专利名称:具有灭活的lysR基因生成L－苏氨酸的微生物，生产其的方法以及使用所述微生物生产L ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及在其染色体中具有灭活lysR基因的微生物，生成所述微生物的方法，以及使用所述微生物来生产L-苏氨酸的方法。
背景技术：
L-苏氨酸是一种必需氨基酸，而且广泛用作饲料和食品添加剂，还作为药物和原材料用于合成某些药物。它已通过埃希氏菌(Escherichia)属、棒杆菌属(Coryneform bacteria)、沙雷氏菌属(Seratia)、和普罗威登斯菌属(Providencia)的人工突变体发酵生产。例如，日本专利公开号10037/81公开了一种使用属于埃希氏菌属的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸，并且耐受苏氨酸生物合成系统的苏氨酸反馈抑制。日本专利申请公开号224684/83公开了一种使用属于短杆菌属(Brevibacterium)的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株耐受S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和α-氨基-β-羟基戊酸，并且对L-异亮氨酸和L-赖氨酸具有营养需要。韩国专利申请公开号8022/87公开了一种使用属于埃希氏菌属的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受α-氨基-β-羟基戊酸，并且额外耐受利福平、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、和高丝氨酸中的至少一种，或者具有较低的分解L-苏氨酸的能力。日本专利申请公开号219582/90公开了一种使用属于普罗威登斯菌属的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株耐受α-氨基-β-羟基戊酸、L-乙硫氨酸、硫异亮氨酸(thiaisoleucine)、羟基硫胺、和磺胺胍，并且需要L-亮氨酸还对L-异亮氨酸具有渗漏需要(leaky requirement)。
然而，上述已知方法的缺点在于它们不能提供较高的L-苏氨酸产量或者需要昂贵的材料诸如二氨基庚二酸、异亮氨酸等。换言之，当使用需要二氨基庚二酸的菌株生产L-苏氨酸时，需要二氨基庚二酸的额外发酵，因而增加了成本。当使用需要异亮氨酸的菌株来生产L-苏氨酸时，必须向发酵培养基中添加昂贵的异亮氨酸，从而增加了成本。
为了克服这些缺点，本发明人开发了可以以比常规菌株通过发酵更高的产量生产L-苏氨酸并且对异亮氨酸具有渗漏需要的微生物，其中不需要向发酵培养基中加入异亮氨酸，并且不使用需要二氨基庚二酸的菌株，所述二氨基庚二酸的时参与赖氨酸合成的中间物。所述生产L-苏氨酸的微生物属于大肠杆菌(Escherichia coli)，对甲硫氨酸具有营养需要且对异亮氨酸具有渗漏需要，并且耐受L-甲硫氨酸类似物、L-苏氨酸类似物、L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，而且对甲硫氨酸具有营养需要和对异亮氨酸具有渗漏需要。所述生产L-苏氨酸的微生物和使用所述微生物生产L-苏氨酸的方法取得了专利权(韩国专利公开号92-8365)。
由常规lysR基因编码的LysR蛋白在细胞内赖氨酸浓度较高时抑制lysC和lysA的表达，并且在细胞内赖氨酸浓度较低时，增加lysC和lysA的表达((Beacham，I.R.，D.Hass，和E.Yagil.1977.J.Bacteriol.1291034-1044)。在大肠杆菌K-12(E.coli K-12)中，lysC编码对赖氨酸-敏感的天冬氨酸激酶III(天冬氨酸激酶III)[EC2.7.2.4]，其将天冬氨酸转化为天冬氨酰磷酸。
