一种调控植物内源乙烯含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种调控植物内源乙烯含量的方法。首次揭示了CKI8(又称为CK1.8)负调控拟南芥乙烯合成。因此，CKI8可用于调控特定农作物中乙烯含量，从而实现植物品种改良。
【专利说明】一种调控植物内源乙烯含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体来讲，涉及一种调控植物内源乙烯含量的方法。
【背景技术】
[0002]乙烯是一种以气体状态存在的植物激素。从上个世纪来，乙烯作为一种信号分子在植物体内发挥的重要作用逐渐被人们所认识，因此被列为植物六大激素之一。乙烯在种子萌发、叶片及花的衰老、果实成熟、细胞伸长、逆境及病原反应中都起到了重要的调控作用。
[0003]暗生长下的拟南芥幼苗在较高浓度(>0.1 μ L/L)的乙烯处理下会出现组成型的三重反应，包括抑制下胚轴和根的伸长、促进下胚轴的膨胀及幼苗顶端过分弯曲。在通常情况下，植物细胞内的乙烯需要维持在一个较低的浓度来保持它的正常生长，当发生环境变化或者遭遇侵害时，植物需要快速地合成乙烯来应对这些变化，以保证自身的生长，研究乙烯合成过程中的一些调控机制有助于更好地了解植物在生长发育过程中乙烯的调控与应答过程，从而实现人工调控植物的生长和发育。张舒群等(参见Liu and Zhang, 2004;Hanet al, 2010报道)十分关注MAPK对于ACS的磷酸化调节，MAPK是真核生物中十分重要的一类蛋白激酶，在植物生长发育与抗逆反应中均具有至关重要的功能，拟南芥MPK3/6以及它们在烟草中的同工酶SIPK、WIPK均参与了植物的抗逆反应，并且影响了植物体内有乙烯合成，其中MPK3/6通过磷酸化ACS2/6等一类ACS正调控了其活性，并进而影响了抗病反应中的乙烯合成。此外乙烯合成在果实成熟中会大量释放，促进其成熟，以及叶片的脱落。乙烯在植物的叶片衰老，抗病反应，抗水涝中也起着十分重要的作用。植物衰老过程中乙烯含量会上升，从而加快此过程。番爺灰霉病菌(Botrytis cinerea)可以诱导植物的乙烯合成，从而参与此抗病反应过程中。此外，水稻中乙烯在抗水淹中起着正调控作用。
[0004]植物乙烯的合成是一个十分保守而相对简单的过程，可由其前体S-腺苷甲硫氨酸在ACC合酶(ACC synthases, ACSs)催化下，合成ACC,进一步由ACC氧化酶(ACO)氧化为乙烯气体(Ethylene)，作为一种气体激素，可以方便地应用于果实催熟等农产品保藏中；此外由于乙烯对于水稻地抗水淹过程中起着十分重要的作用，调控植物体内的乙烯含量具有十分重要的功能。
[0005]乙烯的前体是甲硫氨酸(Meth1nine),甲硫氨酸与ATP反应生成S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet),再经ACS催化后生成1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC) ;ACC在ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)的催化下与氧气反应生成乙烯(Ethylene)，CO2和HCN。甲硫氨酸是生物体内的一种必需氨基酸，通过同位素标记的方法发现在合成乙烯的过程中，甲硫氨酸的第3、4位上的碳原子最终形成乙烯，而剩下的甲硫基则通过杨氏循环不断地再循环利用。甲硫氨酸与ATP反应，由AdoMet合酶催化生成AdoMet,—种乙烯合成的中间体。AdoMet再经ACS催化生成ACC,这个过程是乙烯生物合成过程中的一个限速步骤。
[0006]乙烯的合成过程除了在植物生长发育和应对环境变化时受到调控，同时它还能够与其它一些信号通路相关联，形成一个复杂的调控网络，如乙烯与光信号的互作；生长素能够促进除ACSl外的所有ACS蛋白的表达，GA与乙烯共同调控拟南芥黄化苗顶端弯钩发育等。想要完全解开乙烯合成及其信号通路的调控过程还需要更多的研究和探索。
[0007]因此，本领域迫切需要提供一种有效而灵敏地调控植物内源乙烯含量的手段。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种调控植物内源乙烯含量的方法。
[0009]在本发明的第一方面，提供一种调控(包括:上调或下调)植物体内乙烯含量或调控植物生长性状的方法，所述方法包括:调控植物体内CKI8基因(又称为CKl.8)的表达。
[0010]在一个优选例中，所述的CKI8基因编码:
[0011](a) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；或
[0012](b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳地1_10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；
[0013](c)与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列具有70%(较佳地80% ;更佳地90% ;更佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上相同性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
