一种薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG及其编码基因与应用。该薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG，是具有序列表中的SEQ?ID?NO.2所述氨基酸序列的蛋白质，其编码基因为CiAG基因SEQ?ID?NO.1的DNA序列。薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG基因可用于培育早花、矮化植物品种。CiAG为特异表达基因，其表达模式与组织以及植株的发育阶段相关。过量表达CiAG的转基因拟南芥与对照组相比，开花比野生型植株早，在四片基生叶出现时已经开花，并且植株表现出矮化的特性，说明CiAG可以控制植物的成花转变，影响植物的花期和营养生长，进而调控植物的生殖生长。
【专利说明】—种薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]薄壳山核桃童期很长，需15年左右，并且雄花发育早，雌花发育晚。另外，薄壳山核桃是雌雄同株异花植物，存在雌先型、雄先型和雌雄同型三种不同的类型，并且雄花主要着生在前一年生枝条中下部的雄花序上，而雌花曾总状花序，着生在结果枝的顶端。由此可见，薄壳山核桃雌花和雄花的发育具有独特的特点，对其花发育基因进行研究，为培育早花早实品种以及缩短童期具有重要的意义。
[0003]MADS-box是一个保守性很强的DNA结合结构域，最早在酵母Mini ChromosomeMaintenancel (MCMl)、拟南芥AGAMOUS(AG)、金鱼草DEFICIENS (DEF)和人类血清应答因子Serum ResponseFactor (SRF)中发现，因此具有此结构的功能基因被命名为MADS-box基因。MADS-box在果树缩短童期中具有重要的作用，但是该基因是否能够在果树矮化中发挥作用尚未见报道。
【发明内容】
[0004]发明目的:
[0005]本发明的目的是提供一种薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG。
[0006]本发明的另一目的是提供该转录因子CiAG的编码基因。
[0007]本发明的又一目的是提供该转录因子的应用。
[0008]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0009]本发明所提供的一种薄壳山核桃MADS-box类转录因子，命名为CiAG，来源于薄壳山核桃(Carya illinoensis (ffangench.)K.Koch)优良品种‘马罕’，氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0010]本发明所述的的薄壳山核桃MADS-box类转录因子的编码基因，其cDNA序列如SEQID N0.1所示；序列中含有684bp的最大开放阅读框，编码SEQ ID N0.2所示的227个氨基酸
残基序列。
[0011]含有本发明CiAG基因SEQ ID N0.1的表达载体。
[0012]所述的表达载体优选将所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG的编码基因插入到PCAMBIA1301载体的Kpn I和Sac I酶切位点间所得。
[0013]宿主菌是指将p CAMBIA1301-CiAG转入的根癌农杆菌EHA105.[0014]扩增CiAG cDNA全长的引物为:
[0015]VvAG-ORF sense: 5’ -ATGGGGAGGGGGAGGATAGAAA-3’
[0016]VvAG-ORF antisense:5’ -CGCCATAACAGGGCAATAACCT-3’[0017]实时荧光定量RT-PCR分析中涉及的CiAG的qPCR引物为:
[0018]VvAG - qPCR sense:5，-AGGCTGCTACTCTACGACAAC-3，，
[0019]VvAG - Qpcr antisense:5’ -GGTTCCTCTCATTCTCCGCTATC-3’。
[0020]上述薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG、其编码基因、含有编码基因的表达载体在培育早花、矮化植物中的应用。
[0021]有益效果:
[0022]本发明在薄壳山核桃中克隆到一个MADS-box类转录因子CiAG基因，CiAG可能参与薄壳山核桃花发育、果实发育等生殖发育的大部分进程。CiAG编码基因在雄花、雌花和幼果中特异性表达。转基因拟南芥 中过量表达CiAG编码基因，与对照组相比，开花期显著提前，植株矮化。这一结果说明CiAG基因可以控制植物的成华转变过程，同时可以使植株矮化。
[0023]本发明的CiAG对于培育早花、矮化植物品种特别是早花早熟矮化的薄壳山核桃具有重要意义，在作物育种方面具有广泛的应用前景。
[0024]利用本发明的植物表达载体，将CiAG基因导入植物体内，可以获得开花提前、植株矮化的转基因植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1CiAG基因在薄壳山核桃的表达特性
[0026]1，叶；2，当年生枝条；3，雌花；4，雄花；5，幼果
[0027]图2.CiAG过量表达表达载体的构建
[0028]图3.转CiAG基因拟南芥和对照组RT-PCR检测。
[0029]A:CiAG特异引物RT-PCR产物；B:18S产物；WT:野生型；1_5:转基因型
[0030]图4转CiAG基因拟南芥和对照的表型观察
[0031]WT:野生型；T:转基因株系
【具体实施方式】
[0032]下列实例中所有的方法无特别说明，均为常规方法
[0033]实施例1薄壳山核桃CiAG基因的克隆与鉴定
[0034]实验材料为薄壳山核桃品种‘马罕’，根据本实验室已经克隆得到的保守片段(莫正海等，2013，南方农业学报，44 (5) =730-734.)，设计两条特异引物，进行3’ RACE PCR0基因特异引物序列分别为，GSPl:5’-CACTACTAATCGTCAAGTCACCTTCTGT-3’ (SEQ ID N0.3) ；GSP2:5’ -CTTCTGTAAGAGGCGCAACGGCTT-3’ (SEQ ID N0.4)，与其搭配的引物为接头引物均为 AUAP:5’ -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’ (SEQ ID N0.5)。取马罕雄花，进行 RNA 的提取，参照 BioTeke通用植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)进行。取总RNAl μ g, cDNA合成采用PrimeScriptRTase (Takara)反转录酶，以带接头的 Oligo d(T)引物 AP:5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ (SEQ ID N0.6)进行反转录，获得第一链cDNA。以薄壳山核桃雄花第一链cDNA为模板，进行巢式PCR，第一轮PCR反应条件为:94°C 5min热变性；94°C 45s, 65°C 45s，72°C lmin，共35个循环；72°C延伸lOmin。将第一轮PCR溶液稀释10倍，以此作为模板，进行第二轮PCR，反应条件同第一轮。将第二轮PCR产物用胶回收试剂盒(Genscript)回收后，与pMD19-T载体(Takara, Japan)连接,然后转化大肠菌DH5 α，挑选阳性克隆,进行测序。将测序得到的片段与原来的保守片段进行比对、拼接，获得序列长度为1013bp。