基于上述常规技术，本发明人已经进行了集中的研究来筛选具有高L-苏氨酸生产力的菌株，希望当lysC基因的表达增加时，通过柠檬酸三羧酸循环获得的草酰乙酸通过天冬氨酸转化成β-天冬氨酰磷酸的速率以及L-苏氨酸的产量将增加，其中所述β-天冬氨酰磷酸叫作中间物，诸如赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸等，本发明人发现L-苏氨酸的生物合成可以通过灭活lysR基因而促进，并且完成了本发明。
发明详述技术问题本发明提供可以以更高产量生产L-苏氨酸的微生物。
本发明还提供生成所述微生物的方法。
本发明还提供使用所述微生物有效率地生产L-苏氨酸的方法。
技术方案按照本发明的一方面，提供了能够生成L-苏氨酸且具有灭活tyrR基因的微生物。
在本发明中，所述微生物可以生成L-苏氨酸，并且包括具有灭活的lysR基因的原核和真核微生物。例如，可以包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒杆菌属(Corynebacterium)、和短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。优选地，所述微生物属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族，并且更优选地，属于埃希氏菌属。最优选地，所述微生物是大肠杆菌FTR7624(KCCM-10538)。
本发明中具有要被灭活的lysR基因的微生物的实例包括天然的微生物和产生L-苏氨酸的突变体。突变体的实例包括属于产生L-苏氨酸的大肠杆菌的微生物，其耐受L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，并且对甲硫氨酸具有营养需要和对异亮氨酸具有渗漏需要；以及这样的微生物，即，除了内在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和苏氨酸操纵子中的基因以外，其中至少一个拷贝的ppc基因和苏氨酸操纵子中包含的thrA、thrB以及thrC基因插入到染色体DNA中。L-甲硫氨酸类似物可以是选自由下列各项组成的组的至少一种化合物D，L-乙硫氨酸、正亮氨酸、α-甲基甲硫氨酸、和L-甲硫氨酸-D，L-sulfoxymine。L-苏氨酸类似物可以是选自由下列各项组成的组的至少一种化合物α-氨基-β-羟基戊酸和D，L-苏氨酸异羟肟酸(D，L-threonine hydroxamate)。L-赖氨酸类似物可以是选自由下列各项组成的组的至少一种化合物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-赖氨酸。所述突变体的其它实例包括参与将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转变成草酰乙酸的pckA基因被灭活的微生物，其中草酰乙酸是参与L-苏氨酸生物合成的中间物，包括抑制将草酰乙酸转变成天冬氨酸的lysC基因的tyrR基因被灭活的微生物，包括抑制参与葡萄糖流入的galP基因表达的galR基因(被灭活)的微生物，等等。
在本发明中，lysR基因编码在转录水平调控lysC基因的表达的蛋白，因而确定细胞中天冬氨酸激酶的水平。对于大肠杆菌，lysR基因是已知的，并且可以从由Blattner等(Science，277，1453-1462，1997)发表的大肠杆菌基因组序列获得(例如，登记号EG10551)。基因组序列还可以由美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)和日本DNA数据库(DNAData Bank of Japan，DDBJ)获得。按照本发明的lysR基因还包括由于遗传密码的简并性而产生的等位基因或者功能上是中性的突变体。术语“灭活”在用于本文时是指抑制活性lysR蛋白表达的作用。例如，灭活可以是通过取代、删除、插入等而诱导lysR基因的灭活，通过在lysR基因的表达调控位点的突变而诱导的灭活，以及抑制lysR基因表达的任何作用。
