500ml三角瓶中，控制初始 0D6(IQ = 0· 15,十层纱布塞密封，30°C，200rpm培养。
[0250] ④每隔24h取样，对工程菌株合成的谷胱甘肽进行定量分析，实验表明在摇瓶发 酵水平发酵培养72h敲除γ -谷氨酰转肽酶基因工程菌W303-1B/G/GT-和W303-1B/GP/ Gr谷胱甘肽的产量分别为486. 7mg/L和728. 5mg/L，说明失活γ -谷氨酰转肽酶基因能较 大幅度地促进谷胱甘肽的合成。
[0251] 表12 Y -谷氨酰转肽酶基因敲除的PCR鉴定反应引物
[0252] 引物名称 減基序列方向（) GT T1 GAGGTAGCGGCCAAGTTGATTGGCG GT_T2 GGCGAAGCACTCGGTGCCACTTTAG
[0253] GT_T3 CTGAAGTGGGCAGTTCCATGCGGG GT_T4 GAACCGAACAACAAGTTGATGGTGG
[0254] 实施例9肌醇-3-磷酸合酶（ΙΝ0)基因敲除同源整合框的构建
[0255] 1. ΙΝ0同源整合片段的克隆
[0256] 根据酿酒酵母肌醇-3-磷酸合酶基因（GenBank注册号为NC_001142)的序列设 计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID N0. 163-168)，如表13所示。以基因组DNA为模 板，用引物 IN0_1/IN0_6 进行第一轮 PCR(95°C，5min ;95°C，50S，50°C，50S，72°C，2. 5min， 30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)。再利用第一轮PCR产物为模板，分别用引物IN0_2/ IN0_3 进行 Nested-PCR 扩增（95 °C，5min ;95 °C，50S，50 °C，50S，72 °C，lmin，30cycles ; 72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度为如SEQ ID NO. 169所示的891bp的肌醇-3-磷酸 合酶基因5'-端DNA片段，利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后利用限制性内 切酶Κρη I和BamH I酶切DNA片段，然后亚克隆到用相同内切酶处理的载体EZ-T中，测序 验证得到，即获得质粒EZ-IN023。
[0257] 同样利用引物IN0_1/IN0_6的第一轮PCR产物为模板，利用IN0_4/IN0_5进行 Nested-PCR 扩增（95 °C，5min ;95 °C，50S，50 °C，50S，72 °C，lmin，30cycles ;72 °C，lOmin ; 4°C，10min)，扩增得到长度为如SEQ ID NO. 170所示的肌醇-3-磷酸合酶基因3'-端834bp DNA片段，利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后利用限制性内切酶BamH I和Sac I酶切DNA片段，然后亚克隆到用相同内切酶处理的载体EZ-IN023中，测序验证得到，即获 得质粒 EZ-IN02345。
[0258] 表13肌醇-3-磷酸合酶基因的PCR反应引物
[0259] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') INOJ TACAGCACTTTCTCGCATCTACCTC IN02 AATGCGGTACCGCGGCCGCGACGAAGTGACAAAGAGGCAA IN 03 AAGCTTAGCTGGGATCCTCTAGAGCTGGCTG IN 04 ACTAGAGGATCCCAGCTAAGCTTACTAGTGTCGACTCGCGAGA TCTGCGTTATTGATGTC IN 05 AAGCTGGAGCTCGCGGCCGCGTTCCGGGGTTGGATGCGGAATC IN 06 CGTTCCTTTTGTTCTTCACGTCC
[0260] 2.筛选标记Ade2的克隆和同源整合载体的构建