[0014]在另一优选例中，所述的CKI8基因是:
[0015](I)SEQ ID NO:1所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0016](2)核苷酸序列在严格条件下能够与(I)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白能够下调植物体内乙烯含量的多核苷酸；
[0017](3)核苷酸序列与⑴限定的多核苷酸序列有80%以上(较佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上)相同性且编码的蛋白能够下调植物体内乙烯含量的多核苷酸；或
[0018](4)核苷酸序列与(1)-(3)任一限定的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸。
[0019]在另一优选例中，所述的调控植物体内乙烯含量是降低植物体内乙烯含量或使植物下胚轴增长、变细，包括:上调植物体内CKI8基因的表达。
[0020]在另一优选例中，所述上调植物体内CKI8基因的表达的方法包括:将CKI8基因转入植物中，获得乙烯含量降低的转基因植物。
[0021]在另一优选例中，所述将CKI8基因转入植物中的方法包括:(SI)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有CKI8基因；(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(SI)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物。在另一优选例中，所述方法还包括:
(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官；和(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
[0022]在另一优选例中，所述的调控植物体内乙烯含量是增加植物体内乙烯含量或使植物下胚轴变短、增粗、顶端弯钩过度张大，包括:下调植物体内CKI8基因的表达。
[0023]在另一优选例中，所述下调植物体内CKI8基因的表达的方法包括:将下调CKI8基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植物中。
[0024]在另一优选例中，所述的下调剂是特异性干扰CKI8基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是CKI8基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
[0025]在另一优选例中，所述的下调剂是失活形式的CKI8;较佳地，所述失活形式的CKI8是编码的蛋白相对于野生型CKI8编码的蛋白，第128位由D突变为N的CKI8基因突变体，或第38位由K突变为R的CKI8基因突变体。
[0026]在另一优选例中，所述的植物包括:爺科植物(包括番爺属植物，如番爺)，十字花科植物(包括鼠耳芥属植物，如拟南芥)或禾本科植物(包括稻属植物，如水稻)。
[0027]在本发明的另一方面，提供一种CKI8基因的用途，用于调控植物体内乙烯含量或调控植物生长性状；或用于制备调控植物体内乙烯含量或调控植物生长性状的材料；或用于延迟植物果实的成熟。在一个优选例中。所述的CKI8基因用于降低植物体内乙烯含量或使植物下胚轴增长、变细。
[0028]在本发明的另一方面，提供一种降低CKI8基因表达的物质的用途，用于增加植物体内乙烯含量或使植物下胚轴变短、增粗，顶端弯钩过度张大。在一个优选例中，所述的降低CKI8基因表达的物质包括:失活形式的CKI8 ;较佳地，所述失活形式的CKI8是编码的蛋白相对于野生型CKI8编码的蛋白，第128位由D突变为N的CKI8基因突变体，或第38位由K突变为R的CKI8基因突变体。
[0029]在本发明的另一方面，提供一种增加植物体内乙烯含量或使植物下胚轴变短、增粗，顶端弯钩过度张大的物质，其是CKI8基因突变体；其编码的蛋白相对于野生型CKI8编码的蛋白，第128位由D突变为N，或第38位由K突变为R。
[0030]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1、拟南芥乙烯合成过量突变体CkiS-1与野生型材料的表型，乙烯含量测定。左图显示，暗下生长90小时的黄化苗表型，WT下胚轴细长，顶端弯钩正常闭合，而ckiS-l下胚轴较短，同时顶端弯钩过度闭合至后方，呈现为组成型的乙烯三重反应。右图显示，GC/MS测定不同植株的乙烯含量表明，WT在暗下生长时产生的乙烯量较低，低于检测限，而ckiS-l乙烯量明显升高，约为etol的1/3。
[0032]图2、cki8_l中T-DNA的插入位置及验证。上图是CKI8基因模式图，显示cki8_l中T-DNA插入在第2个内含子。下图是PCR验测cki8-l是T-DNA插入在CKI8基因内部的一个突变体。
[0033]图3、cki8-l中CKI8基因的表达。半定量PCR表明，cki8_l中T-DNA插入导致CKI8基因表达缺失。
[0034]图4、p2X35S::CKI8-pHB载体示意图。通过PCR在CKI8cDNA全长两端添加BamHI与SpeI酶切位点后，连入pHB载体，作正义表达。
[0035]图5、功能互补实验T2转基因拟南芥植株的表型。暗下生长90小时的黄化苗表型，表明不论是p35S:: CKI8还是pCKL8:: CKI8均可以互补cki8_l的组成型乙烯三重反应表型。
[0036]图6、cki8_l与互补转基因拟南芥植株的下胚轴长度统计。暗下生长90小时的黄化苗下胚轴长度统计，表明不论是P35S::CKI8还是pCKL8::CKI8均可以互补cki8_l的组成型乙烯三重反应表型。
[0037]图 7、pCAMBIA1302-p35S::CKI8 载体图谱。
[0038]图 8、pCAMBIA1302-pCKL8::CKI8 载体图谱。
[0039]图9、CKI8过表达转基因拟南芥植株的表型。通过将p2X35S::CKI8-pHB(图4)转入WT背景，构建过量表达突变体，表明其表型与acs5-l (购自Arabidopsis B1logicalResource Center, ABRC, CS16567,参见 Tsuchisaka et al., Genetics, 2009 报道)，acs9_l (购自 Arabidopsis B1logical Resource Center, ABRC, SALK_129805C 参见Tsuchisaka et al., Genetics, 2009), acs5_lXacs9_l(购自 Arabidopsis B1logicalResource Center, ABRC, CS16593 ;参见 Tsuchisaka et al., Genetics, 2009 报道)等 ACS基因缺失突变体类似，暗下黄化苗的表型与WT差异不显著。这可能与WT本底乙烯含量较低有关，即黄化苗过量的影响较大，缺失效果不明显。
[0040]图10、激酶活性丧失的CKI8K38K与CKI8D128N分别过表达不能互补突变体表型。失活形式的 CKI8 进行转基因过表达[CKI8K38Kovx(cki8-l)，CKI8D128Novx (cki8_l)]。
[0041]图11、激酶活性丧失的CKISd128n过表达可以提高乙烯含量的表型。
[0042]图12WT与cki8_l背景下ACS5蛋白水平的检测
[0043]图12、本发明人通过获得ACS5-cMyc表达量一致的株系，作CHX (放线菌酮)处理抑制蛋白合成后检测ACS5-cMyc的蛋白水平变化。结果表明，在WT背景下，ACS5_cMyc被迅速降解；而在cki8-l背景下，ACS5-cMyc的降解被大大延缓。说明CKI8是ACS5的一个负调控因子。
[0044]图13、果实特异启动子驱动CKl.8过表达可以延缓番茄成熟延迟。
[0045](l)pE8-CKl.8-pHB(Ll，L2, L4, L9)，pE8-CKl.8K38E-pHB (L2, L6, L7, L8)与PE8-CK1.8D128N-pHB(L3，L9，L12，L21)转基因番茄的 PCR 验证结果。
[0046](2)人工授粉后，CKl.8在果实中特异过表达延迟果实成熟(以完全变红为成熟标准)统计结果(n=20)。
[0047](3)CKl.8在果实中特异过表达促进成熟延迟代表性示意图，每5天作人工授粉后，WT(LA1781)，pE8-CKl.8_pHB(Ll，L4，L9)，pE8_CKl.8D128N-pHB (L3, L9, L12)的成熟情况，丰不/?.— I cm ο
【具体实施方式】
[0048]本发明人经过深入的研究，发现CKI8(又称为CKl.8)负调控拟南芥乙烯合成。因此，CKI8可用于调控特定农作物中乙烯含量，从而实现植物品种改良。过表达CKI8可在植物中延迟果实成熟。
[0049]如本文所用，所述的“植物”包括但不限于:十字花科植物、禾本科植物、茄科植物、锦葵科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于:十字花科鼠耳芥属植物如拟南芥，十字花科芸苔属植物如油菜，禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米，茄科番茄属植物如番茄，锦葵科棉属植物如棉花等。
[0050] 如本文所用，“乙烯三重反应”是指乙烯对植物的生长具有抑制茎的伸长生长、促进茎或根的增粗和使茎横向生长(即使茎失去负向地性生长)的三方面效应，这是乙烯典型的生物效应。三重反应是乙烯的经典反应,作为一个指标，可以反映体内的乙烯含量或者信号强度。拟南芥中顶端弯钩过度夸张、下胚轴变短已经公认为可以反映拟南芥中乙烯含量或信号强度。几乎所有高等植物的组织都能产生微量乙烯。干旱、水涝、极端温度、化学伤害和机械损伤都能刺激植物体内乙烯增加。乙烯能够抑制生长素的合成与运输。因此，改变植物体内的乙烯含量，可以调节植物对干旱、水涝、高温、低温、不正常的盐浓度等多种逆境的抵抗作用。
[0051]如本文所用，“分离的CKI8蛋白”或“分离的CKI8多肽”是指CKI8蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CKI8蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述的CKI8多肽属于I型酪蛋白激酶。
[0052]在本发明中，“CKI8基因编码的多肽(也称为CKI8多肽(蛋白))”指具有调控(下调)植物体内乙烯含量活性的SEQ ID NO:2序列的多肽，还包括具有与CKI8蛋白相同功能的、SEQ ID N0:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1_8个、1_5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CKI8蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0053]本发明还包括CKI8蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的CKI8蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0054]任何一种CKI8蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，CKI8蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的CKI8蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长CKI8蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长CKI8蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
[0055]多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与CKI8蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗CKI8蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含CKI8蛋白或其片段的融合蛋白。
[0056] 任何与所述的CKI8蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%，98%或99%)的、且具有CKI8蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
[0057]在本发明中，“CKI8蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0058]表1
[0059]
【权利要求】
1.一种调控植物体内乙烯含量或调控植物生长性状的方法，其特征在于，所述方法包括:调控植物体内CKI8基因的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调控植物体内乙烯含量是降低植物体内乙烯含量或使植物下胚轴增长、变细，包括:上调植物体内CKI8基因的表达。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括:将CKI8基因转入植物中，获得乙烯含量降低的转基因植物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调控植物体内乙烯含量是增加植物体内乙烯含量或使植物下胚轴变短、增粗、顶端弯钩过度张大，包括:下调植物体内CKI8基因的表达。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括:将下调CKI8基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植物中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的下调剂是特异性干扰CKI8基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是CKI8基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的下调剂是失活形式的CKI8;较佳地，所述失活形式的CKI8是编码的蛋白相对于野生型CKI8编码的蛋白，第128位由D突变为N的CKI8基因突变体，或第38位由K突变为R的CKI8基因突变体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括:茄科植物，十字花科植物或禾本科植物。
9.一种CKI8基因的用途，用于调控植物体内乙烯含量或调控植物生长性状；或 用于制备调控植物体内乙烯含量或调控植物生长性状的材料；或 用于延迟植物果实的成熟。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的CKI8基因用于降低植物体内乙烯含量或使植物下胚轴增长、变细。
11.一种降低CKI8基因表达或活性的物质的用途，用于增加植物体内乙烯含量或使植物下胚轴变短、增粗，顶端弯钩过度张大。
12.—种增加植物体内乙烯含量或使植物下胚轴变短、增粗，顶端弯钩过度张大的物质，其是CKI8基因突变体；其编码的蛋白相对于野生型CKI8编码的蛋白，第128位由D突变为N，或第38位由K突变为R。
【文档编号】C12N15/84GK104073512SQ201410124337
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】薛红卫, 谭树堂 申请人:中国科学院上海生命科学研究院