在本发明中要被灭活的lysR基因的实例包括，但不限于，大肠杆菌K-12的lysR(登记号EG10551)、大肠杆菌W3110的lysR(登记号EG1055 1)和大肠杆菌KCCM-10541的lysR(登记号EG10551)。
可以通过灭活能够生成L-苏氨酸的微生物染色体上存在的lysR基因来生成按照本发明的微生物。灭活方法可以包括应用光照诸如紫外线或化学品引起突变，并从突变体分离具有灭活的lysR基因的菌株。灭活方法还包括DNA重组技术。例如可以通过将与lysR基因同源的核苷酸序列或包含该核苷酸序列的载体注入微生物以引起同源重组来实现DNA重组。注入的核苷酸序列和载体可以包含显性选择标记。
本发明还提供了生成生产L-苏氨酸的微生物的方法，其包括制备灭活的lysR基因或其DNA片段；将灭活的lysR基因或其DNA片段插入能够生成L-苏氨酸的微生物以引起与微生物染色体上存在的lysR基因的重组；并且选择具有灭活的lysR基因的微生物。
“灭活的lysR基因或其DNA片段”在用于本文时是指与宿主中的lysR基因具有序列同源性但由于例如缺失、置换、剪截和倒置而不能表达活性lysR蛋白的多聚核苷酸序列。将灭活lysR基因或其DNA片段导入宿主细胞可以通过但不限于例如转化、缀合、转导、或电穿孔来实现。
当通过转化将灭活的lysR基因或其DNA片段导入宿主细胞时，灭活流程可以应用多聚核苷酸序列与菌株的培养物的混合物来进行。在这种情形中，虽然所述菌株天然能够摄取DNA并且因此可以被转化，但是优选预先使用任何合适的方法使得菌株能够摄取DNA(参见如LeBlanc等，Plasmid，28，130-145，1992；Pozzi等，J.Bacteriol.，178，6087-6090，1996)。灭活的lysR基因或其DNA片段通过将外源DNA片段导入其基因组DNA片段的，并且用灭活状态的拷贝替换序列的野生型染色体拷贝而获得。在本发明的一个实施方案中，灭活的多聚核苷酸序列包含“尾部”，其每一个在其5′和3′端的靶位点包含DNA片段。尾部由至少50个碱基对组成，优选地，为了有效重组和/或基因转换超过200-500个碱基对。为了方便，灭活的多聚核苷酸序列可以包含选择标记，例如抗生素抗性基因。在用抗生素抗性基因破坏靶点DNA的情形中，可以在含有适当抗生素的琼脂平板上选择转化体。转化后，导入宿主细胞的灭活的多聚核苷酸序列与基因组DNA尾部发生同源重组，因而将野生型基因组序列灭活。灭活重组是否发生可以容易地应用例如DNA印迹来验证，或者通过更加方便的方法聚合酶链式反应(PCR)来验证。
按照本发明的一个实施方案，生成生产L-苏氨酸的微生物的方法包括下列流程。首先，由能够生成L-苏氨酸的菌株分离基因组DNA，并使用所述基因组DNA作为模板按照常规技术进行PCR以扩增lysR基因。接着，将得到的lysR基因克隆到合适的质粒或载体中。通过转导将重组载体导入宿主细胞，诸如大肠杆菌。在培养转化体并分离细胞后，提取具有lysR基因的重组载体。然后将抗生素抗性基因片段插入提取的重组载体的lysR基因中，以形成具有灭活的lysR基因的重组载体。通过转化将这一重组载体导入宿主细胞，并培养宿主细胞。然后，从得到的转化体分离繁殖的重组载体，并通过合适的限制酶消化获得包括灭活的lysR基因的基因盒。此后，应用常规技术诸如电穿孔，将所述基因盒导入能够生成L-苏氨酸的菌株，并且选择具有抗生素抗性的微生物以分离具有灭活的lysR基因的微生物。
本领域的技术人员应该理解，按照本发明的灭活的多聚核苷酸序列可以使用常规克隆方法容易地获得。例如，可以使用靶向lysR基因的寡核苷酸引物的PCR扩增方法。
在本发明的一个实施方案中，构建了重组质粒pGemT/lysR和pGem/lysR::loxpCAT，并且从中获得了灭活的基因盒ΔlysR::loxpCAT。然后，应用电穿孔，用所述基因盒转化具有保藏号KCCM 10541(FTR 2533)的大肠杆菌菌株，所述菌株耐受L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物，具有对于甲硫氨酸的营养需要和对于异亮氨酸的渗漏需要，并且包括灭活的pckA，galR和tyrR基因。结果，野生型lysR基因得到灭活，因而生成能够比亲本菌株生成更高浓度L-苏氨酸的一种新型菌株。将新菌株命名为大肠杆菌FTR4014，而且根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2004年11月30日保藏于韩国微生物培养物保藏中心(Korean CultureCenter of Microorganisms)，保藏号为KCCM 10634。
