一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法。该方法包括下述步骤：将胰蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可。本发明的在胰蛋白酶生产过程中去除内毒素的方法，在不影响胰蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除胰蛋白酶生产中含有的内毒素污染物，目前已经应用于胰蛋白酶原料药生产，内毒素含量符合相关要求。
【专利说明】一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法。
【背景技术】
[0002]胰蛋白酶是动物胰脏所分泌的一种重要的蛋白水解酶，能水解蛋白质和多肽，可以选择性的水解精氨酸和赖氨酸的肽链，为一肽链内切酶，对各种炎症、溃疡、脓汁、血肿、脓胸、皮肤以及消化组织细胞等疾病具有间接和直接的治疗作用。作为一种肌内注射药品，为保障其临床应用安全性，需对其内毒素含量进行控制。内毒素产生于革兰氏阴性细菌的细胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及类脂A，是热原的活性部分。它们的相对分子质量一般为I万~2.5万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达50万~100万。其具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。注入人体的注射剂中含有热原量达I μ g/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入I小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40°C以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此，在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制策略对内毒素进行去除或限量控制。
[0003]目前，水溶液中常用的内毒素去除方法主要有如下几种:
[0004]1、超滤
[0005]内毒素具有较 大的相对分子质量，因此，可选用超滤膜去除水中的内毒素。在使用超滤方法去除内毒素时需要根据被处理药物的相对分子质量、特性选择超滤膜的孔径及材质，因此该方法不具备通用性。另外，内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，因此大小不一，这也给超滤法去除内毒素带来了挑战。
[0006]2、活性炭吸附法
[0007]活性炭吸附是一种较早用于内毒素去除的方法，但是，由于活性炭选择性差，在吸附内毒素的同时吸附有效活性成分，影响产品收率。
[0008]3、化学降解法
[0009]化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，这种方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，该方法的使用需结合产品的理化性质。
[0010]4、离子交换色谱法
[0011]离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。
[0012]蛋白质种类较多，其分离纯化步骤各不相同，不同终产品对内毒素含量要求也有差异，因此，去除内毒素的方法和效果无法完全通用。胰蛋白酶作为一种活性蛋白酶类药物，其具有易失活、不稳定的特点，在内毒素去除过程中保证其本身性质及有效活性成分不受影响至关重要，这也是本领域长期以来存在的、难以克服的技术难题。在胰蛋白酶内毒素去除方法选择过程中，超滤法因胰蛋白酶分子量较大而无法应用，活性炭吸附法专一性不强，化学降解法极易造成胰蛋白酶失活，色谱法耗时较长，不利于胰蛋白酶稳定。
【发明内容】
[0013]本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中胰蛋白酶中的内毒素无法去除彻底、易造成胰蛋白酶失活、耗时较长的缺陷，而提供了一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法。本发明的方法将超滤与磷酸钙沉淀联合使用，可以有效除去内毒素，且不会影响胰蛋白酶的活性，适用于大规模条件下除去蛋白质中的内毒素。
[0014]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
[0015]本发明提供了一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法，其包括下述步骤:将胰蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节PH值为8~9,离心，即可。
[0016]其中，所述的胰蛋白酶滤饼可为本领域常规的胰蛋白酶处理方法得到的胰蛋白酶滤饼，一般经过多步盐析、结晶、过滤、活化、盐析得到，较佳地通过下述步骤得到:将胰蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸调节PH值为2~3，加入饱和硫酸铵溶液盐析，加入硼酸缓冲液调节pH值为7.5~7.7，再加入胰蛋白酶进行活化，用硫酸调节pH值为2.5~3.5，加入固体硫酸铵进行盐析，即得到胰蛋白酶滤饼。
[0017]所述的胰蛋白酶滤饼更佳地通过下述步骤制得:胰蛋白酶原料投料用5倍量(V/V)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液5000mL调pH至3.0，加入固体硫酸铵，使之达0.7饱和度，静置；将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，得滤饼，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入硫酸铵溶液18230ml，使之达
0.4饱和度，静置沉 淀；将溶液离心，3000rpm，离心20分钟，在上清液中加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵溶液，达0.7饱和度，静置沉淀；将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤,并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液,抽干,将滤饼取出，待活化；将滤饼溶于4倍量(V/ff)0.005mol/L盐酸溶液，待滤饼完全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4°C )放置I小时，I小时后加入5倍量(V/W)pH8.0,0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W) lmol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调PH至7.6，加1%结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4°C )中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右；活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至2.9，再加入固体硫酸铵，搅拌溶解，置5°C存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液中加入固体硫酸铵，使达0.7饱和度，置5°C处存放20小时；将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0,0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(4°C )，结晶外透120小时，即得胰蛋白酶滤饼。
[0018]其中，所述的水与所述的胰蛋白酶滤饼的体积质量比较佳地为8~12ml/g。
[0019]其中，所述的超滤浓缩采用的超滤膜较佳地为德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜，截留相对分子质量是5kDa或lOkDa。
[0020]其中，所述的超滤浓缩得到的浓缩液的体积较佳地为超滤浓缩前体积的0.1~
0.3 倍。
[0021]其中，所述的磷酸盐可为本领域常规的可溶于水的各种磷酸盐，较佳地为磷酸钠和/或磷酸钾。[0022]其中，所述的钙盐可为本领域常规的可溶于水的各种钙盐，较佳地为醋酸钙和/或氯化钙。
[0023]其中，所述的磷酸盐水溶液与所述的浓缩液的体积比较佳地为(0.1~0.2):1。
[0024]其中，所述的钙盐水溶液与所述的磷酸盐水溶液的体积比较佳地为(0.5~0.7):1o
[0025]其中，所述的磷酸盐水溶液的浓度较佳地为0.2~0.5mol/L。
[0026]其中，所述的钙盐水溶液的浓度较佳地为0.8~1.5mol/L。
[0027]其中，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比较佳地为1:(0.5~2)，更佳地为1:
1.5。
[0028]其中，所述的离心的转速较佳地为3000~4000rpm。
[0029]其中，所述的离心较佳地为冷冻离心10~30min，冷冻离心的温度较佳地为4~
10。。。
[0030]其中，所述的离心结束后还可进行后处理；所述的后处理包括下述步骤:透析，加入硅藻土，过滤，冻干，即得成品。所述的透析的温度较佳地为3~5°C。
[0031]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0032]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0033]本发明的积极进步效果在于:
[0034](I)本发明先通过超滤方法大大减少了胰蛋白酶操作体积，同时，使胰蛋白酶溶液中内毒素得到富集，有利于后续磷酸钙沉淀内毒素及透析、冻干，提高生产效率。
[0035](2)在磷酸钙沉淀胰蛋白酶中的内毒素技术方案中，磷酸盐与钙盐的摩尔比为1:1.5时恰好完全反应生成磷酸钙沉淀，用以吸附内毒素，后续经离心操作除去沉淀复合物。过量的磷酸盐或钙盐水溶液不利于胰蛋白酶稳定性，并且会影响后续终产品质量符合标准(如炽灼残渣)。整个磷酸钙沉淀内毒素操作工序耗时30-60分钟，极大降低了对胰蛋白酶活性的影响。
[0036](3)本发明的在胰蛋白酶生产过程中去除内毒素的方法，在不影响胰蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除胰蛋白酶生产中含有的内毒素污染物，目前已经应用于胰蛋白酶原料药生产，内毒素含量符合要求。
【具体实施方式】
[0037]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0038]实施例1
[0039]胰蛋白酶原料批号120901，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于10% ;胰蛋白酶原料投料4000g，先用5倍量(V/W)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液5000mL调pH至3.0，以助其溶解。计量溶液体积，按415g/L比例加固体硫酸铵入其中，使之达0.7饱和度，待其溶解后，静置沉淀8小时。将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，称量滤饼重量9115g，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水27345ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入硫酸铵溶液18230ml，使之达0.4饱和度，静置沉淀16小时。将溶液用离心机离心，3000rpm,离心20分钟，量取上清液体积40000ml，加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵，达
0.7饱和度，静置沉淀16小时。
[0040]将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，并在滤饼上加入15毫升饱和硫酸镁溶液，抽干，将滤饼取出，待活化。按每批3Kg量计算做活化，将滤饼溶于4倍量(V/W) 0.005mol/L盐酸溶液，待滤饼完全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4°C )放置I小时，I小时后加入5倍量(V/W)pH8.0,0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W) lmol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调PH至7.6，加1%结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4°C )中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右。
[0041]活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至2.9，再按242g/L加入固体硫酸铵14181g，搅拌溶解，置5°C存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液按205g/L加入固体硫酸铵12680g，使达0.7饱和度，置5°C处存放20小时。
[0042]将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0,0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(4°C)，结晶(外透)120小时。
[0043]取出结晶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得结晶物2440g，加纯化水24400ml溶解，过滤，收集滤液。用IOkD的超滤膜(型号:Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为3000ml。缓慢加入300ml0.4mol/L的4°C磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入180ml lmol/L 4°C醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.10，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100mL/包，5°C左右透析3天，每12小时换水一次(每12小时换水一次，水温控制在5°C左右)。
[0044]取出透析液，加入200克硅藻土，用布氏漏斗加一层澄清板、一层中速滤纸过滤，得滤液，滤液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，进冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得结晶胰蛋白酶成品121101，共计430g。
[0045]实施例2
[0046]胰蛋白酶原料批号120902，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于10% ;胰蛋白酶原料投料4500g，先用5倍量(V/W)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，以助其溶解。计量溶液体积，按415g/L比例加固体硫酸铵入其中，使之达0.7饱和度，待其溶解后，静置沉淀8小时。将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，称量滤饼重量9500g，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水28500ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入液体硫酸铵19000ml，使之达0.4饱和度，静置沉淀16小时。将溶液用离心机离心，3000rpm,离心20分钟，量取上清液体积54000ml，加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵，达0.7饱和度，静置沉淀16小时。
[0047]将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，并在滤饼上加入15毫升饱和硫酸镁溶液，抽干，将滤饼取出，待活化。按每批3Kg量计算做活化，将滤饼溶于4倍量(V/ff)0.005mol/L盐酸溶液，待完滤饼全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4°C )放置I小时，I小时后加入5倍量(V/W)pH8.0,0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W) lmol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调PH至7.6，加1%结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4°C )中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右。
[0048]活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至2.9，再按242g/L加入固体硫酸铵15004g，搅拌溶解，置5°C存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液按205g/L加入固体硫酸铵12710g，使达0.7饱和度，置5°C处存放20小时。
[0049]将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0,0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.06，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(5°C)，结晶(外透)120小时。
[0050]取出结晶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得结晶物3500g，加纯化水35000ml溶解，过滤，收集滤液。用5kD的超滤膜(型号=Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为5000ml。缓慢加入800ml0.4mol/L的4°C磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入480ml lmol/L4°C醋酸钙溶液，搅拌 ，用2.5M NaOH调节pH至8.00，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100mL/包，5°C左右透析3天，每12小时换水一次(每12小时换水一次，水温控制在5°C左右)。
[0051]取出透析液，加入200克硅藻土，用布氏漏斗加一层澄清板、一层中速滤纸过滤，得滤液，滤液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，进冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得结晶胰蛋白酶成品121102，共计500g。
[0052]实施例3
[0053]胰蛋白酶原料批号120903，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于10% ;胰蛋白酶原料投料4500g，先用5倍量(V/W)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，以助其溶解。计量溶液体积，按415g/L比例加固体硫酸铵入其中，使之达0.7饱和度，待其溶解后，静置沉淀8小时。将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，称量滤饼重量lOOOOg，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水30000ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入液体硫酸铵20000ml，使之达0.4饱和度，静置沉淀16小时。将溶液用离心机离心，3000rpm,离心20分钟，量取上清液体积53000ml，加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵，达0.7饱和度，静置沉淀16小时。
[0054]将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，并在滤饼上加入15毫升饱和硫酸镁溶液，抽干，将滤饼取出，待活化。按每批3Kg量计算做活化，将滤饼溶于4倍量(V/W) 0.005mol/L盐酸溶液，待完滤饼全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4°C )放置I小时，I小时后加入5倍量(V/W)pH8.0,0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W) lmol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调PH至7.6，加1%结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4°C )中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右。
[0055]活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至3.1，再按242g/L加入固体硫酸铵20570g，搅拌溶解，置5°C存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液按205g/L加入固体硫酸铵17835g，使达0.7饱和度，置5°C处存放20小时。[0056]将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0,0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(4°C)，结晶(外透)120小时。
[0057]取出结晶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得结晶物4300g，加纯化水43000ml溶解，过滤，收集滤液。用IOkD的超滤膜(型号:Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为6600ml。缓慢加入700ml0.4mol/L的4°C磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入420ml lmol/L4°C醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.90，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100mL/包，5°C左右透析3天，每12小时换水一次(每12小时换水一次，水温控制在5°C左右)。
[0058]取出透析液，加入200克硅藻土，用布氏漏斗加一层澄清板、一层中速滤纸过滤，得滤液，滤液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，进冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得结晶胰蛋白酶成品121103，共计520g。
[0059]实施例4
[0060]实施例1~3中的三批次胰蛋白酶内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE “细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定，检测结果如下表1所示，其中阴性对照品为注射用水，阳性对照品为内毒素标准品(购于中国食品药品检定研究院)。
[0061]表1三批胰蛋白酶成品内毒素检测结果
[0062]
【权利要求】
1.一种去除胰蛋白酶中的内毒素的方法，其包括下述步骤:将胰蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节PH值为8~9，离心，即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶滤饼通过下述步骤得到:将胰蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸调节PH值为2~3，加入饱和硫酸铵溶液盐析，加入硼酸缓冲液调节pH值为7.5~7.7，再加入胰蛋白酶进行活化，用硫酸调节pH值为2.5~3.5，加入固体硫酸铵进行盐析，即得到胰蛋白酶滤饼。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水与所述的胰蛋白酶滤饼的体积质量比为8~12ml/g ； 和/或，所述的超滤浓缩采用的超滤膜为德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜，截留相对分子质量是5kDa或IOkDa ； 和/或，所述的超滤浓缩得到的浓缩液的体积为超滤浓缩前体积的0.1~0.3倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐为磷酸钠和/或磷酸钾； 和/或，所述的钙盐为醋酸钙和/或氯化钙。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐水溶液与所述的浓缩液的体积比为(0.1~0.2):1 ； 和/或，所述的钙 盐水溶液与所述的磷酸盐水溶液的体积比为(0.5~0.7):1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐水溶液的浓度为0.2~0.5mol/L； 和/或，所述的钙盐水溶液的浓度为0.8~1.5mol/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比为1:(0.5 ~2)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比为1:1.5。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为3000~4000rpm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心为冷冻离心10~30min;所述的冷冻离心的温度较佳地为4~10°C。
【文档编号】C12N9/76GK104017792SQ201410294257
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】黄臻辉, 周建华, 周伟洁, 琚姝, 王克平, 汪雅雯, 孙源远 申请人:上海第一生化药业有限公司