[0035]为了获得其最大开放阅读框，在其两端设计基因特异引物，VvAG-ORF sense:5’ -ATGGGGAGGGGGAGGATAGAAA-3’ (SEQ ID N0.7)和 VvAG-ORF antisense:5’ -CGCCATAACAGGGCAATAACCT-3’ (SEQ ID N0.8)，以以薄壳山核桃雄花第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件为 94°C 5min 热变性；94°C 45s, 48°C 45s, 72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存，将PCR产物回收、克隆、测序，经分析后获得SEQ ID N0.1所示序列。CiAG的ORF为684bp，编码227个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0036]实施例2薄壳山核桃CiAG基因在不同器官中的表达特征
[0037]以薄壳山核桃三个品种(绍兴、波尼、马罕)为材料，利用实时荧光定量RT-PCR技术对薄壳山核桃不同组织叶片、当年生枝条、雌花、雄花、幼果中的表达情况进行了研究。各组织总RNA的提取同步骤(一)，cDNA的合成用能消除RNA中残留DNA的试剂盒，PrimeScriopt RT reagent kit with gDNA Eraser (Takara, Japan),具体步骤参照试剂盒说明书进行。内参使用山核桃actin基因(周秦.山核桃果实成熟期间基因表达的初步分析[J],临安:浙江农林大学，2010)，引物序列为 ACTIN-F:5’ -GCTGAACGGGAAATTGTC-3’ (SEQID N0.9)，ACTIN-R:5’ -AGAGATGGCTGGAAGAGG-3’ (SEQ ID N0.10)。根据 CiAG 基因序列设计表达检测引物 VvAG - qPCR sense:5’ -AGGCTGCTACTCTACGACAAC-3’ (SEQ ID N0.11)，VvAG -Qpcr antisense:5’ -GGTTCCTCTCATTCTCCGCTATC-3’ (SEQ ID N0.12)。以来自不同组织的cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR分析。
[0038]结果分析表明(图1 )，CiAG基因在三个品种中均有表达，在生殖器官(雄花、雌花、幼果)中的表达量显著高于营养器官(叶片、枝条)中的表达量，说明该基因在花发育过程起着重要的作用。
[0039]实施例3CiAG转录因子的功能鉴定
[0040]提取含有CiAG编码基因目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA1301质粒DNA，用限制性内切酶Kpn I和Sac I双酶切，切胶回收，然后用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌。提取质粒，PCR和酶切鉴定。将大肠杆菌质粒用冻融法转入农杆菌(EHA105)感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆。获得CiAG过量表达表达载体pCAMBIA1301-CiAG(图2)。将过量表达载体通过用冻融法将pCAMBIA1301_CiAG转入根癌农杆菌株EHA105 (Avsian-Kretchmer etal，2004，Plant Physiology, 135:1685-1696)中。pCAMBIA1301_CiAG 通过农杆菌株 EHA105的介导，转化拟南芥，利用抗生素筛选和PCR技术筛选阳性转基因植株。以经抗生素筛选的抗性植株总RNA为模板，以未转基因拟南芥植株总RNA为阴性对照进行RT-PCR反应(图3)，拟南芥18S作为RNA提取和cDNA合成成功的对照。将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播到栽培基质中，人工培养条件为:相对湿度80%，光照强度80-200 μ mol/M2/S，温光周期为16h光照，22°C /8h黑暗，17°C。对其表型进行分析，转基因拟南芥植株矮化(表1)，开花比野生型植株提前，在四片基生叶出现时已经开花(图4)。
[0041]表1
[0042]
【权利要求】
1.一种薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG,氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.权利要求1所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子的cDNA基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.含有权利要求2或3所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG的编码基因插入到pCAMBIA1301载体的Kpn I和Sac I酶切位点间所得。
6.含有权利要求2和3所述基因的宿主菌。
7.根据权利要求6所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌是将pCAMBIA1301-CiAG转入根癌农杆菌EHA105所得。
8.权利要求1所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG在培育早花矮化植物中的应用。
9.权利要求2或3中所述的薄壳山核桃MADS-box类转录因子CiAG的编码基因在培育早花矮化植物中的应用。
10.权利要求4或5所述的表达载体在培育早花矮化植物中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK104004076SQ201410241481
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】张计育, 莫正海, 郭忠仁, 宣继萍, 贾晓东, 黄胜男 申请人:江苏省中国科学院植物研究所