按照本发明的大肠杆菌FTR4014衍生于保藏号为KCCM 10541的大肠杆菌，后者是衍生自保藏号为KCCM 10236的大肠杆菌的亲本菌株。大肠杆菌KCCM 10236衍生于大肠杆菌KFCC 10718(韩国专利公开号92-8365)。作为生产L-苏氨酸菌株的大肠杆菌KFCC 10718具有对于甲硫氨酸的营养需要，并且耐受苏氨酸类似物(例如α-氨基-β-羟基戊酸，AHV)、赖氨酸类似物(例如，S-(2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC)、异亮氨酸类似物(例如，α-氨基丁酸)、甲硫氨酸类似物(例如，乙硫氨酸)等。所确定的韩国专利公布以其全文结合于此作为参考。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是草酰乙酸的前体，它是L-苏氨酸生物合成途径的中间体。大肠杆菌保藏号KCCM 10236通过将ppc基因和苏氨酸操纵子(thr操纵子，thrABC)插入到原型大肠杆菌保藏号KFCC 10718的染色体中而获得，以致大肠杆菌保藏号KCCM 10236具有两个ppc基因和两个苏氨酸操纵子，其中所述ppc基因和苏氨酸操纵子从能够生产L-苏氨酸的大肠杆菌保藏号KFCC 10718的染色体获得。大肠杆菌保藏号KCCM 10236增加了催化PEP转化成参与苏氨酸生物合成的中间体草酰乙酸的ppc基因的表达，和参与由天冬氨酸合成苏氨酸的基因(thrA天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶，thrB高丝氨酸激酶，thrC苏氨酸合酶)的表达。按照本发明的大肠杆菌FTR 4014衍生自亲本菌株大肠杆菌KCCM 10541。大肠杆菌KCCM 10541，其通过将存在于大肠杆菌KCCM 10236染色体中的pckA和galR基因特异性地灭活而获得，增加了细胞内的草酰乙酸浓度和葡萄糖流入速率，因而增加了L-苏氨酸的产量并且能够进行高速度的发酵。另外，大肠杆菌KCCM 10541，其中存在于它的染色体中的tyrR基因被特异性地灭活，可以增加tyrB基因的表达和L-苏氨酸(L-threonone)的产量。
本发明还提供生产L-苏氨酸的方法，其包括培养能够生成L-苏氨酸且具有灭活的lysR基因的微生物；并且从培养物中分离L-苏氨酸。
在按照本发明的生产L-苏氨酸的方法中，微生物的培养可以在本领域常见的适宜的培养条件下在适宜的培养基中进行，而且本领域的技术人员可以根据选择的菌株类型容易地进行调整。可以用于培养的方法的实例包括，但不限于，分批操作、连续操作、补料-分批操作等。
L-苏氨酸可以应用本领域已知的普通方法从培养物中分离。可以用于本发明的分离方法的实例包括离心、过滤、离子交换层析、结晶等。例如，可以使用离子交换层析从通过将培养物低速离心并且去除生物质而获得的上层清液中分离L-苏氨酸。
有利作用按照本发明具有灭活的lysR基因的微生物可以通过微生物发酵以高产量生产L-苏氨酸。
另外，通过按照本发明的生产L-苏氨酸的方法，L-苏氨酸可以以高产量生产。
附图描述
图1描述构建重组质粒pGemT/lysR的过程；和图2描述从重组质粒pGemT:lysR::loxpCAT获得DNA片段ΔlysR::loxpCAT的过程。
最佳方式在下文中，本发明将参考下列实例进行更详细地描述。然而，提供下列实施例只是为了举例说明的目的，并不是意欲限制本发明的范围。
实施例实施例1重组质粒的构建和lysR基因的敲除在此实施例中，通过同源重组敲除了大肠杆菌染色体中的lysR基因。为了这一目的，制备了包含lyrR基因片段的载体，然后转化到大肠杆菌宿主细胞中，随后选择具有lysR基因敲除的菌株。