[0261] 根据宿主细胞W303-1B的基因型，选取筛选标记Ade2基因作为肌醇-3-磷酸合 酶基因敲除的筛选标记，设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID NO. 171-174)，如表14 所示，以酵母S288C基因组为模板，利用引物Ade2_l/Ade2_4进行第一轮PCR(95°C，5min ; 95°C，50S，5(TC，50S，72t：，2· 5min，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)。再利用第一轮 PCR 产物为模板，用引物 Ade2_2/Ade2_3 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，50S，50°C， 50S，72°C，2. 5min，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度为 SEQ ID NO. 175 所 示的2295bp DNA片段。利用多功能DNA纯化试剂盒回收DNA片段，然后用内切酶BamH I 和Sal I酶切DNA片段，然后亚克隆到用相同内切酶处理的载体EZ-IN02345中，得到敲除 肌醇-3-磷酸合酶基因的同源双交换整合框，测序验证得到SEQ ID NO. 14所示的DNA序列 结构，即获得质粒EZ-IN02345-Ade2。
[0262] 表14筛选标记Ade2基因的PCR反应引物
[0263] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') Adc2_l GGATTCATGCTTATGGGTTAG Adc2_2 ACCTCTGGGATCCCCAGCTAAGCTTATCTCGAGGATGCGGAAT TGACTTTTTCTTG Adc2_3 TCATCGATGTCGACGTGATCTTATGTATGAAATTCTTAA Adc2_4 TTGCTTCTTGTTACTCGATATGTATGTATG
[0264] 实施例10肌醇-3-磷酸合酶基因敲除和代谢产物分析
[0265] 采用LiAc转化法转化谷氨酰转肽酶基因敲除工程菌株W303_1B/G/GT_和 W303-1B/GP/GT-，先利用内切酶Not I把质粒EZ-IN02345-Ade2线性化处理，转化过程如 下：
[0266] ⑴挑单克隆接菌于25ml液体YH)培养基中，30°C，250rpm培养16-18h至0D_约 为 0· 8-1. 0。
[0267] ⑵1500rpm离心5min收获细胞（1. 5ml EP管），750 μ 1灭菌水清洗后1500rpm离 心5min,弃上清。
[0268] ⑶每管用 30μ 1，lOOmM LiAc 重悬，12000rpm 离心 15s，弃上清，50μ 1，lOOmM LiAc 重悬即为感受态细胞。
[0269] (4) lml SS carrier DNA2mg/ml 煮沸 5min，迅速置于冰上冷却。
[0270] (5)感受态细胞 12000rpm 离心 15s，弃 LiAc。.
[0271] (6)按顺序加入 240μ 1500g/L PEG(PEG3350) ;36μ 1 LiAc(lM) ;25μ 1 ssDNA ; 50 μ 1线性化质粒（10-20 μ g)，漩涡剧烈混匀lmin。
[0272] (7) 30°C静置孵育30min，42°C水浴热击60min，颠倒混匀数次。离心弃上清，加入 YH)培养基复壮2h。
[0273] (8)离心去上清，然后用SC Trp_、八如_营养缺陷型培养基漂洗2次，再用SC TrpAde营养缺陷型培养基重悬，涂于SC TrpAde营养缺陷型固体培养基筛选平板上， 30°C培养3d。然后挑取单克隆培养，利用酵母基因组DNA提取试剂盒纯化其基因组DNA，利 用PCR方法进行敲除菌株的鉴定。
[0274] (9)利用肌醇-3-磷酸合酶基因同源区设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID NO. 176-179)，如表 15 所示，利用引物 IN0_T1/IN0_T4 进行第一轮扩增（95°C，5min ;95°C， 50S，5(TC，50S，72°C，2. 5min，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)。再利用第一轮 PCR 产物 为模板，分别用引物 IN0_T2/IN0_T3 进行 Nested-PCR 扩增（95°C，5min ;95°C，50S，50°C， 50S，72°C，2. 5min，30cycles ;72°C，10min ;4°C，10min)，扩增得到长度为 2412bp 的 DNA 片 段，而对照菌株仅能扩增出565bp的DNA片段，结果如图8所示获得肌醇-3-磷酸合酶 基因敲除的两种工程菌株W303-lB/G/GrincT和W303-lB/GP/GrincT菌种保藏号为CGMCC NO. 8933)。
[0275] 挑取阳性克隆进行YH)液体培养，首先进行在摇瓶水平分析谷胱甘肽的产量：
[0276] ①挑选工程菌株，接种至含有30ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm过 夜培养；
[0277] ②取上述菌液0. 5ml转接到装有50ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm 过夜培养；
