专利名称：生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵合成谷胱甘肽领域，特别涉及一种生产谷胱甘肽的 毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒。背暈玟术谷胱甘肽(GSH)以其多方面的生理功能而广泛涉及酶学、转运、药理、 毒理、治疗、内分泌、微生物学及农业等研究领域，特别是在医药、食品行 业对其需求量大。从上世纪80年代开始至今，发酵法一直是工业化生产谷 胱甘肽的主要方法。目前生物发酵合成谷胱甘肽是以啤酒酵母(&cc/wraw^" "wv^^)的发酵为主。研究表明，谷胱甘肽的生物合成包括由Y-谷氨酰半胱氨酸合成 酶(GSHI ， EC6.3.2.2)与谷胱甘肽合成酶(GSHII, EC6.3.2.3)组成的谷 胱甘肽合成酶系在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的序贯 反应合成，此为基因工程改造谷胱甘肽产生菌提供了依据。例如EP0300168 公布将谷胱甘肽合成过程的两个酶GSH I和GSHII的基因克隆至啤酒酵母 基因组可提高酵母合成谷胱甘肽的能力；JP8070884披露通过将某一耐过氧 化物啤酒酵母的抗氧化基因克隆并导入啤酒酵母SHY-2可使谷胱甘肽的产 量提高2.5倍；JP2004173503公布将汉森多型酵母的GSH I基因重组至表达 载体并转化谷胱甘肽合成缺陷菌生产谷胱甘肽；US20050239164A1公布结合 重组技术和传统诱变方法获得突变基因明确的高表达GSH I及GSHII的亮 氨酸缺陷型啤酒酵母在含肌醇的培养基及促进产量的培养条件下生产分泌 型谷胱甘肽的方法；CN1699552公开了一种啤酒酵母工程菌及其构建方法。该工程菌将经过改造的GSH I基因导入酿酒酵母YSF-31中，得到的高谷胱 甘肽低双乙酰含量菌株，可相对縮短发酵周期且在该专利发明人另文发表的 文章中(Xiuying Fan et al., Biotechnology letters 26: 415-417，2004)，应用此菌 株发酵后所得谷胱甘肽含量可达到13.1mg/g干细胞重量。但是在啤酒酵母 发酵过程中，所产生的乙醇会对啤酒酵母的生长产生抑制作用而导致啤酒酵 母很难高密度培养，即啤酒酵母不能以极高密度生长，且发酵周期长降低了 发酵质量，增加了发酵成本。发明内容本发明要解决的技术问题即是克服上述现有技术缺陷，提供一种可以高 密度培养、高产GSH、降低发酵成本的谷胱甘肽产生菌，具体来说，是一种 生产谷胱甘肽的毕赤酵母(i^^'a户wtoni)基因工程菌，以及用于构建其的 重组质粒。为提高GSH产量、降低发酵成本，本发明人考虑不局限于构建啤酒酵 母的工程菌来单纯地提高其表达量，而拟另辟蹊径，选用其它与啤酒酵母不 同种属的发酵菌来进一步研究。其中，毕赤酵母(/>户o^n、)作为一种真 核表达系统现公认具有如下特性①Pp"sto&具有旺盛的生长力，可以在 廉价的非选择性培养基中快速生长，培养液的组分价廉便于工业化生产；② /^必to&偏爱有氧生长，有较宽的生长pH适应范围(3.0-8.0)，对发酵过程 中产生的乙醇具有耐受性，有较好的发酵基础，非常有利于实现高密度发酵 培养，菌体密度可高达100g干细胞/L发酵液(Roman。s M A, Scorer C A, Clare J j.Yeast，1992;8: 423-488)。上述特性，特别是特性②使得毕赤酵母具备以极低 成本生产胞内代谢产物的能力。然而野生型毕赤酵母胞内谷胱甘肽含量很 低，需进行基因工程改造，构建毕赤酵母的基因工程菌，才使其投入工业应 用成为可能。因此，本发明拟用外源性的，如来源于啤酒酵母的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSHII的基因gW/和g^//整合至毕赤酵母的基因组来构建高产 GSH的毕赤酵母基因工程菌。由于毕赤酵母没有天然的质粒，因此所有外源 基因都需要通过表达载体同源重组至其基因组才可在此宿主表达，而构建好 的外源基因也就是质粒在重组前需要用内切酶线性化。因此，为构建生产谷 胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌，首先需制备用于构建该基因工程菌的重组质 粒。在构建重组质粒时，由于像酵母这样的真核表达系统是不共用启动子和 终止子的，即各个基因需独立携带各自的启动子和终止子。