使用QIAGEN Genomic-tip System从野生型大肠杆菌菌株W3110提取基因组DNA。使用提取的基因组DNA作为模板，进行PCR，以获得包含lysR和lysA基因编码序列大约4kb的DNA片段。LysA基因编码序列片段通过PCR扩增，因而在随后的重组过程中提高重组的可能性。SEQID NO1和SEQ ID NO2的寡核苷酸用作引物。在PCR过程中，94℃变性30秒、60℃退火30秒、以及72℃延伸4分钟的循环重复30次。
将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。从4078bp的条带纯化DNA。将纯化的DNA与pGemT克隆载体(Promega Co.)的TA位点在16℃过夜连接过夜，以构建重组质粒pGemT/lysR(参见图1)。将由此产生的质粒构建体转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的菌株涂布在含50mg/L羧苄青霉素的固体培养基上，并于37℃培养过夜。
用铂丝接种环挑取得到的菌落，并接种在3ml含羧苄青霉素的液体LB培养基中。培养过夜后，使用QIAGEN Mini Prep Kit(QIAGEN Co.)从培养物中提取质粒DNA。将质粒DNA提取物用限制酶Hpa I消化，并且用于验证lysR基因是否得到克隆。将得到确认的质粒pGemT/lysR用限制酶Hpa I切割，并且上样到0.8％琼脂糖凝胶上以将DNA与大约7.0kb的条带分离。构建包含lox p位点的氯霉素抗性的大约1.5kb的基因片段，它是通过用Hinc II限制酶消化质粒pLoxCAT2(Palmer os，B.等，Gene 247(1-2)，255-264，2000)得到的。接着，连接质粒pGemT/lysR的HpaI片段和质粒pLoxCAT2的HincII片段，以获得重组质粒pGemTΔlysR::loxpCAT(大约7.5kb)(参见图2)。
使用质粒DNA作为模板进行PCR，以扩增大约4.6kb的DNA片段(ΔlysR::loxpCAT)，所述DNA片段包括lysR基因的ORF和loxpCAT位点。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的寡核苷酸用作引物。在PCR过程中，94℃变性30秒、60℃退火30秒、以及72℃延伸4分钟的循环重复30次。
实施例2敲除大肠杆菌KCCM 1045 1的lysR基因并且应用PCR验证lysR基因的敲除应用电穿孔，将在实施例1中构建的DNA片段ΔlysR::loxpCAT转化到生产L-苏氨酸的保藏号为KCCM 10541的大肠杆菌菌株(FTR2533)中，并且涂布到含有氯霉素的固体培养基上，以生长具有灭活的lysR基因的菌落。进行PCR以验证LysR基因是否已经特异性地重组到所筛选的候选菌株中。将亲本菌株KCCM 10541和候选菌株的每一种都在3-mL的液体培养基中培养过夜，并且使用QIAGEN基因组试剂盒20从每份培养物中分离基因组DNA。
使用每一基因组DNAs作为模板进行PCR，以扩增大约4kb或5.5kb的DNA片段，所述DNA片段包括lysR基因的ORF或者lysR基因的ORF与loxpCAT位点。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的寡核苷酸用作引物。在PCR过程中，94℃变性30秒、60℃退火30秒、以及72℃延伸4分钟的循环重复30次。当使用亲本菌株KCCM 10541的基因组DNA作为模板进行PCR时，获得4kb的DNA片段。当使用候选菌株的基因组DNA作为模板进行PCR时，获得包含loxpCAT的5.5kb的DNA片段。
通过上述过程证实，所述候选菌株包含灭活lysR的loxpCAT基因。将所述候选菌株命名为大肠杆菌FTR4014。
实施例3lysR-灭活的菌株的苏氨酸生产力将在实施例2中获得的大肠杆菌FTR4014培养在含有苏氨酸滴定培养基(threonine titer medium)的Erlenmeyer烧瓶中，所述培养基具有下述表1的组成。将FTR 4014菌株的苏氨酸生产力与亲本菌株KCCM 10541的生产力相比较。