[0278] ③再将步骤②的菌液转接到装有100ml YH)培养基的500ml三角瓶中，控制初始 0D6(IQ = 0· 15,十层纱布塞密封，30°C，200rpm培养。
[0279] ④每隔24h取样，对工程菌株合成的谷胱甘肽进行定量分析，实验结果表明在摇 瓶发酵水平培养72h敲除肌醇-3-磷酸合酶基因工程菌W303-1B/G/Grin 〇_和W303-1B/GP/ Grinf谷胱甘肽的总产量分别为655. 17mg/L和980. 65mg/L，而细胞外分泌谷胱甘肽的量 占15%，说明失活肌醇-3-磷酸合酶基因能改变细胞膜结构而促进谷胱甘肽向细胞外的分 泌，从而进一步提高谷胱甘肽的产量。
[0280] 表15肌醇-3-磷酸合酶基因敲除的PCR鉴定反应引物
[0281] 引物名称 碱基序列方向（S'-S') IN0_T1 GGATGCAATGGAGACCGGTTTAATA IN0_T2 GTTTGTCCCGACTTGAGATCGTCTC IN0_T3 GCCCAAACGACTTTGTCGTCTCTGG IN0_T4 CTACCTTGAAACTGGGTATCGATGC
[0282] 实施例11整合高表达酵母Y -谷氨酸激酶（PioI)和谷胱甘肽合成酶（Gsh Bm)融 合蛋白的工程菌构建和代谢产物分析
[0283] 含Prol-Gsh 合基因的同源整合载体构建：根据酿酒酵母谷氨酸激 酶基因（GenBank注册号为M85293)的序列设计合成引物（引物核苷酸序列见SEQ ID NO. 180-183)，如表16所示。以基因组DNA为模板，用引物Prol_l/Prol_4进行第一轮 PCR(95 °C,5min ；95 °C, 50S, 50 °C, 50S, 72 °C, 1. 5min, 30cycles ；72〇C, lOmin ；4°C, lOmin) 〇 再利用第一轮PCR产物为模板，分别用引物Prol_2/Prol_3进行Nested-PCR扩增（95°C， 5min ;95°C，50S，50°C，50S，72°C，lmin，30cycles ;72°C，lOmin ;4°C，lOmin)，扩增得到长度 为如SEQ ID NO. 9所示的含有1284bp编码框的DNA片段，S卩γ -谷氨酸激酶基因 Prol，其 编码的氨基酸残基序列是SEQ ID NO. 10。纯化回收DNA片段用Nde I和BamH I酶切，然后 与经Nde I和Bgl II酶切处理的质粒载体TyRH-UGe/Tpa/P^i/Gsh Bm连接，转化大肠杆 菌筛选得到阳性克隆TyRH-UGe/T^/P^i/Prol-Gsh Bm，即获得适合于酿酒酵母表达的融 合基因 Prol-Gsh Bm，二者之间融合了 SEQ ID N0. 12所示的连接肽，增强两个不同催化活性 的功能域Prol和Gsh Bm的柔性结构，同时能使二者空间结构邻近，提高级联催化反应的效 率。
[0284] 表16酵母γ -谷氨酸激酶（Prol)基因 PCR反应引物
[0285] 引物名称 碱基序列方向（5'-3') Pro IJ GGTC ATTTTATC AGCT ACTGTA ATAT AG Pro 12 AA AGG ATCC AT ATG A AGG ATGCTA ATG AG AGTAAATC Prol_3 GAATT'CATGGATCCGCCGCCACCGCCACCACGAGGTGGGAATG CCAAATTTTC Pro 14 AAGAAACAGCTGCTCTGCACAATTCTTC
[0286] 酵母转化：采用LiAc转化法转化整合有酵母的融合基因 GSH II-GSH I且同时敲 除了 Y -谷氨酰转肽酶和肌醇-3-磷酸合酶基因的工程菌株W303-1B/G/Grinfl# (G代表 PeAP_s。-GSH II-GSH I-TrcK表达框，Gr表示γ-谷氨酰转肽酶基因失活，Inf表示肌醇-3-磷 酸合酶基因失活），先利用内切酶Not I把质粒TyRH-UGe/Tpa/P^i/Prol-Gsh Bm酶切线 性化，转化过程如下：
[0287] ⑴挑单克隆接菌于25ml液体YH)培养基中，30°C，250rpm培养16-18h至0D_约 为 0· 8-1. 0。
[0288] ⑵1500rpm离心5min收获细胞（1. 5ml EP管），750 μ 1灭菌水清洗后1500rpm离 心5min,弃上清。
[0289] ⑶每管用 30μ 1, lOOmM LiAc 重悬，12000rpm 离心 15s，弃上清，50μ 1, lOOmM LiAc 重悬即为感受态细胞。
[0290] (4) lml SS carrier DNA2mg/ml 煮沸 5min，迅速置于冰上冷却。
[0291] (5)感受态细胞 12000rpm 离心 15s，弃 LiAc。.
[0292] (6)按顺序加入 240μ 1500g/L PEG(PEG3350) ;36μ 1 LiAc(lM) ;25μ 1 ssDNA ; 50 μ 1线性化质粒（10-20 μ g)，漩涡剧烈混匀lmin。
[0293] (7) 30°C静置孵育30min，42°C水浴热击60min，颠倒混匀数次。
[0294] (8)离心弃上清，加入YTO培养基复壮2h，涂于含有100 μ g/ml G418的YH)筛选平 板，30°C培养3d。然后挑取单克隆到4mg/ml G418的YH)筛选平板上进行高拷贝整合的阳 性克隆复筛。
[0295] 阳性克隆筛选：在G418的YPD平板上挑取阳性克隆，利用YH)液体培养基进行培 养，利用酵母基因组DNA提取试剂盒纯化G418抗性的转化子基因组DNA，利用引物Prol_2/ GSHB2_12直接进行PCR反应鉴定敲除菌株，结果如图9所示阴性对照没有扩增反应，而 获得的阳性克隆W303-lB/GPlGrin 〇_l#(Pl代表PeAP_rc/Pr〇l-Gsh Bm，菌种保藏号为CGMCC NO. 8932)能扩增出2283bp的DNA片段，与对照质粒结果一致。
[0296] 谷胱甘肽产量分析：挑取阳性克隆进行YH)液体培养，首先进行在摇瓶水平分析 谷胱甘肽的产量：
[0297] ①挑选工程菌株，接种至含有30ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm过 夜培养；
[0298] ②取上述菌液0. 5ml转接到装有50ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm 过夜培养；
[0299] ③再将步骤②的菌液转接到装有100ml YH)培养基的500ml三角瓶中，控制初始 0D6(IQ = 0· 15,十层纱布塞密封，30°C，200rpm培养。
[0300] ④每隔24h取样，对工程菌株合成的谷胱甘肽进行定量分析，实验结果表明在摇 瓶发酵水平培养72h工程菌W303-lB/GPl/Grin〇_谷胱甘肽的总产量分别为1003. 45mg/L， 而细胞外分泌谷胱甘肽的比率没有改变，说明融合蛋白Prol-Gsh Bm的表达和催化活性与 融合蛋白ProB-Gsh Bm的催化能力相似。
[0301] 实施例12氨基酸前体添加对积累谷胱甘肽的影响
[0302] (1)挑取 YPD 平板上不同阶段的工程菌 W303-lB/G、W303-lB/GP、W303-lB/GP/Gr、 W303-lB/GP/Grino'W303-lB/GPl/GrincT 和对照 W303B 单菌落接种至装有 30ml YPD 培养 基的250ml三角瓶中，30°C，200rpm过夜培养；
[0303] (2)取上述菌液0.5ml转接到装有50ml YH)培养基的250ml三角瓶中，30°C， 200rpm过夜培养；
[0304] (3)再将步骤⑵的菌液转接到装有100ml YPD培养基的500ml三角瓶中，控制初 始0D6QQ = 0· 15,纱布塞密封，30°C，200rpm培养；
[0305] (4)培养48h后，实验组添加10ml50mM的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的混合液，使 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的终浓度分别为5mM，对照组则添加10ml的灭菌ddH 20。
[0306] (5)培养72h取样，测实验组和对照组中菌体生物量和胞内谷胱甘肽浓度。
[0307] 与对照组相比，实验组的胞内GSH产量明显提高，说明氨基酸前体的添加能够明 显地提高工程菌合成谷胱甘肽的能力；但不同菌株提高的比率不同，没有高表达谷氨 酸激酶的对照及工程菌株如W303-1B/G添加氨基酸的转化率为23%，而高表达γ-谷氨酸 激酶的工程菌株添加氨基酸的转化率提高75-80% (表17)。因此，通过氨基酸添加实验结 果表明这些工程菌株可以作为进一步优化工艺生物合成制备谷胱甘肽的菌株。
[0308] 表17不同工程菌株在摇瓶发酵水平氨基酸添加对GSH产量的影响
[0309]
【权利要求】
1. 一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括： i) 在宿主菌细胞内转入编码谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融 合蛋白的基因，并使其高表达； ii) 在宿主菌细胞内转入编码谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的 基因，并使其商表达； iii) 敲除宿主菌细胞的谷氨酰转肽酶基因； iv) 敲除宿主菌细胞的肌醇-3-磷酸合酶基因； 所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基因工 程菌； 所述i)和ii)中连接肽由6-34个氨基酸残基组成，其通式为：G-X-G-Y-G-Z，其中G为 甘氨酸，X、Y、Z分别为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸组成的1?10个氨 基酸残基。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述：0、：[：0、：[：[：0、：^)中的宿主菌为 酿酒酵母。
3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述编码谷氨酰半胱氨酸合成 酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和Υ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合 蛋白的基因由组成型启动子和/或诱导型启动子启动表达，所述组成型启动子为GAP、PGK、 ADH1、TEF、CYC1、TPI 中任一种，所述诱导型启动子为 Gall、Gal2、Gal3、Gal5、Gal7、GallO、 CUP1、MET25 中任一种。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成 酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和Y-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合 蛋白的基因由组成型启动子GAP启动表达。
5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述编码谷氨酰半胱氨酸合成 酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和Y-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合 蛋白的基因通过整合型方式高表达。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述整合型方式高表达通过使用酵母 高拷贝的整合位点S序列或λ DNA实现。
7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述谷氨酰半胱氨酸合成酶具有 SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶由 SEQID NO. 1所示的核苷酸序列编码。
9. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID NO. 4 或SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。
10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶SEQ ID NO. 4所 示的氨基酸序列由SEQ ID NO. 3的核苷酸序列编码。
11. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶SEQ ID NO. 6所 示的氨基酸序列由SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列编码。
12. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述谷氨酸激酶具有SEQ ID NO. 8 或SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列。
13. 如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述γ-谷氨酸激酶SEQ ID N0.8所 示的氨基酸序列由SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列编码。
14. 如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述γ-谷氨酸激酶SEQ ID NO. 10 所示的氨基酸序列由SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列编码。
15. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述连接肽具有SEQ ID NO. 12所示的 氨基酸序列。
16. 如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述连接肽由SEQ ID NO. 11所示的 核苷酸序列编码。
17. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述谷氨酰转肽酶基因通过基因 同源重组进行敲除。
18. 如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述基因同源重组使用具有SEQ ID NO. 13所示DNA序列的同源双交换整合框。
19. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肌醇-3-磷酸合酶基因通过基因 同源重组进行敲除。
20. 如权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述基因同源重组使用具有SEQ ID NO. 14所示DNA序列的同源双交换整合框。
21. 权利要求1-20任一项所述的制备方法制备的用于合成谷胱甘肽的基因工程菌。
22. 如权利要求21所述基因工程菌，其保藏编号为CGMCC NO. 8932。
23. 如权利要求21所述基因工程菌，其保藏编号为CGMCC NO. 8933。
【文档编号】C12R1/865GK104059936SQ201410183018
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王伟, 唐星, 唐亮, 王玮玮, 杨燕, 周文龙, 朱义波 申请人:唐星