因此本发明一种 用于构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母(尸./^Won's)基因工程菌的重组质粒， 其包括两组适于毕赤酵母表达系统的启动子和终止子，以及筛选标记和线性 化位点，其中该两组启动子和终止子之间分别插有外源性的谷胱甘肽合成酶 系GSH I和GSH II的基因^/z/和^/z//。所述的适于毕赤酵母表达系统的启动子现己知的包括醇氧化酶(alcohol oxidase 1， AOX1)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、过氧化物生物蛋白基因(PEX8)、 YPT1 (三磷酸鸟嘌呤酶基因)及3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子等。 其中，毕赤酵母表达系统最常用的启动子为AOX1启动子，由它控制的外源 基因在甲醇的诱导下得到高效表达。但甲醇不适用于食品工业生产，还是--种火灾隐患，在一定程度上限制了 AOX1启动子的使用。近来研究开发出的 表达载体使用其他一些不需要甲醇诱导的启动子(Cereghmo儿，Cregg羞FEMS Microbiology Rev, 2000, 24 (1):45-66.),如来源于P. pflStor/s的GAP组成型强启动子和FLD1诱导型启动子，还有YPT1启动子和编码PEX8的启动子等等。PEX8 启动子在葡萄糖培养基中控制基因以很低的水平表达，当转移到甲醇培养基 中则能适度地表达，这对于表达多亚基蛋白是非常重要的；YPT1启动子能 够使重组子在葡萄糖、甲醇、甘露醇培养基中适度地组成型表达；GAP启动子具有很强的组成型表达能力，发酵时无需更换碳源，发酵工艺更为简单，有望代替A0X1启动子，但不能调控外源基因的表达，仅适合表达对宿主无毒的蛋白；FLD1启动子与AOXl启动子相当，能利用甲醇作为惟一碳源或 某种甲基化的胺作为惟一氮源，诱导基因的强表达。由于GSH多用于食品 医药行业，故本发明优选非甲醇诱导型启动子。更佳地，鉴于谷胱甘肽及其 合成酶是宿主本身就具有的，只是含量水平较低，因此GAP启动子以其无 需更换碳源发酵工艺简单及碳源廉价而更适用于工业化发酵生产谷胱甘肽。 所述的适于毕赤酵母表达系统的终止子现研究发现仅为AOXl (醇氧化 酶终止子)。本发明所说的筛选标记包括现已知的幼We (抗Zeocin抗生素基因)、 //ZS4以及^ G4、W^O等相应基因的营养缺陷型标记。至于线性化位点，可为各个启动子，如GAP、 Arg4、 Ura3、 Adel、 Prbl、 Pep4、 Phis4启动子，以及His4 (组氨酸脱氢酶)等。由于本发明重组质粒 中有含两个谷胱甘肽合成酶基因，故需要两个启动子和终止子，如果还是用 该启动子作为线性化位点，则就会有两个线性化位点，因此，需在该质粒中 整合入不同于该启动子的的重组片段，如本发明优选GAP作为表达谷胱甘 肽合成酶基因启动子时，可引入上述其它启动子以及His4作为重组片段； 本发明优选His4片段。而本发明为操作简便，直接选用现商业化的适于毕赤酵母表达系统的穿 梭质粒作为起始哉体，如含有GAP启动子和AOX1终止子，以及以幼We 作为筛选标记的质粒pGAPZ a A为起始载体，将来源于啤酒酵母的^/2/和 ^/2//基因分别插入GAP启动子和AOXl终止子之间，并整合了重组片段 His4片段得到了重组质粒GlG2His4pGAPZA。其构建过程如图1所示，首 先将两个基因分别插入两个质粒pGAPZ a A的GAP启动子和AOXl终止子 之间，再利用同尾酶将其中一个基因连同GAP启动子和终止子的片段切下， 并连接至单酶切后与该片段互补粘端的含另一个插入基因的质粒上，鉴定两 个基因片段的启动子、基因及终止子的顺序相同后即得到所需质粒。构建过 程中所用内切酶的选择原则是每一步所选的酶都不能在被切的对象上有超过一个位点，也就是说识别位点都必须是唯一的，并且不得存在于基因内部 或者启动子、终止子上。如上所述，本发明一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(尸.基因工 程菌，其是在毕赤酵母染色体上整合了外源性的基因^/2/和^/2//的基因工程菌。较佳地，是将上述的重组质粒按常规技术整合至毕赤酵母染色体上制得的基因工程菌。更佳地，本发明选用毕赤酵母(P. GS115菌株， 导入上述重组质粒GlG2His4pGAPZA ，得到基因工程菌毕赤酵母 (尸.戸倉&) GS115/GlG2His4pGAPZA。本发明是首次将外源谷胱甘肽合成酶系GSHI和GSHII基因分别置于 启动子，如GAP启动子调控下，整合至甲醇酵母得到的高产GSH的基因工 程菌。本发明的毕赤酵母基因工程菌可进行高密度培养，高产GSH，降低了 生产GSH的成本，利于大规模工业化生产。