表1苏氨酸滴定培养基
在将FTR 4014菌株在LB固体培养基上在32℃温箱中培养过夜后，然后，将一铂丝接种环的培养物接种到25mL滴定培养基中，并于32℃以250rpm培养48小时。结果在下述表2中显示。参考表2，亲本菌株KCCM 10541的苏氨酸生产力是23g/L，以及lysR基因被灭活的重组菌株FTR 4014的苏氨酸生产力是25g/L，这表明，当使用重组菌株FTR 4014时，生产力中存在大约8.6％的提高。
表2.关于重组菌株的烧瓶滴定检测结果
依据布达佩斯条约，菌株大肠杆菌FTR 4014与2004年11月30日保藏在韩国微生物培养物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM 10634。
尽管本发明已经参照本发明的示例性实施方案而进行了具体显示和描述，但是本领域的技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求
定义的本发明的精神和范围条件下，形式和细节可以进行多种变化。所述示例性实施方案应该视为只是描述意义，并没有限制目的。因此，本发明的范围不是有本发明详述所定义，而是由附上的权利要求
所定义，并且在本范围内的所有不同都将被解释为包含在本发明内。
关于保藏的微生物或其它生物物质的证明(PCT规则13bis)
仅由接收办公室使用 仅由国际机构使用
序列表<110>CJ株式会社<120>具有灭活的lysR基因生成L-苏氨酸的微生物，生产其的方法以及使用所述微生物生产L-苏氨酸的方法<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cggtcggtct ggtcgttggt g 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gtgctgtaca tccggccctt t 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3cggtcggtct ggtcgttggt g 21<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer<400>4gtgctgtaca tccggccctt t 21
权利要求
1.一种大肠杆菌(E.coli)菌株，其在染色体中具有灭活的lysR基因，并且可以生成L-苏氨酸。
2.权利要求
1的大肠杆菌菌株，其具有对于甲硫氨酸的营养需要，并且耐受L-苏氨酸类似物、L-赖氨酸类似物、L-异亮氨酸类似物和L-甲硫氨酸类似物。
3.权利要求
1的大肠杆菌菌株，其为保藏号为KCCM 10634的大肠杆菌FTR 4014。
4.生成生产L-苏氨酸的微生物的方法，所述方法包括制备灭活的lysR基因或其DNA片段；将灭活的lysR基因或其DNA片段引入能够生成L-苏氨酸的微生物中，以引起与所述微生物染色体上存在的lysR基因的重组；和选择具有灭活的lysR基因的微生物。
5.权利要求
4的方法，其中所述灭活的lysR基因或其DNA片段通过将含有抗生素标记(1oxpKAN)的盒插入到lysR基因中而制备。
6.生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括培养按照权利要求
1-3中任一项的微生物；和从培养物中分离L-苏氨酸。
专利摘要
本发明提供在其染色体中具有灭活的lysR基因并且可以生成L－苏氨酸的微生物，生成所述微生物的方法，以及使用所述方法生产L－苏氨酸的方法。所述微生物可以以高产量生产L－苏氨酸。
文档编号C12N1/20GKCN101072865SQ200580041925
公开日2007年11月14日 申请日期2005年12月6日
发明者朴英薰, 李炳春, 林相曹, 金炳勋, 金性洙 申请人:Cj株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan