对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对普罗威登斯菌O3，O4，O8，O12，O13和O20血清型特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为SEQIDNO:1-12所示的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测普罗威登斯菌用PCR试剂盒和基因芯片。所述的普罗威登斯菌可以取样于腹泻大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本的培养物的粗提液，或是普罗威登斯菌的纯培养物的粗提液等。本发明对普罗威登斯菌O3，O4，O8，O12，O13和O20血清型特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
【专利说明】对普罗威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020特异的核苷酸 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对普罗威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020血清型特异的核苷酸，尤 其涉及对普罗威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020血清型0抗原基因簇中单个基因特异的 核苷酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 普罗威登斯菌（Providencia)是肠杆菌科中一种常见的革兰氏阴性菌，是一种机 会致病菌。主要通过院内感染或者食用海鲜感染该菌，可以引起呼吸道感染，也可引发败血 症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。分离于腹泻大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本。
[0003] 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的〇抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004] 普罗威登斯菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为普罗威登斯菌菌种与株型 鉴定的重要依据，不少新菌也因此产生。分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使 用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向，但当前的难点在于DNA靶标分子 特异性较低。细菌表面多糖抗原的多样性是由负责其合成的基因簇的遗传多样性导致的。 长期以来，人们一直试图探索存在于普罗威登斯菌中的表面多糖抗原这一重要致病因子的 多样性情况及相应的遗传进化基础。但该研究方向上总体进展非常缓慢，针对其多糖抗原 多样性和变异规律方面的认识基本还是空白，例如：人们尚不了解普罗威登斯菌中存在多 少种表面多糖抗原以及哪些表面多糖抗原对于该菌的致病性和流行性具有重要意义，负责 其表面多糖抗原合成的基因簇尚未被定位(其它单位预测的部分表面多糖抗原基因均不能 与解析的多糖抗原化学结构很好对应）等。造成上述现象的主要原因是：多糖抗原合成基 因簇组成复杂、基因功能较难预、糖合成基因鉴定困难等。此外，已进行部分相关研究的单 位大多缺乏前期研究基础。
[0005] 前期研究中，我们在深入分析细菌表面多糖抗原进化机理的基础上提出了表面抗 原基因簇中的特定基因对于其编码的表面抗原具有极高的特异性理论，并以此为基础建立 了从细菌表面抗原基因簇中筛选特异分子标识的技术。我们据此建立了当前国际上容量最 大的致病微生物特异分子标识库(包括300余种不同细菌的特异分子标识)并建立了较为完 善的细菌分子型检测系统。这些技术已被国内外包括美国农业部、美国疾病预防控制中心、 法国食品安全署、荷兰食品与消费品安全机构等几十家单位广泛应用。
[0006] 在本项目中，我们将在获得普罗威登斯菌全部表面多糖抗原基因簇序列信息的基 础上，建立普罗威登斯菌分子血清学分型系统和快速检测方法，具有重要的科学意义和较 强的应用价值。
[0007] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（ITS)序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于普罗威登斯菌的快速血清分型筛查， 稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚 酶链式反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快 速、灵敏、特异性强等优点。
[0008] 聚合酶链式反应技术（Polymerase chain reaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备 细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门 和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。不论从国内和国际的角度来看， 快速、准确地鉴定出血清类型，为普罗威登斯菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供了本发明涉及对普罗威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020 血清型特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有： 1) SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸中的至少一种； 2) 与SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种(例如，具有可以与031 血清型特异引物所扩增出序列互补配对的核苷酸序列）； 所述的SEQ ID N0:1-12如下：
【权利要求】
1. 对普罗威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020血清型特异的核苷酸，其特征在于所述 的核苷酸具有： 1. SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸中的至少一种； 2) 与SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。
2. -种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸中的至少一种。
3. 权利要求2所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30μ 1 ;10X酶特异性反 应缓冲液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐热DNA聚合酶5 μ 1 ;引物混合物10 μ 1 ;阳性对照品10 μ 1 ;阴 性对照品 1〇μ 1 ;ddH20 lml。
4. 权利要求1所述的SEQ ID NO: 1-12特异核苷酸在制备用于检测普罗威登斯菌PCR 试剂盒方面的应用。
5. 权利要求1所述的SEQ ID N0:1-12特异核苷酸在制备用于检测普罗威登斯菌的基 因芯片方面的应用。
6. 权利要求1所述的SEQ ID N0:1-12特异核苷酸在制备用于检测普罗威登斯菌微阵 列方面的应用。
7. 权利要求4-6所述的应用，其中所述的检测普罗威登斯菌指的是检测引起呼吸道感 染、败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎的细菌。
8. 权利要求4-6所述的应用，其中所述的普罗威登斯菌指的是取样于腹泻大便、尿道 感染、伤口、烧伤和菌血症标本培养物的粗提液或是普罗威登斯菌的纯培养物的粗提液。
【文档编号】C12N15/11GK104059975SQ201410281515
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】王磊, 夏香红, 冯露, 刘斌 申请人:南开大学