图l为本发明重组质粒GlG2His4pGAPZA的构建示意图。 图2为本发明重组质粒GlG2His4pGAPZA的酶切电泳鉴定图，其中1: 本发明重组质粒；2: Marker (标记)。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。 分子生物操作所用Marker、各种内切酶、DNA多聚酶、试剂盒、质粒 pMD18-T购自大连TakaRa， ￡. Co//DH5 a感受态细胞购自博大泰克，啤酒 酵母GSacc/wramj;ca cwev/^3e) y10购自上海工业微生物研究所，质粒 pA0815、 pGAPZaA、尸./7a"0〃S GS115菌株购自Invitrogen。实施例l啤酒酵母^/2/及^/2//基因的获得及保存1) 以来自NCBI GenBank数据库啤酒酵母的GSH1及GSH2基因序列 分别设计引物，两对引物中的上游引物5，端均包含Kozark序列并在其5，端 再添加Cla I酶切位点(下划线处)，下游引物5'端均添加Not I酶切位点(下 划线处)；gW/上、下游引物分别为CCATCGATACCATGGGACTCTTAGCTTTG GCGGCCGCTTAACATTTGCTTTCTAT ， ^/2//上、下游引物分别为CCATCGATACCATGGCACACTATCCA GCGGCCGCCCTAGTAAAGAATAATACTG 。2) PCR获得gW /和^/ //以啤酒酵母(&cc/wira^yces cewv!'w'ae) y 10为模板，以Taq酶扩增产物， PCR条件为①97。C 5分钟，②暂停，@94°C 30秒， 58°C 1分钟，⑤72 。C 2.5分钟，⑥重复③ ⑤共29个循环， 72°C 10min，⑧4"保持。3) PCR产物沉淀浓缩并凝胶回收获得gW /和g^// /为2056bp; -//为1496bp)。4) 凝胶回收产物的连接转化① 回收产物与pMD18T载体于16。C连接2h-4h，构建质粒pMD18T-- /及pMD18T-^/7/厶② 将上述质粒转化ECo" DH5 a ，转化产物涂布于含100 " 1/ml氨苄 抗生素的IPTG、 X-galLB琼脂平板，37。C培养12-16h;挑选白色菌落培 养于5ml含100u 1/ml氨节抗生素的LB培养基，220-25Orpm/37。C培养 12-16h，提取质粒，并ClaI、 Notl双酶切鉴定，pMD18T-取/z/可见2056bp 及pMD18T载体(2692bp)两个片段；pMD18T-gs/z//可见1496bp及 pMD18T载体(2692bp)两个片段，保存阳性菌甘油管。5) 将pMD18T-伊/j/、 口1\ )18丁-^/7//送至上海生工测序，结果表明g^/、^/2//基因序列与已公布的啤酒酵母两基因序列同源性为100%。实施例2 质粒His4-pGAPZ a A的构建1) 设计引物，以质粒pA0815为模板PCR获得含His4片段。其上游引 物从质粒BamHl位点(下划线处)开始并在5'端加上保护碱基；下游引 物5'端添加与BamHl同尾的酶切位点BglII (下划线处)，并加上保护碱基；上下游引物分别为GCGGATCCTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTA禾口 GAAGATCTTCATGACATTTCCCTTGCTACCTG 。2) 以Taq酶[TaKaRa]PCR扩增获得His4片段。PCR条件①97'C 5min， ②暂停，③94。C 30sec， 59.6°C lmin，⑤72。C 3.5min，⑥重复③ ⑤共29 个循环，⑦72。C 10min，⑧4。C保持。3) BamH I 、 Bgl II双酶切PCR产物并凝胶回收，pGAPZ a A以BamH I酶切并凝胶回收片段；4) 上述PCR双酶切产物与BamH I单酶切处理的pGAPZ a A载体以 T4连接酶[TakaRa]于16'C连接4h;5) 连接产物转化￡.Co// DH5 a并培养于含25 ]i 1/ml Zeocin 的低盐LB 琼脂平板，37°C12-16h;6) 挑取平板生长的单菌落10个于5ml含25 u g/ml Zeocin 的低盐LB， 220-25rpm/37°C 12腸16h，提取质粒，并以BamHI、 EcoRI双酶切鉴定，得到 质粒His4-pGAPZa A。正确质粒可见468bp及5595bp两条电泳条带。实施例3质粒G2P的构建1 )大量Cla I 、Not I双酶切pMD18T-g^ //，回收含//片段///Cla I Not I ;大量NspV、 Not I双酶切质粒pGAPZ a A回收大片段pGAPZ a A/NspVNot I ;2)上述酶切片段gl^///ClaINotI与pGAPZ a A/NspVNotI连接并转化 E"M)H5a (转化方法见购买的感受态细胞工作手册)，最后转化菌液涂布 于25iig/ml Zeocin 低盐LB琼脂平板，37°C 12-16h待单菌落形成，提取质粒，并Bin I单酶切鉴定，正确质粒酶切电泳图显示462bp及3846bp两条带 保存阳性菌甘油管。实施例4质粒G1HP的构建构建原理同实施例3构建质粒G2P，都是利用基因的Cla I 、 Not I双酶 切回收片段与载体质粒的NspV、 Notl双酶切大片段互补粘端连接起来。最 后阳性菌的鉴定用BglII、 EcoRl双酶切鉴定，保存阳性菌甘油管。正确质 粒酶切电泳图显示1899bp及5585bp两条带。实施例5 重组质粒GlG2His4pGAPZA的构建1) G2P用BamHl、 Bgl II双酶切并凝胶回收2.2K处的含gA//片段， 去磷酸化处理G1HP用BglII单酶切回收片段[去磷酸化处理参考TakaRa去 磷酸化试剂CIAP使用说明];2) 上述两个片段以T4连接酶于16t:连接过夜；3) 连接产物全部转化DH5 a ，最后转化菌液涂布于25|ig/ml Zeocin 低 盐LB琼脂平板，37t:i2-16h待单菌落形成；4) 挑取10个单菌落于25ng/ml Zeocin 低盐LB， 220-250rpm/37。C过 夜，提取质粒并BglII、 EcoRl双酶切鉴定(阳性菌落应在电泳结果显示 4287bp和5885bp两条带)，电泳图如图2所示。重组质粒GlG2His4pGAPZA的构建示意图如图1所示。实施例6重组质粒GlG2His4pGAPZA对毕赤酵母GS115的电转化1)制备线性化GlG2His4pGAPZA[参见《分子克隆》(第三版)]① 接种GlG2His4pGAPZA甘油管5pl于含有25pg/ml Zeocin 低盐LB 5ml中，220-250rpm/37'C培养约7h后，以1%接种量转接装有含有25pg/ml Zeocin 低盐LB 50ml的750ml三角摇瓶，220-250rpm/37。C过夜；② 8000rpm/4"C沉淀菌体，除尽培养液后沉淀重悬于GTE (GTE用量以 lOOpl/ml菌液按比例放大)并加入RNase使终浓度为40pg/ml，加入Solution II轻轻混匀后加入SolutionIII轻轻混匀(加量比例分别为GTE加量的2及1.5倍)，12000rpm/5min转移上清，以0.6倍异丙醇-2(TC沉淀0.5h ， 12000rpm/5min收集沉淀并用70%乙醇清洗沉淀一次，减压吸千液体，沉淀 复溶于lml以内灭菌去离子水，其余操作参考《分子克隆》中的质粒提取操 作步骤；③测定所提质粒浓度，按照线性化酶AccIII的说明书大量酶切质粒，取 样电泳确认完全线性化后以0.5M pH8.0 EDTA终止反应(EDTA终浓度 10mM)，以酚/氯仿抽提一次转移上清，加入0.1倍体积3M乙酸钠和2倍体 积无水乙醇-2(TC沉淀浓縮酶切产物，并用70%乙醇清洗12000rpm/5min离 心后沉淀保证除盐完全，减压吸千残留液体，沉淀复溶至灭菌去离子水使线 性化质粒浓度至少3ng 1，测定浓度并计算用量(一般一次转化需10pg线性 化质粒)，立即使用或保存于-2(TC。2) 制备感受态GS115，参考Invitrogen的pGAPZ操作手册Pichia Transforming部分，具体步骤包括①挑取GS115平板单菌落于20ml YPD培养基220-240rpm/3(TC过 夜，以1%接种量转接一级种于50ml YPD， 220-240rpm/3(TC培养至OD值为 1.2 1.5停止培养，@4°C 1500 X g/5min重悬菌体于50ml冰水，③ 4。C 1500Xg/5min重悬菌体于25ml冰水，④ 4。C 1500Xg/5min重悬菌体于2ml冰预冷1M山梨醇，⑤ 4。C 1500Xg/5min重悬菌体于100^1冰预冷1M山梨醇，当天使用。3) 线性化GlG2His4pGAPZA电转化GS115，参考Invitrogen的pGAPZ 操作手册Pichia Transforming部分及BioRad电转化仪操作手册。具体包括 下列步骤①混合8(V1感受态细胞和约10pg线性化DNA并转移至 一预冷至0 。C的0.2cm电击杯，② 冰上放置5min，③ 根据BioRad电转化仪操作手册电转化，电击参数为电压1.5kV， 电阻200Q，电容20kF，④ 电击结束后立刻加lml冰预冷1M山梨醇到电击杯并全量转移至 5ml离心管， 此管转化液静置于30°C' lh，然后加入lml YPD于30°C 200rpm/lh，⑥以每块平板IOOW涂布于100吗/mlZeocinTMYPDS，3(TC培养至单 菌落形成，3天后取出，4X:保存。实施例7高GSH基因工程菌落的筛选培养1) 挑取转化板上较大的菌落点于2mg/mlZeocinTMYPDS复筛板，30°C 培养3天至单菌落形成，4TM呆存；2) 挑取复筛板上的菌落于15ml含1% (vv/w)酵母提取粉、2% (w/w) 蛋白胨、1.34% (w/w) YNB、 2% (w/w)甘油、4Xl(y4g/L生物素、5mM 谷氨酸、5mM半胱氨酸、5mM甘氨酸的筛选培养基，230rpm/3(TC培养三天；3) 每个菌落的菌液先保存甘油管，同时各取lml菌液测定GSH含量(以 96孔板用Ellman法于405nm测定GSH含量。结果筛选到一株生产GSH的本发明基因工程菌毕赤酵母(P. pmto^) GS115/GlG2His4pGAPZA，其产GSH达400mg/L发酵液产量，而作为对照 组的P. pasto^ GS115野生菌的GSH产量为38mg/L发酵液。
权利要求
1. 一种用于构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌的重组质粒，其包括两组适于毕赤酵母表达系统的启动子和终止子，以及筛选标记和线性化位点，其中该两组启动子和终止子之间分别插有外源性的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II的基因gshI和gshII。
2、 如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的适于毕赤酵母表 达系统的启动子为非甲醇诱导型启动子。
3、 如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于所述的非甲醇诱导型启 动子为GAP启动子。
4、 如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的线性化位点为整 合入的重组片段。
5、 如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于该重组片段为His4片段。
6、 如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述外源性的基因砂W 和gsW/为来源于啤酒酵母OSacc/^raw少ces cewv^/fle)的g^/和gsW/基因。
7、 如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的适于毕赤酵母表 达系统的终止子为A0X1终止子。
8、 如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于其是如图1所示的将来 源于啤酒酵母的gs/j/和wW/基因分别插入带有抗Zeodn抗生素基因作为筛 选标记的质粒pGAPZ a A的GAP启动子和A0X1终止子之间，并整合了重 组片段His4片段的重组质粒GlG2His4pGAPZA。
9、 一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P. /^Woni)基因工程菌，其是在 毕赤酵母染色体上整合了外源性的基因g^/和gW//的基因工程菌。
10、 如权利要求9所述的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于其是将权利 要求1~9任一项所述的重组质粒整合至毕赤酵母染色体上制得的基因工程 菌。
全文摘要
本发明公开了一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌及用于构建其的重组质粒。其是将外源谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II基因分别置于启动子，如GAP启动子调控下，整合至甲醇酵母得到的高产GSH的基因工程菌。本发明的毕赤酵母基因工程菌可进行高密度培养，降低了生产GSH的成本，利于大规模工业化生产。
文档编号C12N15/81GK101225402SQ20071003648
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月16日 优先权日2007年1月16日
发明者史炳照, 费理文, 陈少欣 申请人:上海医药工业研究院